海南油茶種仁蛋白質(zhì)提取及雙向凝膠電泳-質(zhì)譜初步鑒定

葉洲辰，吳友根，于 靖，張軍鋒，楊東梅，胡新文

(海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?70100)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)家族中的一種常綠小喬木或灌木[1]，與油桐、核桃、烏桕齊名，是我國重要的純天然高級油料作物[2]，同時(shí)與橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料樹種，具有較高的栽培價(jià)值和生態(tài)效益[3]。我國是油茶的原產(chǎn)地和主產(chǎn)地，該植物主要分布在江西、湖南等長江以南省份的高山丘陵地帶[4]。油茶籽油的脂肪酸組成與橄欖油類似，且富含維生素、茶多酚、角鯊烯等活性成分，被譽(yù)為“油中軟黃金”，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)重點(diǎn)推廣的高級食用植物油[5]。然而我國油茶籽油產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足人們的需求，尤其是海南油茶，該省地處油茶資源分布的最南緣，海峽隔離，亞熱帶季節(jié)明顯，孕育了獨(dú)具特色的油茶資源，但含油量低卻是制約該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。因此，提高油茶籽油產(chǎn)量對解決當(dāng)前我國食用油市場短缺具有重要意義[6]。

國內(nèi)外關(guān)于油茶的研究多集中于良種選育、低產(chǎn)改造、砧木嫁接、促花保果、組織培養(yǎng)和藥理活性檢測等方面，其重要代謝產(chǎn)物的合成過程及調(diào)控機(jī)制仍不明確，隨著基礎(chǔ)分子生物學(xué)技術(shù)的開展，如油茶組織DNA和RNA提取方法優(yōu)化[7-8]，SRAP、SCAR、ISSR等分子標(biāo)記體系建立[9-11]，以及關(guān)鍵基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化等[12]，油茶籽油的生物合成過程被初步了解，但mRNA水平所提供的基因表達(dá)信息尚未能完整揭示這些合成代謝途徑的分子調(diào)控機(jī)制?；蚬δ艿膱?zhí)行者是蛋白質(zhì)，我們通常是以蛋白質(zhì)組為研究對象，通過大規(guī)模、高通量的分析蛋白表達(dá)量，探究油茶代謝途徑中其所發(fā)揮的作用模式及功能機(jī)理[13]。單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及雙向凝膠電泳(2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)，通過與分子生物學(xué)手段協(xié)作，獲取相應(yīng)的關(guān)聯(lián)信息，并根據(jù)凝膠上每個(gè)蛋白點(diǎn)的存在與否、豐度及位置來可視化分析從核酸層次到蛋白質(zhì)水平上的轉(zhuǎn)變，這將有助于找出與油脂合成積累相關(guān)的重要蛋白，從而調(diào)控油料的含油量與產(chǎn)油質(zhì)量[14]。近年來對于不同物種葉片[15]、種子[16]及花蕊[17]等的蛋白質(zhì)提取優(yōu)化研究已相對成熟，但油料作物種仁蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)起步較晚，且油茶屬于多年生木本植物，其種仁富含大量油脂、色素、酚類等次生代謝物質(zhì)，在提取過程中會對蛋白樣品制備及凝膠電泳結(jié)果造成干擾，而目前關(guān)于海南油茶種仁蛋白提取方法篩選及雙向凝膠電泳-質(zhì)譜鑒定等方面的研究卻鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究以海南油茶成熟種仁為試驗(yàn)材料，優(yōu)化了從油茶種仁中提取高質(zhì)量蛋白的方法，并進(jìn)行了油茶種仁蛋白的雙向凝膠電泳分析，同時(shí)結(jié)合質(zhì)譜鑒定手段和Mascot Distiller軟件進(jìn)行檢索，旨在對今后深入開展油茶種仁蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考，以期為進(jìn)一步培育出更適于海南食用油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的高品質(zhì)油茶良種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

