肺炎支原體實(shí)驗(yàn)室診斷的研究進(jìn)展

郭昱瑄 張盛玉 王熙業(yè)

摘要：肺炎支原體（MP）是一種常見的呼吸系統(tǒng)感染病原體，約占兒童社區(qū)獲得性肺炎病例的40%。MP不僅引起肺部病變，也能侵犯心、腦、肝、腎等其他器官，引起多種肺外表現(xiàn)。然而MP感染臨床表現(xiàn)不具有特征性，臨床上亦缺乏早期有效的診斷方法，容易和其他病毒、細(xì)菌所致的呼吸道感染相混淆。目前MP的實(shí)驗(yàn)室診斷方法不斷推陳出新，但各種方法均有其優(yōu)勢(shì)與不足，本文對(duì)此作一簡(jiǎn)要綜述。

關(guān)鍵詞：肺炎支原體;實(shí)驗(yàn)室診斷;血清學(xué)診斷;基因?qū)W診斷

中圖分類號(hào)：R725.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.008

文章編號(hào)：1006-1959（2019）11-0026-03

Abstract：Mycoplasma pneumoniae （MP） is a common respiratory infection， accounting for approximately 40% of cases of childhood community acquired pneumonia. MP not only causes lung lesions， but also invades other organs such as heart， brain， liver， kidney， etc.， causing a variety of extrapulmonary manifestations. However， the clinical manifestations of MP infection are not characteristic， and there is a lack of early and effective diagnostic methods in clinical practice， which is easily confused with respiratory infections caused by other viruses and bacteria. At present， the laboratory diagnostic methods of MP are constantly being updated， but each method has its advantages and disadvantages. This paper gives a brief overview.

Key words：Mycoplasma pneumoniae;Laboratory diagnosis;Serological diagnosis;Genetic diagnosis

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是一種常見的呼吸系統(tǒng)感染病原體，是社區(qū)獲得性肺炎最主要的病原體之一，可通過飛沫或直接接觸感染，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中有40%由MP引起，在成人獲得性肺炎中10.60%～25.82%由MP引起，在臥床患者中，其感染率更高，可達(dá)到29.4%。其可引起上呼吸道感染、支氣管炎、肺炎，也可引起嚴(yán)重的肺外并發(fā)癥[1]。近年來MP肺炎發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)，且難治性或重癥MP肺炎病例增多，給兒童、老人等免疫低下人群的健康帶來巨大威脅。MP感染臨床表現(xiàn)不具有特異性，易和其他病毒、細(xì)菌所致的呼吸道感染相混淆。由于MP缺乏細(xì)胞壁，使其對(duì)影響細(xì)胞壁合成的抗生素具有耐藥性，頭孢及青霉素類抗生素治療無(wú)效，因此應(yīng)選擇抑制或影響蛋白質(zhì)和核酸合成的藥物來治療，如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、喹諾酮類。目前大環(huán)內(nèi)酯類是首選藥物，喹諾酮類和四環(huán)素類不推薦用于兒童和孕婦臨床治療。隨著首選藥物廣泛應(yīng)用，耐藥現(xiàn)象也日益嚴(yán)重[2]。因此，早期確診MP感染，及時(shí)、正確用藥，減少并預(yù)防耐藥性，具有重要的意義?，F(xiàn)對(duì)MP的主要實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述如下。

1分離培養(yǎng)

MP分離培養(yǎng)包括液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法。液體培養(yǎng)法利用MP代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)液中指示劑顏色發(fā)生改變（由紅變黃為陽(yáng)性）而鑒定;固體培養(yǎng)法根據(jù)顯微鏡下菌落形態(tài)呈煎蛋樣進(jìn)行鑒別[3]。傳統(tǒng)液固二步培養(yǎng)法曾是WHO推薦的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但MP自身無(wú)法合成甾醇，培養(yǎng)成本高，生長(zhǎng)極緩慢，約2～4周，很難在臨床推廣。目前臨床上使用的快速液體培養(yǎng)法雖能在24～48 h完成診斷[4]，但培養(yǎng)基中加入的青霉素和醋酸鉈等物質(zhì)無(wú)法抑制真菌和其他雜菌的生長(zhǎng)，易產(chǎn)生假陽(yáng)性。She RC等[5]對(duì)分離培養(yǎng)在MP感染的臨床診斷意義進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示與血清學(xué)和基因?qū)W檢測(cè)相比，分離培養(yǎng)法的靈敏度更低且耗時(shí)長(zhǎng)，故此法不適于此類病原體的診斷。

