DMBA衍生/超高效液相色譜法測定魚肉中唾液酸含量

李佩佩，嚴(yán)忠雍，陳 蔭，何鵬飛，黃麗英，方 益

（1．浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2．浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021；3．浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316021）

唾液酸（SAs）是一類酸性氨基糖，為神經(jīng)氨酸的N-或O-取代衍生物。其主體結(jié)構(gòu)是由9個碳原子和氧原子構(gòu)成的帶1個環(huán)外側(cè)鏈的六元環(huán)，在C1處有1個羧基，C4、C7、C8、C9處各有1個羥基［1］。唾液酸種類多樣，自然界中已發(fā)現(xiàn)80余種［2］，一般根據(jù)C5取代基團(tuán)的不同（N-乙?；?、N-羥乙?；土u基）將唾液酸分成3種核心結(jié)構(gòu)：N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）和酮基-脫氧壬酮糖酸（KDN）。其他唾液酸均為上述3種結(jié)構(gòu)的乙酰化、甲基化、巰基化或酯化等的衍生物［3-4］。3種核心結(jié)構(gòu)的唾液酸如圖1所示。

圖1 唾液酸的3種基本結(jié)構(gòu)形式Fig．1 Structures of the three basic forms of sialic acid

作為生物糖家族中的一大類，唾液酸主要以結(jié)合態(tài)廣泛存在于各類生物組織及少量微生物中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分［5-6］。發(fā)生在C4、C7、C8、C9位點(diǎn)上乙?；?、磺酸基、乳酰基、磷酸基等活性基團(tuán)的取代使得唾液酸具有豐富多樣的結(jié)構(gòu)和復(fù)雜重要的生理功能：參與細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞粘附與分化、細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)以及免疫應(yīng)答等過程［7-8］；作為一種天然的大腦營養(yǎng)素，促進(jìn)人體神經(jīng)系統(tǒng)成長發(fā)育，促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育和提高記憶力［9］；調(diào)節(jié)大量生理病理過程，在抗炎、抗病毒、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用［10-13］。由于唾液酸多糖本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜且性質(zhì)不穩(wěn)定，通常樣本量很小，因此對分析方法的要求很高，研究唾液酸和唾液酸多糖時，需要建立高效適用的檢測方法。目前應(yīng)用最廣泛的檢測方法為色譜法［14-15］。唾液酸主要以結(jié)合態(tài)形式存在，一般需先通過水解將其從糖鏈的末端釋放出來，再采用化學(xué)衍生手段獲得穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

目前唾液酸的檢測對象涉及燕窩［16-17］、乳及乳制品［18-19］、牛奶［20］、血漿［21-22］、畜禽動物組織［23-24］等，對魚肉基質(zhì)研究較少。研究表明豬、牛、羊肉等紅肉中含有Neu5Ac和Neu5Gc，而魚肉、雞肉等白肉中僅含有Neu5Ac［25］。Neu5Gc屬于外源性唾液酸，進(jìn)入人體后會刺激炎癥的發(fā)生，增大患癌風(fēng)險［26］。因此，目前很多研究更重視紅肉中Neu5Gc的解離，對居民日常消費(fèi)量同樣很高的魚肉研究相對較少；在含量測定方面多集中于對Neu5Ac和Neu5Gc的測定，缺乏對KDN的測定；檢測一般采用普通的高效液相色譜儀，出峰時間長。為了解不同品種魚肉中的唾液酸含量，本文采用超高效液相色譜建立了水產(chǎn)品中常見唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc以及含量較低的KDN的檢測方法，前處理中采用4，5-二甲基-1，2-苯二胺（DMBA）衍生法代替4，5-亞甲二氧基-1，2-鄰苯二胺鹽（DMB）衍生反應(yīng)，并應(yīng)用建立的方法測定了不同品種魚肉中的唾液酸含量，有助于了解膳食中唾液酸的攝入比例以及對人體健康的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AcquityTMUltra Performance超高效液相色譜儀（配備熒光檢測器，美國Waters公司）；MS2漩渦混合器（德國IK公司）；Avanti JXN-30智能型低溫超高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；Centrivap?真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）；ZD-85A氣浴恒溫振蕩器（常州市國旺儀器制造有限公司）；Milli-Q Gradient超純水凈化器（美國Millipore公司）；N-EVAP112氮吹儀（美國Organomation公司）。

N-乙酰神經(jīng)氨酸（CAS號：131-48-6，純度大于95%），N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（CAS號：1113-83-3，純度大于95%），酮基-脫氧壬酮糖酸（CAS號：153666-19-4，純度大于98%）均購自Sigma公司。

4，5-亞甲二氧基-1，2-鄰苯二胺鹽、4，5-二甲基-1，2-苯二胺，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；鹽酸、乙酸、氫氧化鈉、連二亞硫酸鈉均為分析純，β-巰基乙醇為生化試劑，均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）購自德國Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備超純水（電阻率≥18．2 MΩ·cm）。

