非衍生化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑殘留

林麗敏，張建瑩*，肖 鋒，黃 科，葉 剛，洪小柳，呂 飛

（1．深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；2．惠州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 惠州 516006）

除草劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)種植中。隨著農(nóng)業(yè)科技日益更新和抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的崛起，氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑的市場(chǎng)占有率飛速增長(zhǎng)，成為23類(lèi)除草劑之首［1］。氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑是指帶有氨基和膦酸基團(tuán)的氨基酸類(lèi)除草劑，主要包括草甘膦、草銨膦、雙丙氨膦。該類(lèi)除草劑對(duì)于人體傷害的報(bào)道越來(lái)越多。研究發(fā)現(xiàn)，草銨膦介導(dǎo)抑制谷氨酰胺生成影響中樞系統(tǒng)興奮性，可能引起患者意識(shí)障礙、呼吸衰竭［2］。歐洲化學(xué)品管理局研究報(bào)告顯示，草甘膦可能會(huì)傷害人類(lèi)眼睛和水生生物［3］。歐盟食品安全局將153種農(nóng)產(chǎn)品的限量從0．1~50 mg/kg降至0．05 mg/kg［4］。GB 2763-2021規(guī)定谷物、蔬菜、水果等日常食品中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量分別為0．1~5 mg/kg和0．1~0．9 mg/kg［5］。

目前，針對(duì)草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦的研究較多，雙丙氨膦的研究報(bào)道較少。蔬菜、水果中草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦的檢測(cè)主要采用衍生/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6］。免疫法、毛細(xì)管電泳法和離子色譜法的靈敏度低，不能滿足法律規(guī)定的限量要求［7-9］。由于氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑具有極性高、不易揮發(fā)、不溶于大部分有機(jī)溶劑等特點(diǎn)，需將目標(biāo)物衍生化后進(jìn)行檢測(cè)。常用的氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC）、三氟乙酸酐和七氟丁酰咪唑等衍生試劑［10］具有刺激性氣味，易揮發(fā)，吸入后會(huì)灼傷人體黏膜，且需使用陽(yáng)離子交換柱，成本較高，凈化操作繁瑣，檢測(cè)效率低。張?jiān)品宓龋?1］建立了一種非衍生化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)生物體液中草甘膦、草銨膦及其代謝物等8種極性農(nóng)藥的方法；Jake等［12］建立了一種非衍生化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定水中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的方法；非衍生化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定土壤［13］、茶葉［14］、面粉及燕麥［15］和植物油［16］中草甘膦、草銨膦及其代謝物的研究亦有報(bào)道。但非衍生化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用于果蔬中氨基酸有機(jī)磷類(lèi)殘留的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文以蔬菜、水果為研究對(duì)象，以常見(jiàn)的草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦、雙丙氨膦為檢測(cè)目標(biāo)物，采用非衍生化方法，建立了蔬菜、水果中4種氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，有助于在監(jiān)管范圍、檢測(cè)技術(shù)和時(shí)效性等方面提升果蔬食品中氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑的監(jiān)測(cè)能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Talboys多管式渦旋振蕩儀（美國(guó)Troemner公司）；3K18高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；Milli-Q Integral 10+高純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）；Vac Elut固相萃取裝置（美國(guó)Agilent公司）；0．22 μm有機(jī)濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份公司）；乙酸銨（色譜純，德國(guó)Sigma公司）；二氯甲烷（分析純，中國(guó)Ghtech公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；N-丙基乙二胺吸附劑（GCB，美國(guó)Supelco公司）；Oasis HLB柱（6 mL/200 mg，美國(guó)Waters公司）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：草甘膦（CAS號(hào)：1071-83-6，純度99．0%）；氨甲基膦酸（AMPA，CAS號(hào)：1066-51-9，純度99．0%）；草銨膦（CAS號(hào)：51276-47-2，純度99．0%）；草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)（IS，CAS號(hào)：1185107-63-4，純度97．3%）；雙丙氨膦鈉鹽（CAS號(hào)：71048-99-2，純度72．4%）。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取稱(chēng)取5．00 g試樣（精確至0．01 g）于50 mL具塞離心管中，加入50 μL 10．0 mg/L草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)、25 mL水和10 mL二氯甲烷，渦旋振蕩提取20 min，9 500 r/min離心5 min，上清液待凈化。對(duì)于柑橘類(lèi)等酸度較大的水果，取5 mL上清液，加入20 μL氨水調(diào)至pH 9，渦旋振蕩均勻，待凈化。