2血清學(xué)檢測(cè)

雙份血清學(xué)抗體滴度升高4倍以上是診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但收樣困難、耗時(shí)，不利于臨床醫(yī)生及時(shí)制定治療方案。MP包括抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)，其中抗原檢測(cè)靈敏度低，易與呼吸道其他病原體出現(xiàn)交叉反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限。MP侵入機(jī)體后，可引起免疫應(yīng)答產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，IgM和IgG抗體一般分別在感染的1周和2周后開始出現(xiàn)，IgA抗體出現(xiàn)雖更早于IgM，但其靈敏度太低[1]。IgM在感染3～4周達(dá)到峰值，可做為急性期感染的診斷指標(biāo);IgG出現(xiàn)較晚，但持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，一般用于判斷既往MP感染。IgM和IgG抗體同時(shí)檢測(cè)，有利于提高診斷率[6]。以下為幾種臨床常用的血清學(xué)檢測(cè)方法。

2.1補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFA）? 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在10余年前是檢測(cè)MP感染最常用的方法。MP感染后，MP抗原糖脂成分刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體?？乖贵w復(fù)合物和補(bǔ)體結(jié)合，在指示系統(tǒng)中能引起溶血;若血清中不含抗體，則補(bǔ)體不被結(jié)合，不發(fā)生溶血現(xiàn)象。但由于糖脂抗原并非MP的特異性抗原，與細(xì)菌、某些植物及人體組織可能有交叉反應(yīng)，目前臨床不常用。

2.2血清冷凝集試驗(yàn)（CAT）? MP感染后，機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，會(huì)產(chǎn)生一種非特異性IgM 冷凝集素。其在4℃下可使人的O型紅細(xì)胞或自身紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，而37℃溫浴后凝集現(xiàn)象消失。當(dāng)?shù)味取?4時(shí)，對(duì)MP感染有參考價(jià)值。該方法操作簡(jiǎn)單，但特異性較差，流感病毒感染、腺病毒感染、腫瘤等疾病也會(huì)導(dǎo)致CAT結(jié)果呈陽(yáng)性，甚至抗生素的使用都會(huì)影響到CAT的結(jié)果[7]。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）? ELISA發(fā)明于1980年，常聯(lián)合檢測(cè)MP-IgM和MP-IgG以提高ELISA診斷率。原理是采用MP抗原包被于載體表面，捕獲血清中的相應(yīng)抗體形成免疫復(fù)合物，再與酶標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，借助酶的降解作用顯示的顏色變化作出診斷[8]。該法僅需幾個(gè)小時(shí)，且與其他常見的呼吸道病原體無(wú)交叉反應(yīng)，目前已有多個(gè)品牌的ELISA 試劑盒在售。其缺點(diǎn)是需用雙份不同時(shí)期的血清樣本對(duì)患者確診，且為多反應(yīng)、多試劑、多步驟的檢測(cè)方法，其中被板溫育時(shí)間和溫箱的溫度、洗板次數(shù)、酶標(biāo)儀的性能以及操作人員的熟練程度等多種因素均可影響檢測(cè)的結(jié)果，易產(chǎn)生假陽(yáng)性。

