豬流行性腹瀉預(yù)防及診斷研究進(jìn)展

張冰　關(guān)增春　于曉娜　劉學(xué)

摘要：豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，近幾年P(guān)ED的流行特點(diǎn)和發(fā)病情況發(fā)生很大的變化，給防治工作帶來(lái)了許多困難，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文從豬流行性腹瀉的疫苗免疫和實(shí)驗(yàn)室診斷兩個(gè)方面進(jìn)行綜述，為豬流行性腹瀉的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉；疫苗免疫；實(shí)驗(yàn)室診斷

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2014）09-0084-03

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征。各種年齡的豬均易感[1]，但對(duì)哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的危害更大，尤其是哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重。該病自1971年在英國(guó)首先報(bào)道了PEDV的發(fā)生，相繼在比利時(shí)、德國(guó)、瑞士、日本等許多國(guó)家報(bào)道了本病的發(fā)生[2]。1973年，類(lèi)豬傳染性胃腸炎的急性腹瀉首先在我國(guó)上海發(fā)生，但是直到1984年，才經(jīng)熒光抗體試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)證實(shí)該病的病原是PEDV[3]。到目前為止，我國(guó)已有24個(gè)省報(bào)道了PED的發(fā)生和流行情況[4]。PED主要發(fā)生在冬春季節(jié)，病毒主要通過(guò)感染豬的糞便而傳播，自然感染病例大多是經(jīng)口攝入而感染，糞—口途徑是該病的主要傳播途徑[5]。PEDV感染2周齡仔豬引起嘔吐、腹瀉、脫水為特征的急性腸道傳染病，死亡率高達(dá)100%，對(duì)世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)均造成極大的威脅。隨著如今集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，給該病的傳播創(chuàng)造了有利條件。疫苗免疫是豬流行性腹瀉免疫預(yù)防的主要手段，而由于該病的流行病學(xué)和臨床癥狀方面與豬傳染性胃腸炎無(wú)顯著差別，因此必須借助于實(shí)驗(yàn)室檢查方法才能確診。本文從該病疫苗預(yù)防和實(shí)驗(yàn)室診斷兩方面介紹豬流行性腹瀉的預(yù)防和診斷的研究情況。

1 PED疫苗的研究

1.1 PED組織滅活苗

PEDV的滬毒株（S株）接種3～9日齡仔豬，待典型發(fā)病后采集病豬小腸組織及內(nèi)容物，制備PED氫氧化鋁滅活苗，該疫苗經(jīng)后海穴注射，對(duì)仔豬的主動(dòng)保護(hù)率為85%，被動(dòng)保護(hù)率為97.06%。接種后2周開(kāi)始產(chǎn)生免疫力，免疫期可達(dá)6個(gè)月[6]。

1.2 PED細(xì)胞滅活苗

由于組織滅活苗存在操作繁瑣、生產(chǎn)成本高及質(zhì)量難以控制等缺點(diǎn)，因此采用在病毒培養(yǎng)液中加適量胰酶的培養(yǎng)方法，將PEDV CV777適應(yīng)于Vero細(xì)胞，以2代毒制備氫氧化鋁滅活苗，后海穴接種對(duì)仔豬的主動(dòng)免疫保護(hù)率為85.19%被動(dòng)免疫保護(hù)率為85%[7]。通過(guò)該方法制備的PED細(xì)胞滅活苗可用于現(xiàn)在PEDV的預(yù)防與控制。

滅活疫苗具有安全、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)具有需要大劑量接種或者應(yīng)用濃縮抗原；免疫期短常需強(qiáng)化接種；不能引起局部免疫，以致細(xì)胞免疫的作用弱；產(chǎn)生完全免疫力需要2周；不利于緊急預(yù)防接種與降低疫苗費(fèi)用等缺點(diǎn)。

1.3 PED弱毒苗

目前，PED的商品化弱毒疫苗主要有我國(guó)的CV777株，日本的P-5V株和韓國(guó)的KPED-9株、DR13株。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研究將適應(yīng)Vero細(xì)胞的CV777株從90代起進(jìn)行克隆純化，克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主動(dòng)免疫與被動(dòng)免疫的保護(hù)率分別達(dá)到95.92%及96.2%。穩(wěn)定性試驗(yàn)經(jīng)6代次的返祖?zhèn)鞔允欠€(wěn)定的，未見(jiàn)毒力返強(qiáng)[8]。日本的P-5V株雖然沒(méi)有連續(xù)傳代致弱的相關(guān)報(bào)道，卻在日本和韓國(guó)用于PED的預(yù)防。韓國(guó)的KPED-9是由從新生仔豬分離的KPEDV-9通過(guò)Vero細(xì)胞連續(xù)傳代93代后制備而成的；DR13是由從患病仔豬小腸內(nèi)容物分離的DR13強(qiáng)毒通過(guò)Vero細(xì)胞連續(xù)傳代而成，該疫苗是韓國(guó)用于預(yù)防PED的口服疫苗。