供試樣品于2018年11月采自海南省瓊海市陽江鎮(zhèn)油茶種質(zhì)資源基地(19°12′10"N; 110°24′32"E)，經(jīng)海南大學(xué)楊好偉教授鑒定為CamelliaoleiferaAbel.，油茶果采摘后去殼破皮，將種仁速凍于液氮中，并帶回實(shí)驗(yàn)室貯存在-80℃冰箱備用。

十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、牛血清白蛋白(BSA)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙硫酸(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、維生素C(VC)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、胰蛋白酶、硫脲和尿素均購自美國Sigma公司；IPG緩沖液(IPG buffer, pH 4～7)、線性24 cm IPG膠條(pH 4～7)、礦物甘油和瓊脂糖均購自瑞典GE Healthcare公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、考馬斯亮藍(lán)(CBB-G250)、溴酚藍(lán)(BPB)和β-巰基乙醇(BME)均購自美國Bio-Rad Labs；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Tris飽和酚(pH>7.8)、三羥甲基氨基甲烷和甘氨酸均購自北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉、蔗糖、乙腈、硫酸銨、碳酸氫銨、氯化鈣、甲醇、丙酮、乙酸、磷酸、乙醇，分析純，均購自北京化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Mettler Toledo AL204型電子分析天平(香港長江和記寶業(yè)有限公司)，CT15RT型高速冷凍離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，UV-1000型紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，SY21-K型數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京長風(fēng)儀器儀表公司)，DHG-9030A型烘箱(上海一恒科技有限公司)，THZ-300C型恒溫?fù)u床(上海一恒科技有限公司)，Ettan IPGphor 3型等電聚焦儀(瑞典GE Healthcare公司)，Ettan DALTsix型垂直電泳儀(瑞典GE Healthcare公司)，Image Scanner III型投射掃描儀(瑞典GE Healthcare公司)，5800 MALDI-TOF MS/MS型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海南油茶種仁蛋白提取

1.2.1.1 油茶種仁預(yù)處理

將采集的海南油茶種仁樣品分為2組，每組3份生物學(xué)重復(fù)，每份各稱取1.0 g，分別置于預(yù)冷研缽中，加入適量1.0% PVPP，用液氮充分研磨至粉末后，-80℃保存?zhèn)溆谩７謩e采用TCA-丙酮沉淀法和BPP抽提法提取油茶種仁蛋白。

1.2.1.2 TCA-丙酮沉淀法

參考Wang等[18]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。取1.0 g海南油茶種仁粉末，加入10 mL預(yù)冷的10% TCA-丙酮溶液(PMSF 1.0 mmol/L, DTT 10 mmol/L)，充分混勻后，-20℃靜置過夜；于4℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清；再加入10 mL預(yù)冷的10% TCA-丙酮溶液，旋渦振蕩至沉淀物分散，-20℃靜置2 h后，于4℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清，以上步驟重復(fù)2次，收集沉淀。

1.2.1.3 BPP抽提法

略微改進(jìn)Wang等[19]的方法。取1.0 g海南油茶種仁粉末，加入10 mL BPP 蛋白提取液(EDTA 100 mmol/L, VC50 mmol/L, 三羥甲基氨基甲烷10 mmol/L, 四硼酸鈉50 mmol/L, 1.0% PVPP, 1.0% Triton X-100, 2.0% BME, 30%蔗糖, pH 8.0)，在室溫下渦旋混勻10 min，于4℃、12 000 r/min離心15 min，將上層BPP相轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中，此步驟重復(fù)2次，合并BPP提取層，并加入等體積Tris飽和酚，室溫渦旋振蕩10 min，離心(4℃、12 000 r/min)15 min后，轉(zhuǎn)移上層酚相至另一新離心管中，再加入等體積BPP蛋白提取液，室溫渦旋10 min，于4℃、12 000 r/min離心20 min，然后小心吸取上清液與5倍體積預(yù)冷的過飽和硫酸銨甲醇溶液充分混勻，-20℃靜置過夜后，懸浮液離心(4℃、12 000 r/min)15 min，棄上清，收集沉淀。