2.4膠體金免疫層析法（CGIA）? 基于雙抗夾心法，待測(cè)樣本中的MP抗體先后與膠體金標(biāo)記的抗原和層析膜上固定的捕獲抗原結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性及膠體金的示蹤放大效應(yīng)，對(duì)MP抗體實(shí)現(xiàn)目視化檢測(cè)[9];若層析膜上檢測(cè)帶區(qū)出現(xiàn)紅色變色反應(yīng)，結(jié)果為“陽(yáng)性”[10]。該方法的結(jié)果只報(bào)告陰性或陽(yáng)性，不能報(bào)告滴度。無(wú)需特殊設(shè)備，5～10 min得到結(jié)果，適宜在一般基層醫(yī)院應(yīng)用。由于其集合了免疫反應(yīng)和色譜層析的優(yōu)勢(shì)，溶血、脂血、黃疽對(duì)結(jié)果均無(wú)影響，但特異性靈敏度不高，易造成漏診[11]。

2.5顆粒凝集法（PA）? 該法采用表面吸附MP抗原的明膠顆粒代替動(dòng)物紅細(xì)胞做載體，致敏明膠顆粒與血清中的MP 抗體發(fā)生凝集反應(yīng)。目前應(yīng)用的PA試驗(yàn)主要是利用乳膠和凝膠作為攜帶顆粒與試驗(yàn)血清進(jìn)行孵育。如果血清中含有MP特異抗體，顆粒附著，產(chǎn)生可見反應(yīng)。該法可顯著消除血清冷凝集試驗(yàn)中動(dòng)物紅細(xì)胞的非特異性反應(yīng)，凝集圖像清晰[12]。PA試驗(yàn)應(yīng)用混合MP抗原同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM。國(guó)內(nèi)MP的檢測(cè)主要采用進(jìn)口試劑，如日本的PA（東京富士株式會(huì)社） 和美國(guó)EIA（GenBio公司）的MP抗體檢測(cè)試劑盒，便是基于此法設(shè)計(jì)，3 h可出診斷結(jié)果，但這些試劑價(jià)格昂貴且存在抗原特異性問題。

3基因?qū)W檢測(cè)

雖然MP血清學(xué)檢測(cè)簡(jiǎn)便快捷，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。但這種方法僅對(duì)既往感染能提供較好的檢測(cè)指標(biāo)，而對(duì)現(xiàn)癥感染考核的應(yīng)用價(jià)值較低。臨床上推薦將血清學(xué)檢測(cè)和基因?qū)W檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行以提高診斷準(zhǔn)確度[13，14]。目前MP基因?qū)W檢測(cè)的目標(biāo)基因主要有三種：MP編碼P1黏附蛋白基因、16S rRNA 和延伸因子Tu基因設(shè)計(jì)。

3.1核酸雜交技術(shù)? 該技術(shù)根據(jù)兩條互補(bǔ)的核酸單鏈可雜交結(jié)合成雙鏈的原理，針對(duì)MP目標(biāo)基因設(shè)計(jì)用放射性核素或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記的核苷酸片段，通過雜交，可探知受檢標(biāo)本中有無(wú)與之互補(bǔ)的MP目的基因。美國(guó)GenProb公司的Gen-Prob rapid diagostic system診斷試劑，利用125I標(biāo)記的cDNA探針，與MP特異的rRNA雜交，2 h內(nèi)可完成檢測(cè)。該方法與其他支原體DNA無(wú)交叉反應(yīng)，但敏感性差，但采用放射性核素標(biāo)記，不便于臨床推廣。