Neu5Ac、Neu5Gc和KDN標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取3種標(biāo)準(zhǔn)品各10．00 mg，分別用水溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度均為1．00 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

DMB衍生溶液的配制：準(zhǔn)確稱取29．3 mg DMB、24．4 mg連二亞硫酸鈉，加入528 μLβ-巰基乙醇、859 μL乙酸，用水溶解并稀釋定容至10 mL。所得衍生溶液中各組分濃度為：13 mmol/L DMB、1．5 mol/L乙酸、14 mmol/L連二亞硫酸鈉、0．75 mol/Lβ-巰基乙醇。

DMBA衍生溶液的配制：準(zhǔn)確稱取67．6 mg DMBA，加入2．29 mL乙酸，用水溶解并稀釋定容至10 mL。所得衍生溶液中各組分濃度為：49 mmol/L DMBA、4．0 mol/L乙酸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理將魚去鱗、去皮，沿脊背取肌肉切成不大于0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm的小塊后混勻，充分勻漿，-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取5．0~10 g勻質(zhì)樣品置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，研磨成粉末。稱取1．0 g粉末于15 mL離心管中，加入2 mL 0．1 mol/L氫氧化鈉溶液，37℃水浴30 min，加入8 mL 0．6 mol/L鹽酸溶液，80℃酸解20 min，冰水浴冷卻至室溫。停止反應(yīng)后以13 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行衍生反應(yīng)。

1.2.2 衍生反應(yīng)DMB衍生反應(yīng)：取酸解后的樣品上清液或某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，與100 μL衍生化試劑溶液混勻，50℃振蕩避光衍生90 min，冷卻至室溫，經(jīng)0．22 μm濾膜過濾后待測。

DMBA衍生反應(yīng)：取酸解后的樣品上清液或某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，與100 μL衍生化試劑溶液混勻，60℃振蕩避光衍生60 min，冷卻至室溫，經(jīng)0．22 μm濾膜過濾后待測。

1.2.3 色譜條件Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）；進(jìn)樣量為10 μL；樣品室溫度為10℃，柱溫為40℃。熒光檢測器，DMB衍生物：激發(fā)波長為373 nm，發(fā)射波長為448 nm；DMBA衍生物：激發(fā)波長為379 nm，發(fā)射波長為432 nm。流動相：A為純水，B為乙腈，梯度洗脫條件為：0~1．5 min，92%A；1．5~2．5 min，92%~91%A；2．5~4．0 min，91%A；4．0~4．1 min，91%~85%A；4．1~8．0 min，85%A；8．0~8．3 min，85%~92%A；8．3~11．0 min，92%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

唾液酸具有較強(qiáng)的極性且不穩(wěn)定，因此需通過衍生以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)其在C18色譜柱上的保留，同時提高檢測靈敏度和改善色譜分離度。Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）具有柱效高和分離時間短的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)選擇純水和乙腈作為流動相，通過改進(jìn)梯度洗脫條件以獲得尖銳對稱的色譜峰形和最佳的分離度。與糖類衍生物類似，流動相組成對唾液酸衍生物在C18柱上的保留影響十分明顯。流動相中有機(jī)相和水相的比例稍微發(fā)生變化均會影響3種唾液酸的出峰時間和分離度。因此梯度洗脫的前4 min流動相比例變化緩慢，待3種唾液酸全部出峰后，再提高乙腈比例以快速沖洗雜質(zhì)，縮短分離時間。通過優(yōu)化梯度洗脫程序可使Neu5Ac、Neu5Gc和KDN實(shí)現(xiàn)良好分離，在4 min內(nèi)完全出峰，分離良好，峰形尖銳，且響應(yīng)值較高。3種唾液酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0．02 μg/mL）的色譜圖如圖2所示。

圖2 3種唾液酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0．02 μg/mL）的色譜圖Fig．2 Chromatogram of 3 SAs mixed standard solution（0．02 μg/mL）

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 酸解條件的優(yōu)化研究表明酸水解唾液酸的作用強(qiáng)于酶解，且耗時更短，其中鹽酸的水解效果較好［27-28］。鹽酸酸解的一般條件是在0．1 mol/L鹽酸中80℃水解2 h，Ye等［19］研究表明，奶粉樣品中唾液酸水解的最佳條件為0．6 mol/L鹽酸80℃水解14 min。因此實(shí)驗(yàn)以草魚肉為基質(zhì)，以3種唾液酸含量為指標(biāo)，比較了唾液酸在80℃下0．1 mol/L鹽酸水解2 h以及80℃下0．6 mol/L鹽酸分別水解14、20、30、50 min 5種條件下的水解效率。向處理好的草魚樣品中加入30 μg/g標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個酸解條件做3個平行。結(jié)果表明，草魚肉經(jīng)0．6 mol/L鹽酸水解20 min后3種唾液酸的含量達(dá)到最大，隨著時間延長，唾液酸的含量明顯降低，表明20 min時唾液酸已降解完全，而反應(yīng)時間過長會使得單體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的唾液酸發(fā)生降解。因此，選擇酸解條件為80℃下0．6 mol/L鹽酸水解20 min。