1.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物作為口服疫苗有可能產(chǎn)生理想的黏膜免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防病毒性腹瀉病的目的。Yang等[9]將PEDV的S基因轉(zhuǎn)入煙草中，提取轉(zhuǎn)基因植物蛋白給小鼠注射，證明其具有免疫原性。給小鼠飼喂這種轉(zhuǎn)基因植物可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫和黏膜免疫。Yang等[10]相繼應(yīng)用膿桿菌介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)入法將PEDV的S基因的主要抗原位點(diǎn)（命名為K-COE）和合成的PEDV中和抗原表位在煙草中表達(dá)。這些研究為研制PEDV口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了新的思路。目前，在以煙草花葉病毒為載體的無(wú)煙堿煙草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表達(dá)，用表達(dá)蛋白免疫接種后，對(duì)仔豬具有良好的保護(hù)作用，為PEDV轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。植物的多種優(yōu)越性均可被用于研究轉(zhuǎn)基因疫苗，并且已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。但仍有一些障礙必須克服，如蛋白在植物中的表達(dá)水平低、表達(dá)產(chǎn)物在植物中的穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)基因口服疫苗在產(chǎn)生免疫反應(yīng)之前在胃腸道內(nèi)有時(shí)被消化等[11]，科學(xué)家就這些問(wèn)題進(jìn)行了研究并正在加以解決。

1.5 多價(jià)聯(lián)合疫苗

1.5.1 TGEV與PEDV二聯(lián)疫苗 目前，在我國(guó)用于PED預(yù)防和控制的疫苗主要是PED-TGE二聯(lián)苗。由于PEDV和TGEV均屬于冠狀病毒，而且致病機(jī)理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯(lián)苗亦是可行的。二聯(lián)疫苗的特點(diǎn)是：毒價(jià)高，后海穴接種，增強(qiáng)了免疫保護(hù)力，一次接種即可，省時(shí)、省力，且保護(hù)率高。

1.5.2 EDV、TGEV、RV三聯(lián)滅活苗 上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所錢(qián)永清等[12]采用豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（RV）細(xì)胞培養(yǎng)物制備了三聯(lián)滅活疫苗。實(shí)驗(yàn)室免疫結(jié)果表明，妊娠母豬和育肥豬免疫后15 d達(dá)到較高的免疫水平，免疫有效期超過(guò)6個(gè)月，妊娠母豬所產(chǎn)仔豬可獲得高水平的被動(dòng)免疫保護(hù)。試驗(yàn)場(chǎng)應(yīng)用結(jié)果表明，母豬保護(hù)率達(dá)98%，仔豬被動(dòng)免疫保護(hù)率達(dá)93%。

1.6 展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，20世紀(jì)90年代初基因疫苗得到了發(fā)展。與傳統(tǒng)的弱毒或滅活疫苗相比，DNA疫苗具有不散毒、不返強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。此外乳酸桿菌作為微生態(tài)制劑中的主要益生菌，廣泛應(yīng)用于食品、飼料加工業(yè)。構(gòu)建乳酸桿菌質(zhì)粒載體，表達(dá)在黏膜系統(tǒng)中增殖的病原微生物的保護(hù)性抗原基因，制備綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態(tài)制劑疫苗應(yīng)用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途徑。因此未來(lái)基因疫苗和微生態(tài)制劑對(duì)豬流行性腹瀉的預(yù)防上有著很好的發(fā)展前景。

2 PED的實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病毒的分離鑒定

有研究表明，用含有60 μg/mL胰酶液的細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行PEDV傳代適應(yīng)，在第3代就出現(xiàn)明顯的CPE，第5代毒價(jià)可達(dá)10～7.0/0.1 mL，并通過(guò)乳豬回歸試驗(yàn)和特異性中和試驗(yàn)證實(shí)所增殖的病毒為豬流行性腹瀉病毒[13]。這些病毒分離鑒定的方法對(duì)PED血清學(xué)、病原學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究提供了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)，但由于病毒的分離鑒定需要有一套成熟的細(xì)胞培養(yǎng)體系，而且PEDV需要在細(xì)胞系中連續(xù)傳代才能出現(xiàn)明顯的CPE，目前尚無(wú)法推廣應(yīng)用。