3.2聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)? PCR技術(shù)是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增技術(shù)，上世紀(jì)80年代開始被用于檢測(cè)各種臨床標(biāo)本中的MP。該法具有靈敏度高和快捷等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)標(biāo)本中的MP不需要是活體，不受患者免疫功能、病程、感染程度和用藥情況的影響[15]，可早期診斷MP感染。依靠核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)肺炎支原體進(jìn)行篩查已經(jīng)在各國(guó)廣泛開展。PCR技術(shù)檢測(cè)病原體的核酸， 不存在交叉反應(yīng)和放射性污染，大大提高了檢測(cè)的效率和靈敏性， 在臨床上的應(yīng)用已十分廣泛。常用的PCR 法主要有常規(guī)PCR 法、巢式PCR[16]和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）[17]法等。而目前已報(bào)道的眾多PCR方法中，絕大多數(shù)需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、濃縮，這是一個(gè)即費(fèi)時(shí)又費(fèi)力的工作，很難滿足未來對(duì)自動(dòng)化的要求。此外核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)過程中產(chǎn)生的假陽(yáng)性污染也一直困擾著眾多研發(fā)人員。qPCR作為其中的代表，巧妙利用了PCR技術(shù)擴(kuò)增的高效性，探針技術(shù)高特異性和光譜技術(shù)的敏感性及定量分析的優(yōu)點(diǎn)，在完全閉管狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，克服了普通PCR易污染不能定量靈敏度不高等不足，目前已有多種基于此技術(shù)的MP試劑盒應(yīng)用于臨床[1]，其檢測(cè)時(shí)間更短，敏感性更高，不再需凝膠電泳分析檢測(cè)結(jié)果[18]。但是也因其敏感性高，易使得MP定植時(shí)被誤診為感染。且存在熒光探針、儀器價(jià)格昂貴等問題[19]。

3.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）? LAMP技術(shù)是一種新的核酸擴(kuò)增方法，針對(duì)MP靶基因上的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在65℃左右恒溫條件下對(duì)靶序列進(jìn)行高效、高特異性的擴(kuò)增，可在15～60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增，反應(yīng)能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物（焦磷酸鎂白色沉淀），可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無(wú)來判斷MP靶基因是否存在[20]。不需進(jìn)行模板熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等過程。LAMP方法最大優(yōu)勢(shì)就是高靈敏度外，操作簡(jiǎn)單，恒溫裝置就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，適合現(xiàn)場(chǎng)、基層快速檢測(cè)的方法[15]。但由于LAMP 擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長(zhǎng)度最好在300 bp內(nèi)，大于500 bp則較難擴(kuò)增，故不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA 擴(kuò)增，檢測(cè)對(duì)引物設(shè)計(jì)要求高。

4總結(jié)及展望

目前全球醫(yī)療決策中有2/3是基于診斷信息作出的，而診斷支出僅占醫(yī)療總支出的1%，診斷技術(shù)的進(jìn)一步提高對(duì)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有積極意義?；贛P檢測(cè)的龐大臨床需求，特別是在“精準(zhǔn)化醫(yī)療”被提到國(guó)家戰(zhàn)略發(fā)展高度的社會(huì)大背景下，針對(duì)MP感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法也在不斷更新發(fā)展，目前的MP檢測(cè)方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，尚且無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。MP檢測(cè)的方法主要有分離培養(yǎng)、血清學(xué)抗體檢測(cè)和PCR診斷。MP分離培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，且培養(yǎng)條件苛刻，靈敏度不高，用于臨床診斷意義不大;目前臨床有兩類常用方法，一類是血清肺炎支原體抗體IgM（MP-IgM）檢測(cè)，一類是肺炎支原體核酸（MP-DNA）檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)簡(jiǎn)便快捷，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。但這種方法僅對(duì)既往感染能提供較好的檢測(cè)指標(biāo)，而對(duì)現(xiàn)癥感染考核的應(yīng)用價(jià)值較低。MP-DNA檢測(cè)則可以彌補(bǔ)血清MP-IgM檢測(cè)的不足，對(duì)于MP-DNA檢測(cè)，檢測(cè)標(biāo)本中的MP不需要是活體，不受患者免疫功能、病程、感染程度和用藥情況的影響，可以更早期地檢測(cè)到MP的感染，有利于MP的早期診斷和抗生素的正確選擇。目前，臨床推薦在PCR法和血清學(xué)檢測(cè)中各選擇一種方法進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，盡快準(zhǔn)確完成MP肺炎的診斷，以便及時(shí)、正確用藥，減少并預(yù)防耐藥性。

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收稿日期：2019-3-4;修回日期：2019-3-14

編輯/肖婷婷