2.2.2 衍生條件的優(yōu)化唾液酸的衍生試劑包括鄰苯二胺類、苯胺類、甲基化試劑碘甲烷、烷基胺類試劑等。其中鄰苯二胺類試劑DMB具有熒光信號強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢，但DMB衍生方法也存在缺點(diǎn)［29］：DMB及其衍生物具有光敏感性，暴露在空氣中易被氧化變色，自然光室溫下超過24 h即不穩(wěn)定，必須避光-20℃冷凍保存，不利于大批量樣品的檢測和儲存，因此配制衍生試劑中常會加入連二亞硫酸鈉和β-巰基乙醇等還原劑使其穩(wěn)定。但β-巰基乙醇具有較強(qiáng)烈的刺激性氣味，連二亞硫酸鈉有毒，對眼睛、呼吸道黏膜有刺激性，導(dǎo)致DMB衍生試劑具有非常刺激的氣味，不利于人體健康。DMBA與DMB同屬鄰苯二胺類衍生試劑［30］，但前者更穩(wěn)定，無需還原試劑輔助，且在唾液酸異構(gòu)體的分離方面具有更好優(yōu)勢［31］。本實(shí)驗(yàn)選擇DMBA作為衍生試劑，以草魚肉樣品為考察對象，3種物質(zhì)的含量為指標(biāo)，考察了樣品溶液和DMBA衍生溶液的體積比（9∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2）、衍生反應(yīng)溫度（50、60、70℃）和衍生時間（30、60、90、120 min）3個因素對DMBA衍生效果的影響（圖3）。

如圖3所示，優(yōu)化后選擇的衍生條件為：樣品溶液和DMBA衍生溶液的體積比為1∶1，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時間為60 min。在該條件下的衍生效果與DMB的衍生效果相近。

圖3 樣品溶液和DMBA衍生試劑的體積比（A）、衍生反應(yīng)溫度（B）、衍生反應(yīng)時間（C）對唾液酸釋放量的影響Fig．3 Effects of volume ratio of sample solution to DMBA derived reagent（A），derivative reaction temperature（B）and derivative reaction time（C）on sialic acid release

2.3 線性范圍與定量下限

將3種分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行衍生和測定，以3種物質(zhì)的色譜峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，Neu5Ac、Neu5Gc和KDN在0．02~5．0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0．999（見表1）。因魚肉中KDN的含量比其他2種物質(zhì)低1個數(shù)量級［24-25］，為得到更加準(zhǔn)確的含量，實(shí)際樣品檢測和含量計算中Neu5Ac、Neu5Gc的測定以0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；KDN的測定以0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1．0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將3種唾液酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋并衍生化后進(jìn)行測定，以10倍信噪比計算得到Neu5Ac、Neu5Gc和KDN的定量下限（LOQ）分別為0．20、0．20、0．10 μg/g。

表1 3種唾液酸的線性關(guān)系、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 1 Linear relations，recoveries and RSDs of 3 sialic acids（n=5）

2.4 方法回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別以草魚和大黃魚空白樣品為基質(zhì)，加入低、中、高3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，酸解后衍生，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（表1）。結(jié)果表明，3種唾液酸的平均回收率為90．8%~103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2．8%~5．0%，方法精密度和準(zhǔn)確度可滿足檢測要求。

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用建立的方法測定了草魚、鯽魚、青魚、黃姑魚、鱸魚、大黃魚等常見淡水和海水魚的Neu5Ac、Neu5Gc和KDN含量。結(jié)果顯示，所測魚肉中Neu5Ac的含量均較高，且遠(yuǎn)高于KDN的含量；Neu5Gc未檢出。其中青魚樣品的Neu5Ac含量最高（見表2），色譜圖見圖4。

圖4 青魚樣品的色譜圖Fig．4 Chromatogram of a black carp sample

表2 實(shí)際樣品中3種唾液酸的含量Table 2 Contents of 3 SAs in practical samples

3 結(jié)論

本文建立了DMBA衍生/超高效液相色譜測定魚肉中3種核心唾液酸的方法，前處理中選擇DMBA作為衍生試劑代替DMB，并對衍生條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法測定時間短，靈敏度高，精密度好，線性良好，已成功應(yīng)用于魚肉中唾液酸的測定。研究結(jié)果可為今后開展唾液酸的乙酰化、甲基化等多種同分異構(gòu)體的分離和鑒定提供基礎(chǔ)。