2.2 微量血清中和試驗(yàn)

林志雄等[14]利用已適應(yīng)于傳代細(xì)胞生長(zhǎng)的豬流行性腹瀉病毒PEDV-G1株，以PK-15作指示細(xì)胞，與被檢血清進(jìn)行微量中和，測(cè)定待檢血清中的特異性抗體，48 h進(jìn)行結(jié)果判定，證實(shí)該方法可以用來(lái)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，具有較高的敏感性，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，并建立了PED微量血清中和試驗(yàn)。但該方法需要標(biāo)準(zhǔn)毒株作為指示毒株和成熟的細(xì)胞培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)條件的限制因素比較多，很難在短期內(nèi)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

2.3 免疫電鏡法（IEM）

該方法簡(jiǎn)便、直觀、快速、定性準(zhǔn)確，但該方法要求有價(jià)格高昂的電鏡設(shè)備，而且電鏡檢查一般需3～7 d才能出報(bào)告，不適用于大規(guī)模臨床診斷[15]。

2.4 免疫熒光法

試驗(yàn)研究證明，用直接免疫熒光法（FAT）檢查病料中的豬流行性腹瀉抗原是可靠的特異性診斷方法，目前應(yīng)用最為廣泛。崔現(xiàn)蘭等對(duì)免疫熒光法用于豬流行性腹瀉的診斷進(jìn)行了大量的探索，結(jié)果表明：FAT的檢出率為91.4%，間接免疫熒光法（IFAT）的檢出率為89%，而且比電鏡更敏感、更可靠。由于該方法需要在病死豬只或在腹瀉早期撲殺后取腸道組織制備切片，故很難用于臨床診斷。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA試驗(yàn)可直接應(yīng)用于糞便中PEDV的檢測(cè)，而且比電鏡更敏感可靠，應(yīng)用較為廣泛。韓國(guó)學(xué)者Kim O等建立了可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準(zhǔn)確而特異的檢出PEDV的單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫組化法，該方法也可用于鑒別診斷PEDV與TGEV。但該方法對(duì)病料的前期處理比較繁瑣。

2.6 反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)于PEDV和TGEV核酸的檢測(cè)方法越來(lái)越受到人們的重視。有研究表明，RT-PCR法是目前鑒別診斷TGEV和PEDV最敏感、特異的方法。傳統(tǒng)方法診斷主要從病毒的分離與鑒定、抗原檢測(cè)、電鏡檢測(cè)、血清學(xué)診斷等方面進(jìn)行。與傳統(tǒng)方法比較，RT-PCR方法只需要病豬的糞便即可進(jìn)行活體診斷，便于疾病的早期診斷，敏感性和特異性高，而且操作步驟更加快速、方便，一般4～6 h內(nèi)可以提供準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.7 展望

傳統(tǒng)的PEDV診斷方法最常用的是病毒分離，但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，往往使防治錯(cuò)過(guò)了最佳時(shí)機(jī)。近年來(lái)發(fā)展的PCR技術(shù)有效地解決了這些不足，但是普通RT-PCR在定量研究上仍不能盡如人意。SYBR GreenⅠ熒光染料定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)管中加入熒光染料，這種染料可嵌入雙鏈DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激發(fā)產(chǎn)生熒光。隨著擴(kuò)增反應(yīng)的延伸，熒光信號(hào)會(huì)因?yàn)镈NA產(chǎn)物的增加而增加，因此SYBR GreenⅠ熒光信號(hào)的積累與擴(kuò)增出的雙鏈DNA的數(shù)量成正相關(guān)。該方法具有操作簡(jiǎn)便，敏感性高，重復(fù)性好，污染少，用時(shí)短和可自動(dòng)定量分析等優(yōu)點(diǎn)，已成為病原檢測(cè)的重要方法。該方法也為建立區(qū)分PEDV強(qiáng)弱毒的熒光定量PCR方法、鑒別診斷PEDV與TGEV的熒光定量PCR方法及多重復(fù)合熒光定量PCR方法奠定了重要基礎(chǔ)。

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