1.2.2 蛋白裂解液的制備

將提取的油茶種仁蛋白沉淀用預(yù)冷甲醇清洗2次，隨后用預(yù)冷丙酮清洗2次，棄上清，室溫下自然風(fēng)干后，加入樣品裂解液(尿素7.0 mol/L, 硫脲2.0 mol/L, DTT 13 mmol/L, 2.0% CHAPS)，22℃恒溫裂解2 h以上，于4℃、12 000 r/min離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液即蛋白裂解液至1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)得率測定

蛋白定量采用Bradford[20]方法，通過紫外分光光度計(jì)在波長595 nm處測定吸光值，每個(gè)材料重復(fù)3次，以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，BSA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到TCA-丙酮沉淀法和BPP抽提法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.058 5x+0.013 2(R2=0.999 9)和y=0.05 42x+0.048 1(R2=0.999 9)。測定油茶種仁蛋白裂解液595 nm處的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。按下式計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

蛋白質(zhì)得率=蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度×蛋白裂解液體積/油茶種仁質(zhì)量

1.2.4 蛋白質(zhì)單向SDS-PAGE[21]

根據(jù)蛋白定量結(jié)果確定相應(yīng)上樣量(30 μg)，配制成總體積為25 μL的上樣體系(Loading buffer, 蛋白裂解液)，循環(huán)水浴保持16℃，電泳參數(shù)設(shè)置為6 W/gel、1 h和8 W/gel、5 h，待指示線遷移至距膠底部約1.0 cm處時(shí)，停止電泳。

1.2.5 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(2-DE)

1.2.5.1 蛋白水化上樣

根據(jù)蛋白定量結(jié)果確定其上樣量(1 300 μg)，配制成總體積為455 μL的上樣體系(DTT, IPG buffer, 蛋白裂解液)，充分混勻后加入水化盤中，緩慢放置IPG膠條，于22℃恒溫水化18 h以上，待膠條完全吸收水化液即可。

1.2.5.2 第一向等電聚焦(IEF)

開機(jī)自檢后，待等電聚焦儀面板溫度冷卻至20℃時(shí)準(zhǔn)備聚焦，環(huán)境溫度保持20℃，每根膠條限流50 μA，最高電壓限制10 000 V，程序設(shè)置如下：Constant, 250 V, 3 h；Constant, 500 V, 2 h；Constant, 1 000 V, 1 h；Gradate, 8 000 V, 3 h；Constant, 8 000 V, 110 000 Vh；Constant, 1 000 V, 18 h。

1.2.5.3 IPG膠條平衡

第一向等電聚焦結(jié)束后，膠條依次在含有1.0% DTT的平衡緩沖液(尿素6.0 mol/L, 三羥甲基氨基甲烷50 mmol/L, 2.0% SDS, 0.002% BPB, 30%甘油, pH 8.8)和含有4.0% IAM的平衡緩沖液中進(jìn)行平衡，每次分別在平衡槽內(nèi)平衡15 min。

1.2.5.4 第二向SDS-PAGE

平衡結(jié)束后，轉(zhuǎn)移膠條水平放置于12.5% SDS-PAGE凝膠的上端，用含有溴酚藍(lán)的1.0%瓊脂糖封固膠條，在Ettan DAL Tsix垂直電泳儀中進(jìn)行電泳，循環(huán)水浴保持16℃，電泳參數(shù)設(shè)置為6 W/gel、1 h和8 W/gel、5 h，待指示線遷移至距膠底部約1.0 cm處時(shí)，結(jié)束電泳。

