固相萃取-高效液相色譜法測定植物油中苯并[a]芘

蔡盡忠，王集鵬，鄧 盈

(廈門華廈學(xué)院 環(huán)境與公共健康學(xué)院，福建 廈門 361024)

隨著人們生活水平日漸提高，食品安全問題也備受重視。甘肅“紅色南梁”純胡麻油苯并[a]芘超標(biāo)事件以及深圳沃爾瑪油炸雞腿等反復(fù)使用“千滾油”等安全問題引發(fā)人們對苯并[a]芘的關(guān)注。苯并[a]芘(BaP)是一種由5個(gè)苯環(huán)構(gòu)成的稠環(huán)芳香烴，難溶于水，具有脂溶性，性質(zhì)十分穩(wěn)定，是食品常見的污染物之一[1]。苯并[a]芘是多環(huán)芳烴中毒性最強(qiáng)的致癌物，對實(shí)驗(yàn)動物的最小致癌劑量為0.4～2 μg[2]。歐盟規(guī)定油炸食品中苯并[a]芘含量不能超過2 μg/kg[3]，我國GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中規(guī)定油脂及油制品中苯并[a]芘含量不能超過10 μg/kg。

目前，國內(nèi)外對于苯并[a]芘常用的檢測方法有高效液相色譜法[4-5]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、熒光分光光度法等。在我國，GB 5009.265—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測定》是現(xiàn)行有效檢測食品中苯并[a]芘含量的標(biāo)準(zhǔn)，此標(biāo)準(zhǔn)的前處理步驟較為復(fù)雜，對操作人員的要求高，較難滿足基層檢測機(jī)構(gòu)的需求。

本研究在國標(biāo)法的基礎(chǔ)上，用固相萃取法(SPE)對油樣進(jìn)行前處理，在達(dá)到傳統(tǒng)液液萃取法檢出限的基礎(chǔ)上簡化前處理方法，使苯并[a]芘在高油脂含量樣品中的檢測更簡單。同時(shí)研究固相萃取法中萃取柱回收利用的可能性，解決固相萃取法成本高的問題，有效節(jié)約基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室檢測的成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

空白樣品：金龍魚食用植物調(diào)和油(配方為大豆油49%，菜籽油21%，葵花籽油14%，玉米油9%，花生油3%，稻米油3%，芝麻油0.6%，胡麻油0.4%)。

檢測樣品：福臨門大豆油、金龍魚玉米油、魯花花生油、多力葵花籽油、寶鷺菜籽油、福臨門葵花籽油，均購于某超市。

20 μg/mL苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)儲備液，湖北擺渡化學(xué)有限公司；環(huán)己烷(AR)，乙酸乙酯(AR)，乙腈(AR)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

50 mg/3 mL固相萃取柱，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；N-100D-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；LC-20A高效液相色譜儀，島津公司；HZ-HS-502N電子天平；0.22 μm有機(jī)相型微孔濾膜；MS3渦旋混合器，德國IKA貿(mào)易公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

用乙腈將苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋到0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 μg/L，獲得苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)工作液(臨用時(shí)配制)。

1.2.2 苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL進(jìn)行高效液相色譜分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，苯并[a]芘質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 苯并[a]芘的檢測

1.2.3.1 樣品前處理

稱取0.50 g油樣，置于5 mL離心管中，加入600 μL環(huán)己烷萃取劑，渦旋混合30 s，充分混勻，待固相萃取凈化。固相萃取操作步驟(操作過程避光)：①固相萃取柱活化。用1 mL環(huán)己烷活化小柱。②上樣。將待凈化液上樣到固相萃取柱上，然后用0.5 mL環(huán)己烷潤洗樣品瓶，潤洗液也上樣到固相萃取柱上(潤洗2次)。③淋洗。用1 mL環(huán)己烷淋洗固相萃取柱。④洗脫。用1 mL乙酸乙酯洗脫并收集于雞心瓶中(洗脫3次)。⑤濃縮、定容。將收集液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至近干(溫度40℃)，用乙腈定容到0.5 mL，將混合液用0.22 μm微孔濾膜過濾后裝入高效液相色譜進(jìn)樣瓶。