1.2.2 凈化HLB固相萃取柱用5 mL甲醇和5 mL水預(yù)淋洗，棄去淋洗液；吸取提取上清液5 mL通過(guò)HLB固相萃取柱，收集濾液，渦旋，取1 mL濾液過(guò)0．22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypercarb（100 mm×2．1 mm i．d．，3 μm，美國(guó)Thermo公司）。流動(dòng)相：A為0．2%甲酸水，B為乙腈。等度洗脫程序：0~10．0 min，5% B。進(jìn)樣量：5 μL；流速：0．25 mL/min；柱溫：40℃。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），離子源溫度：300℃；霧化氣流速：3 L/min；加熱氣流速：10 L/min；驅(qū)動(dòng)氣流速：10 L/min；負(fù)離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；駐留時(shí)間：100 ms。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters for the detection of 5 compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

比較了Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2．1 mm i．d．，2．7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（150 mm×3．0 mm i．d．，1．7 μm）以及Thermo Scientific Hypercarb（100 mm×2．1 mm i．d．，3 μm）3種色譜柱對(duì)4種氨基酸類(lèi)有機(jī)磷及內(nèi)標(biāo)物的色譜保留情況。結(jié)果顯示，5種物質(zhì)在Poroshell 120 EC-C18和Thermo Scientific Hypercarb柱上有保留，在ACQUITY UPLC BEH HILIC柱上無(wú)保留。各化合物在Thermo Scientific Hypercarb柱上的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)較好，最終選擇該柱作為分析柱。

2.2 流動(dòng)相的選擇

對(duì)比了5種流動(dòng)相：A（乙腈-0．005 mol/L乙酸銨）、B（甲醇-0．005 mol/L乙酸銨）、C（甲醇-0．2%甲酸水）、D（乙腈-0．1%甲酸水）、E（乙腈-0．2%甲酸水）對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示，在流動(dòng)相中加入0．005 mol/L乙酸銨時(shí)，草甘膦及內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)較低，雙丙氨膦不出峰；用甲酸水作為水相，草甘膦、草甘膦內(nèi)標(biāo)、雙丙氨膦均出峰，但響應(yīng)不高。隨著水相中甲酸含量的提高，草甘膦和草甘膦內(nèi)標(biāo)的峰形變好，雙丙氨膦的響應(yīng)提高（見(jiàn)圖1）。因乙腈的洗脫能力較甲醇強(qiáng)，待測(cè)物的峰形較甲醇流動(dòng)相更好。最終確定以乙腈-0．2%甲酸水作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相對(duì)5種化合物質(zhì)譜響應(yīng)的影響Fig．1 Effect of different mobile phases on mass spectrum response of 5 compounds

2.3 提取溶劑的選擇

氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑非衍生法的常用提取溶劑有氫氧化鈉［13］、水［14-15］、水與乙腈混合溶液［16］等。本文考察了水、水-二氯甲烷（5∶2，體積比）混合溶液對(duì)5種化合物的提取效果。結(jié)果表明，對(duì)于脂溶性雜質(zhì)較少的水果樣品，采用上述2種提取溶劑，5種化合物的提取率在80%以上；但對(duì)于榴蓮等脂溶性雜質(zhì)較多的水果樣品，采用水-二氯甲烷（5∶2）混合溶液作為提取溶劑可以破乳破酯，提高提取效率，比單純使用水作為提取溶劑效果更佳。綜合考慮，采用水-二氯甲烷（5∶2）作為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