1.2.6 凝膠染色及圖像采集分析

電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色[22]，再小心取出凝膠，用脫色液清洗直至背景清晰為止。脫色完全后通過Image Scanner Ⅲ型投射掃描儀對凝膠進(jìn)行圖像掃描，參數(shù)設(shè)置為：投射掃描，灰度階256，分辨率300 dpi，TIF格式保存。然后用Image Master 2D Platinum 5.0軟件進(jìn)行凝膠圖像數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解

從凝膠上挖取目標(biāo)蛋白點(diǎn)放至PCR薄壁管中，并用100 μL去離子水清洗3次，搖床振蕩30 min；除去水，加入100 μL脫色液(碳酸氫銨50 mmol/L, 50%乙腈)脫色30 min，直至膠粒完全變?yōu)橥该鳛橹梗怀ッ撋?，再加?0 μL乙腈，室溫脫水20 min；除去乙腈，將膠粒放置在超凈工作臺中微風(fēng)干燥1 h；隨后加入3.0 μL胰蛋白酶工作液(20 ng/μL)，使酶液完全浸入膠粒，于4℃條件下靜置1 h，再吸去多余酶液，并加入5.0 μL酶緩沖液(氯化鈣0.5 mmol/L, 碳酸氫銨50 mmol/L, pH 8.0～8.5)，37℃恒溫酶解約16 h；待酶解完成后，室溫、12 000 r/min條件下離心5 min，吸取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析[23]。

1.2.8 蛋白質(zhì)譜鑒定

采用5800 MALDI-TOF MS/MS型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對酶解得到的肽段混合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，經(jīng)基質(zhì)峰、酶自切峰校正，根據(jù)海南油茶種仁轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行蛋白預(yù)測，并建立數(shù)據(jù)庫，然后通過Mascot Distiller軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，當(dāng)匹配值小于0.05，且檢索分?jǐn)?shù)超過標(biāo)準(zhǔn)線時(shí)，認(rèn)為該蛋白被成功鑒定，得分越高，其可信度越高。質(zhì)譜條件：基質(zhì)輔助激光解吸電離源；掃描方式一級質(zhì)譜全掃描(MS)，二級質(zhì)譜全掃描(MS/MS)；掃描范圍為m/z1 000～4 000；激光強(qiáng)度為3 700；多肽及多肽碎片的碎裂方式為碰撞誘導(dǎo)電離(HCD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對海南油茶種仁蛋白提取效率的影響

為探究不同方法之間蛋白提取效率的差異，在油茶種仁鮮重均為1.0 g的條件下，對采用2種提取方法所得樣品蛋白的質(zhì)量濃度和得率進(jìn)行比較分析，結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法對海南油茶種仁蛋白提取效率的影響

由表1可知，相對于TCA-丙酮沉淀法，BPP抽提法所得油茶種仁蛋白具有較高的質(zhì)量濃度和得率，分別為12.704 μg/μL 和5.082 mg/g，故判斷此方法提取海南油茶種仁蛋白效果良好。

2.2 不同方法提取的蛋白單向SDS-PAGE圖譜比較分析

分別對采用2種提取方法所得的海南油茶種仁蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖1。

注：M.Protein Marker；A.TCA-丙酮沉淀法；B.BPP抽提法。

圖1 不同方法提取的海南油茶種仁蛋白的單向SDS-PAGE圖譜

由圖1可知，二者的蛋白條帶都主要集中在18.4～66.2 kDa范圍之間，且在18.4、25、45 kDa附近均出現(xiàn)3條明顯的高豐度蛋白條帶，但彼此分離后的條帶數(shù)目、位置及豐度值卻存在顯著差異。采用BPP抽提法所得蛋白條帶分離均勻，背景清晰，高豐度蛋白條帶相對集中，提取效果較好；而TCA-丙酮沉淀法所得蛋白條帶數(shù)相對較少，蛋白質(zhì)缺失嚴(yán)重，輪廓模糊，在相對分子質(zhì)量小于18.4 kDa處出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，故判斷BPP抽提法優(yōu)于TCA-丙酮沉淀法。