1.2.3.2 高效液相色譜檢測

檢測條件：PAH C18色譜柱；熒光檢測器；柱溫30℃；激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長450 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動相乙腈-水(體積比9∶1)。

采用外標(biāo)法定量。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取5個(gè)空白樣品經(jīng)過固相萃取柱前處理后，用高效液相色譜儀檢測，考察方法的重現(xiàn)性。

1.2.4.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

稱取空白樣品0.50 g，置入5 mL離心管中，向離心管中添加苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加水平為0.5、1.0、5.0、10.0 μg/kg，對加標(biāo)后的樣品進(jìn)行固相萃取柱前處理后，采用高效液相色譜檢測，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。按下式計(jì)算加標(biāo)回收率。

加標(biāo)回收率=(加標(biāo)樣品實(shí)測量-樣品測量值)/加標(biāo)量×100%

1.2.5 與國標(biāo)法比較實(shí)驗(yàn)

取檢測樣品經(jīng)過固相萃取柱前處理后，分別用本方法與國標(biāo)法檢測，每個(gè)樣品均測3個(gè)平行，檢測結(jié)果以”平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進(jìn)行差異顯著性比較，考察本方法與國標(biāo)法檢測結(jié)果的差異。

1.2.6 固相萃取柱的使用評價(jià)

1.2.6.1 舊固相萃取柱的活化

使用過的固相萃取柱每次使用前都要進(jìn)行活化處理：用2 mL乙酸乙酯以1.0 mL/min的速度過柱清洗，將柱吹干備用。

1.2.6.2 舊固相萃取柱苯并[a]芘殘留分析

將新固相萃取柱和活化處理的舊固相萃取柱，分別按1.2.3.1固相萃取操作步驟中的固相萃取柱活化、洗脫和濃縮、定容操作后，進(jìn)行高效液相色譜分析，通過對比新舊固相萃取柱的色譜圖，分析舊固相萃取柱苯并[a]芘的殘留情況。

1.2.6.3 舊固相萃取柱重復(fù)使用次數(shù)對加標(biāo)回收率的影響

取1.2.4.2加標(biāo)1.0 μg/kg的樣品，分別使用新固相萃取柱和活化處理的舊固相萃取柱按1.2.3.1固相萃取操作進(jìn)行前處理后，采用高效液相色譜檢測，分析新舊固相萃取柱對加標(biāo)回收率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并[a]芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.2操作，苯并[a]芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=60 267x+9 951(x為苯并[a]芘質(zhì)量濃度，μg/L；y為色譜峰面積)，在0.5～10.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 重現(xiàn)性(見表1)

表1 方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，本方法變異系數(shù)為7.7%。根據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求，被測組分含量在1 μg/kg，實(shí)驗(yàn)室變異系數(shù)在30%以內(nèi)。說明本方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.2.2 加標(biāo)回收率

加標(biāo)樣品色譜圖如圖1所示，加標(biāo)回收率結(jié)果如表2所示。

由圖1可見，本方法苯并[a]芘出峰時(shí)間為12.5 min，比國標(biāo)法的21.5 min出峰時(shí)間快，節(jié)約了試劑用量，減少了儀器損耗。由表2可見，添加水平在0.5～10.0 μg/kg的加標(biāo)樣品平均回收率在91.7%～97.3%之間，變異系數(shù)為1.3%～4.6%，符合痕量分析(被測定組分含量小于等于1 μg/g[7])的要求。

圖1 加標(biāo)樣品色譜圖

表2 加標(biāo)回收率

2.2.3 檢出限和定量限

在空白樣品中加入苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行檢測，以定量離子信噪比(S/N)3為檢出限，以定量離子信噪比10為定量限，經(jīng)計(jì)算苯并[a]芘檢出限為0.03 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg。本方法檢出限遠(yuǎn)低于薛昆鵬等[8]和金雪鋒等[9]的0.5 μg/kg、彭小東等[10]的0.4 μg/kg和尹佳等[11]的0.22 μg/kg的檢出限結(jié)果，與龍凌云等[12]0.04 μg/kg的檢出限相當(dāng)。本方法定量限優(yōu)于金雪鋒等[9]的1.0 μg/kg和尹佳等[11]的0.75 μg/kg的定量限結(jié)果。本方法的檢出限和定量限均稍差于房芳等[13]的0.018 μg/kg的檢出限和0.060 μg/kg的定量限結(jié)果，這可能與凝膠色譜凈化法前處理效果好于固相萃取法前處理有關(guān)。