植物源性食品中含有大量色素及水溶性和脂溶性雜質(zhì)，其中水果樣品含有高糖等有機(jī)物，需凈化去除提取液中的水溶性糖分、水溶性色素等干擾物質(zhì)。二氯甲烷微溶于水，可溶解多種有機(jī)化合物雜質(zhì)。石墨化炭黑（GCB）對(duì)果蔬中的色素（如葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素）及固醇類(lèi)等系列化合物具有很強(qiáng)的吸附能力。HLB固相萃取柱具有親水-親脂平衡化學(xué)結(jié)構(gòu)，是疏水性強(qiáng)且具有良好水浸潤(rùn)性的聚合物吸附劑，可吸附部分脂肪、脂溶性雜質(zhì)，除色素效果較好。LC-18固相萃取柱能較好去除脂肪和脂溶性雜質(zhì)。本文分別比較了二氯甲烷液液萃取凈化、GCB分散固相萃取凈化、Oasis HLB（6 mL/200 mg）、Supelclean LC-18（6 mL/500 mg）固相萃取柱的凈化效果以及二氯甲烷液液萃取法結(jié)合Oasis HLB（6 mL/200 mg）固相萃取柱凈化的效果。結(jié)果顯示，單獨(dú)采用二氯甲烷液液萃取、GCB分散固相萃取凈化時(shí)，凈化液的干擾峰多，目標(biāo)物響應(yīng)較差；提取液經(jīng)Oasis HLB萃取柱凈化后，干擾峰少，但草甘膦的峰形較差；經(jīng)LC-18固相萃取柱凈化后，AMPA的峰形差，且目標(biāo)物的響應(yīng)低；采用二氯甲烷和Oasis HLB萃取柱兩者結(jié)合的凈化模式凈化，則凈化液的檢測(cè)峰少，目標(biāo)物的響應(yīng)較高。這可能是由于在水基質(zhì)提取液中，二氯甲烷在凈化去除部分水溶性糖分、可溶解有機(jī)化合物等雜質(zhì)后，Oasis HLB萃取柱可進(jìn)一步去除色素、親水性干擾物，兩者起到互補(bǔ)作用，凈化更好。

綜上所述，本方法選取二氯甲烷液液萃取法結(jié)合Oasis HLB（6 mL/200 mg）固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性方程、檢出限與定量下限用水稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成質(zhì)量濃度為0．010、0．020、0．050、0．100、0．200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（同位素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度均為50 μg/L），以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測(cè)組分的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。結(jié)果表明，4種目標(biāo)化合物在0．010~0．200 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0．996。分別以3倍信噪比和10倍信噪比確定方法檢出限和定量下限，4種目標(biāo)化合物的檢出限均為0．01 mg/kg，定量下限均為0．05 mg/kg。4種氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑及內(nèi)標(biāo)的MRM譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 4種氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑及內(nèi)標(biāo)的MRM譜圖Fig．2 MRM chromatograms of 4 phosphorus-containing amino acid herbicides and the internal

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度采用空白的柑橘、葡萄、麥菜作為驗(yàn)證基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為0．050、0．100、0．200 mg/kg，每個(gè)水平做6個(gè)平行。按照本方法進(jìn)行前處理和檢測(cè)，采用內(nèi)標(biāo)法定量。由表2可知，3個(gè)加標(biāo)水平下4種化合物的平均回收率為72．2%~109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為2．2%~11%，方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表2 4種氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑的相關(guān)系數(shù)（r）、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Correlation coefficients（r），recoveries and relative standard deviations of four amino acid organophosphorus herbicides

（續(xù)表2）

2.5.3 方法的實(shí)際應(yīng)用采用該方法檢測(cè)10批次鮮柑橘、10批次鮮葡萄和10批次麥菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2批次鮮柑橘樣品中檢出草甘膦，檢出量均小于定量下限。

3 結(jié)論

本文采用水-二氯甲烷（5∶2）混合溶劑提取目標(biāo)物，提取液經(jīng)二氯甲烷液液萃取、HLB固相萃取柱凈化，建立了果蔬中4種氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑的非衍生化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該法操作簡(jiǎn)便，試劑用量少，靈敏度高，穩(wěn)定性好，且具有較高的回收率、良好的精密度，可滿足果蔬中氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑的檢測(cè)要求。