2.3 不同方法提取的蛋白2-DE圖譜比較分析

分別對采用2種方法所提取的海南油茶種仁蛋白進(jìn)行2-DE分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，蛋白提取方法對2-DE結(jié)果影響較大，BPP抽提法所得蛋白的2-DE圖譜背景干凈，蛋白點(diǎn)分散均勻、分離充分、數(shù)量較多、輪廓清晰、形狀規(guī)則呈圓形或近圓形，基本無明顯拖尾現(xiàn)象，經(jīng)Image Master 2D Platinum 5.0軟件分析后，在凝膠圖上共檢測出847個(gè)蛋白點(diǎn)，集中分布在等電點(diǎn)(pI)pH 5.0～6.0、相對分子質(zhì)量(Mr)86～42 kDa范圍內(nèi)，而在偏酸性端pH 4.0～4.5以及高相對分子質(zhì)量(>102 kDa)區(qū)域內(nèi)幾乎沒有蛋白點(diǎn)，雖存在少量蛋白堆積現(xiàn)象，但整體聚焦效果較好。對于TCA-丙酮沉淀法所得蛋白的2-DE圖譜，蛋白點(diǎn)數(shù)較少(662個(gè))，分辨率較低，形狀不圓潤，無大量高豐度蛋白，且出現(xiàn)不同程度的橫向條紋。綜合分析2種提取方法所得蛋白的2-DE圖譜，認(rèn)為BPP抽提法具有更好的提取率，不會造成蛋白質(zhì)大量損失，更適于油茶等油料作物種仁蛋白的提取及2-DE等分析研究。

注： A.TCA-丙酮沉淀法；B.BPP抽提法。

2.4 質(zhì)譜鑒定

為了確定BPP抽提法所得海南油茶種仁蛋白的質(zhì)譜兼容性，從2-DE凝膠上選取了12個(gè)高分辨率蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定(圖3)，質(zhì)譜鑒定信息見表2。

注：箭頭所示的點(diǎn)為選取進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的蛋白點(diǎn)。

由表2可知，有10個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定，鑒定成功率為83.3%，數(shù)據(jù)庫搜庫得分均超過100，且序列覆蓋率可達(dá)14%～25%，說明酶解產(chǎn)物中包含較多的目標(biāo)蛋白肽段序列，該鑒定結(jié)果相對可靠。其中，蛋白點(diǎn)1為蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，蛋白點(diǎn)2為Rubisco亞基結(jié)合蛋白(RBP)，蛋白點(diǎn)3為熱激蛋白70(Hsp70)，蛋白點(diǎn)4為伴侶蛋白60(CPN60-2)，蛋白點(diǎn)5為焦磷酸化酶(PPase)，蛋白點(diǎn)6為尿黑酸1, 2-雙氧化酶(HGD)，蛋白點(diǎn)7為絲氨酸蛋白酶(EDA2)，蛋白點(diǎn)8為球蛋白(GBP)，蛋白點(diǎn)10為ATP合酶β亞基(ATPaseβ)，蛋白點(diǎn)12為乙醛脫氫酶(ALDH2B4)。這些蛋白質(zhì)主要參與氨基酸代謝、脂類代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝、能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化等生物過程，還可作為分子伴侶在蛋白翻譯后修飾方面發(fā)揮重要作用。

表2 海南油茶種仁蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定信息

續(xù)表2

蛋白點(diǎn)蛋白名稱Unigene號蛋白點(diǎn)得分等電點(diǎn)/相對分子質(zhì)量總(匹配)肽段數(shù)序列覆蓋率/%物種07絲氨酸蛋白酶 (Probable serine protease EDA2)Unigene0721843575.85/49.525 (5)16Juglans regia08球蛋白 (Globulin-like pro-tein)Unigene0638903515.94/52.805 (5)21Actinidia chinensis10ATP合酶β亞基 (ATP synthase subunit beta, mito-chondrial-like)Unigene0718594936.06/59.597 (7)18Solanum lycopersicum12乙醛脫氫酶 (Aldehyde de-hydrogenase family 2 mem-ber B4, mitochondrial-like)Unigene0872282246.44/58.875 (5)14Ziziphus jujuba