2.3 本方法與國標(biāo)法比較結(jié)果

6種不同食用油檢測樣品用本方法與國標(biāo)法檢測，結(jié)果如表3所示。表3數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本方法與國標(biāo)法檢測結(jié)果不存在顯著差異(P>0.05)，說明本方法可用于實(shí)際食用油樣品中苯并[a]芘的檢測。

表3 本方法與國標(biāo)法檢測結(jié)果

與國標(biāo)法比較，本方法前處理過程得到簡化，這與Belo等[14]研究的前處理方法便捷性相一致，省去了皂化等煩瑣耗時(shí)的步驟。本方法與國標(biāo)法的各項(xiàng)指標(biāo)比較見表4。

表4 本方法與國標(biāo)法的比較

由表4可見：本方法實(shí)驗(yàn)過程與國標(biāo)法比較更加簡單，且操作方便，前處理時(shí)間明顯縮短，有效提高了苯并[a]芘檢測的效率；從試劑使用量看，國標(biāo)法試劑使用量是本方法的9倍，使用本方法能夠節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，且試劑使用量較少，有利于保護(hù)環(huán)境；本方法比國標(biāo)法具有更低的檢出限。

2.4 固相萃取柱重復(fù)使用性

2.4.1 舊固相萃取柱中苯并[a]芘的殘留

新固相萃取柱以及活化處理的舊固相萃取柱的色譜圖分別見圖2、圖3。

圖2 新固相萃取柱色譜圖

圖3 活化處理的舊固相萃取柱色譜圖

由圖2、圖3可見，舊固相萃取柱經(jīng)過活化處理后，測得的洗脫液色譜圖與新柱的色譜圖基線基本相近，基線平穩(wěn)，未見雜峰出現(xiàn)。說明舊固相萃取柱經(jīng)過活化處理后無苯并[a]芘殘留，可再次用于樣品的前處理。

2.4.2 固相萃取柱重復(fù)使用后的加標(biāo)回收率

新固相萃取柱與重復(fù)使用數(shù)次的舊固相萃取柱加標(biāo)回收率對比結(jié)果見表5。

表5 新、舊固相萃取柱加標(biāo)回收率

由表5可見，新固相萃取柱加標(biāo)回收率在92%以上，舊固相萃取柱進(jìn)行5次重復(fù)使用后，加標(biāo)回收率在76.6%～96.4%之間，重復(fù)使用5次后，加標(biāo)回收率還有76.6%，基本符合實(shí)驗(yàn)室檢測要求。購買1根新的苯并[a]芘專用固相萃取柱的成本需要62.7元，而通過本文工藝活化處理的成本不到10元，重復(fù)使用1次萃取柱可節(jié)約成本40%以上，有效節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室的檢測成本。

3 結(jié) 論

(1)根據(jù)國標(biāo)法，建立了固相萃取-高效液相色譜法測定植物油中苯并[a]芘的方法。所建立方法的檢出限為0.03 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg，加標(biāo)回收率大于90%，變異系數(shù)小于5%，重現(xiàn)性好。對6種不同食用油樣品進(jìn)行檢測，本方法與國標(biāo)法檢測結(jié)果不存在顯著差異(P>0.05)。與國標(biāo)法比較，本方法前處理步驟簡單易操作、使用試劑量少、前處理時(shí)間短、檢出限低，符合實(shí)驗(yàn)室和檢測機(jī)構(gòu)快速檢測的需求。

(2)通過對固相萃取柱的苯并[a]芘殘留、重復(fù)使用次數(shù)對加標(biāo)回收率考察實(shí)驗(yàn)，證明使用該方法重新活化固相萃取柱后無苯并[a]芘殘留，固相萃取柱重復(fù)使用5次，加標(biāo)回收率在76.6%～96.4%之間，能夠達(dá)到檢測要求，有效節(jié)約實(shí)驗(yàn)室的檢測成本。