注：蛋白點(diǎn)代表圖3中標(biāo)記的蛋白點(diǎn)號；Unigene號代表油茶種仁轉(zhuǎn)錄組測序鑒定所得基因號；蛋白點(diǎn)得分代表檢索Mascot Distiller軟件所得計(jì)算分?jǐn)?shù); 蛋白點(diǎn)9和蛋白點(diǎn)11未經(jīng)質(zhì)譜鑒定成功(蛋白得分低于標(biāo)準(zhǔn)線)；總(匹配)肽段數(shù)括號內(nèi)數(shù)值代表總肽段數(shù)中可信值大于95%的肽段數(shù)。

2.5 討論

蛋白樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首要前提，其質(zhì)量是決定后續(xù)單向SDS-PAGE及2-DE結(jié)果的關(guān)鍵因素。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)一種適用于所有植物蛋白的提取方法，因?yàn)椴煌参锝M織或細(xì)胞內(nèi)部的次生代謝產(chǎn)物存在差異，這些物質(zhì)會與蛋白結(jié)合形成各種能破壞其結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，從而不同程度地干擾后續(xù)蛋白的分離與鑒定，故針對不同植物材料，選擇合適的蛋白提取方法尤為重要[23]。曹銳等[24]發(fā)現(xiàn)新型TCA-丙酮法適用于蓮子葉和胚芽組織的蛋白質(zhì)提取，而傳統(tǒng)TCA-丙酮法則適用于提取蓮的胚軸組織蛋白。邱智敏等[17]研究表明采用TCA-丙酮結(jié)合酚抽法提取油茶雌蕊蛋白能夠得到更多較為清晰的蛋白點(diǎn)。油茶屬于油料作物，其種仁中富含油脂、多酚、多糖等會與蛋白發(fā)生共沉淀的代謝產(chǎn)物，從而難以獲得無污染、無缺失的高質(zhì)量植物蛋白，嚴(yán)重影響等電聚焦效果和電泳圖譜的分辨率[25]。

為尋找適合于油茶種仁蛋白的提取方法，本研究進(jìn)行了TCA-丙酮沉淀法和BPP抽提法的對比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPP抽提法所得凝膠圖譜背景清晰，蛋白點(diǎn)數(shù)量較多(847個(gè))，形狀基本規(guī)則，無明顯拖尾現(xiàn)象，而TCA-丙酮沉淀法所得蛋白點(diǎn)數(shù)較少(662個(gè))，分離不充分，無大量高豐度蛋白，且出現(xiàn)了不同程度的橫向條紋及彌散現(xiàn)象，故認(rèn)為BPP抽提法能夠有效防止蛋白變性，減少蛋白降解以及避免蛋白修飾，且可降低樣品中脂類、鹽類及糖類等對蛋白分離和鑒定造成的干擾，使結(jié)果具有良好的重復(fù)性[15]。占志勇等[16]研究發(fā)現(xiàn)TCA-丙酮法會損失大量油桐種仁蛋白，而酚抽法則適用于富含抑制電泳復(fù)合物的頑拗性植物組織蛋白提取，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。吳波等[26]對傳統(tǒng)TCA-丙酮法進(jìn)行改進(jìn)，顯著提高了油茶種仁蛋白(816個(gè))的提取數(shù)量，但其2-DE圖譜上卻出現(xiàn)了許多較為明顯的縱向條紋。何藝凡等[27]認(rèn)為采用TCA-丙酮結(jié)合酚抽法(聚焦條件62 000 V·h，凝膠濃度10% SDS)提取油茶種仁蛋白的分離效果較好，雖與本研究的提取優(yōu)化方法以及電泳體系條件存在差異，但二者所得圖譜的高豐度蛋白點(diǎn)分布卻基本一致，說明盡管不同方法對同一植物材料的適用性不同，若根據(jù)植物自身因素來改良制備技術(shù)仍可獲得大量的優(yōu)質(zhì)蛋白[28]，如在提取液中加入Triton X-100、PVPP、BME等，能夠有效抑制蛋白酶活性，防止多酚等物質(zhì)發(fā)生氧化，進(jìn)而保證蛋白的得率與質(zhì)量[29-30]。

從BPP抽提法所得的2-DE凝膠上選取12個(gè)高豐度蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功率高達(dá)83.3%，表明該方法所得蛋白具有良好的質(zhì)譜兼容性。其中，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(蛋白點(diǎn)1)具有獨(dú)特的底物特異性、伴侶活性及氧化還原性等重要生物功能，可促進(jìn)和催化蛋白內(nèi)或蛋白間形成正確的二硫鍵[31]；熱激蛋白70(蛋白點(diǎn)3)屬于進(jìn)化高度保守的蛋白超家族成員，通常作為分子伴侶參與蛋白多肽鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)、降解和組裝以及免疫識別、細(xì)胞凋亡等生理過程，由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生，通過對受損蛋白進(jìn)行修復(fù)而保護(hù)機(jī)體免受傷害[32]；伴侶蛋白60(蛋白點(diǎn)4)是一類存在于線粒體中的寡聚蛋白復(fù)合體，能利用ATP水解幫助新合成或未成熟的多肽完成折疊裝配，同時(shí)在受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[33]；球蛋白(蛋白點(diǎn)8)是雙子葉植物貯藏蛋白的主要類型，負(fù)責(zé)提供種子萌發(fā)和生長所需的大部分營養(yǎng)物質(zhì)[34]；乙醛脫氫酶(蛋白點(diǎn)12)通過利用NAD(P)+能將許多內(nèi)源依賴性酶、脂肪族和芳香族醛氧化成羧酸，是乙醇代謝途徑中最關(guān)鍵的酶，同時(shí)還具有響應(yīng)環(huán)境脅迫和病原菌侵染的抗逆特性[35]。基于上述結(jié)果，判斷本研究所優(yōu)化的BPP抽提法，以及進(jìn)行的油茶種仁蛋白單向SDS-PAGE和2-DE圖譜效果較好，質(zhì)譜鑒定技術(shù)兼容性較高，能滿足后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的試驗(yàn)要求。

3 結(jié) 論

本研究以海南油茶成熟種仁為試驗(yàn)材料，從蛋白質(zhì)提取方法的篩選與優(yōu)化入手，比較不同方法對該植物種仁蛋白提取效率的影響，同時(shí)結(jié)合單向SDS-PAGE和2-DE技術(shù)、質(zhì)譜鑒定手段和Mascot Distiller軟件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，相對于TCA-丙酮沉淀法，改良后的BPP抽提法對油茶種仁蛋白的提取得率更高，其圖譜背景清晰，蛋白點(diǎn)數(shù)量較多(847個(gè))，形狀圓潤規(guī)則，整體分布均勻，高豐度蛋白相對集中，基本無明顯拖尾現(xiàn)象，說明此樣品制備方法具有穩(wěn)定高效等特點(diǎn)，更適用于油茶種仁蛋白的提取及單向、雙向電泳等的凝膠成像分析。此外，對該植物種仁蛋白進(jìn)行雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜檢測手段的初步探索，選取12個(gè)高分辨率的蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定了10個(gè)，分別代表10種蛋白質(zhì)，鑒定成功率達(dá)83.3%。該方法可為后續(xù)深入開展油茶蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他油料作物種仁蛋白的分離鑒定提供科學(xué)依據(jù)。