柚子皮制備磁性生物炭的表征及其對水中氯胺酮的檢測

馬 雙，游嘉德，巫端浩，江茉莉，周 琴，曹淑瑞*

（1．重慶化工職業(yè)學院 環(huán)境與質(zhì)量檢測學院，重慶 401228；2．西南政法大學 司法鑒定中心，重慶 401120；3．長江師范學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院，重慶 408100）

氯胺酮（Ketamine）俗稱K粉，是苯環(huán)己哌啶的衍生物，為唯一具有鎮(zhèn)痛作用的靜脈全麻藥，臨床上主要用于全麻的誘導和維持、小兒麻醉及鎮(zhèn)痛［1-2］。氯胺酮可導致幻覺、妄想、身心分離等精神分裂癥樣表現(xiàn)，造成認知功能損傷，長期濫用可產(chǎn)生與精神分裂癥相似的精神障礙［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)，在中國臺灣、香港及深圳等地，氯胺酮廣泛存在于污水中，且濃度較高［5-8］。Khan等［6］在北京的污水處理廠中也發(fā)現(xiàn)了氯胺酮的存在，但濃度較低。氯胺酮在地表水中也曾被檢出，濃度一般為幾納克到幾百納克每升［9-10］，可對人體健康造成威脅。

目前，常見的氯胺酮的提取方法有液-液萃取［11］、固相萃取［12］、液相微萃取［13］、固相微萃?。?4］等傳統(tǒng)方法，以及磁性固相萃?。?5］等新興技術。磁性固相萃取的原理是將磁性吸附劑分散于樣品提取液中與目標物成分接觸，通過分子擴散使目標物快速從提取液轉(zhuǎn)移至吸附劑中，然后用強磁鐵吸附磁性吸附劑，棄去提取液后再將目標物從吸附劑上洗脫下來［16］。該方法原材料方便易得、磁性強、可重復利用，萃取操作簡單，避免了過濾、離心等繁瑣操作［17］。Fe3O4磁性納米粒子是目前應用最為廣泛的磁性納米材料，然而單一的Fe3O4磁性納米粒子在水中的穩(wěn)定性較差，容易團聚，導致其表面積減小，吸附性能降低。生物炭是一種新型的環(huán)保富碳材料，其成本低、環(huán)保且具有可再生和再利用的可能性［18-19］，同時因具有比表面積大、孔隙率發(fā)達、表面官能團豐富等特點，常被用于吸附水體中的重金屬雜質(zhì)，但其在水溶液介質(zhì)中難以分離，需要進行改性。對生物炭進行賦磁改性可以增加其吸附量，便于回收利用［20］。柚子皮內(nèi)表面含有大量的孔隙和纖維素，是優(yōu)質(zhì)生物炭的重要生物質(zhì)來源，同時水果廢棄物價廉易得，為后續(xù)柚子皮等水果廢棄物的減量化、無害化和資源化利用提供了基礎條件［21-22］。

本文以柚子皮為生物質(zhì)原料，嫁接Fe3O4磁性納米粒子制備磁性生物炭（MBC）復合材料，結合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）建立了一種準確、快速、簡便檢測水中氯胺酮的方法。方法具有分析時間短、分離能力強、定性分析結果可靠、檢出限低的優(yōu)點。同時，該法成本較低、原料簡單易得、綠色環(huán)保，利于推廣使用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API4000Qtrap超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司），ZeissGenimi500場發(fā)射掃描電鏡（德國Zeiss公司），NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），RenishawinVia拉曼光譜儀（英國Renishaw公司），LakeShore7404振動樣品磁強計（美國LakeShore公司），ME-204分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

氯胺酮標準品（C13H16ClNO，純度＞99．0%）由CFW Laboratories，Inc．（美國紐瓦克）提供；甲醇、甲酸（色譜純，霍尼韋爾（中國）有限公司）；乙酸銨（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）。實驗所用其它化學品均為分析級，無需進一步純化。柚子購自中國重慶。

1.2 磁性生物炭的制備

柚子皮切成小塊，用超純水洗滌除去雜質(zhì)，于80℃下干燥48 h。將干燥的柚子皮塊研磨成細粉后浸入8 mol/L KOH溶液（質(zhì)量比1∶1）中30 min。將1．8 g FeCl2·4H2O和4．0 g FeCl3·6H2O放入裝有機械攪拌器的三口燒瓶中，在通氮氣條件下，加入60 mL超純水，加熱至60℃并保持30 min。然后，向混合反應體系中加入20 mL 28%NH3·H2O，攪拌40 min，制備得到Fe3O4。將所得產(chǎn)物通過外部磁場從反應介質(zhì)中分離，并用乙醇和超純水反復洗滌，直至濾液達到恒定的pH值。最后，將磁性產(chǎn)物在60℃真空烘箱中干燥。

將Fe3O4和10．0 g KOH活化柚子皮粉末浸入100 mL純水中，室溫下攪拌12 h，沉淀物經(jīng)外部磁鐵分離并在60℃真空下干燥。隨后將混合物放入管式爐慢速熱解（氮氣保護下的加熱速率為5℃/min），并于600℃下連續(xù)熱解2 h，使其熱解完全。冷卻至室溫后，將熱解產(chǎn)物浸入1 mol/L HCl中去除堿等雜質(zhì)，用乙醇和超純水反復洗滌，直至濾液pH值為中性，干燥，研磨并儲存于干燥器中。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色 譜 柱：美 國Waters ACQUITY UHPLC?BEH C18（100 mm×2．1 mm內(nèi) 徑，1．7 μm），柱溫：40℃。流動相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液（含0．1%甲酸），流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0~1 min，10%B；1~3．5 min，10%~90%B；3．5~5 min，90%B；5~5．5 min，90%~10%B。進樣量為5 μL，流速為0．3 mL·min-1。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）用于質(zhì)譜檢測，多反應監(jiān)測模式（MRM）用于監(jiān)測分析物。碰撞室入口電壓為10．0 V，離子源溫度為550℃，氣幕氣壓、霧化氣壓和輔助氣壓分別為0．21、0．34、0．34 MPa。氯胺酮的最佳質(zhì)譜參數(shù)為：保留時間1．26 min，母離子為m/z237．8，定量和定性子離子分別為m/z124．8和219．8，去簇電壓（DP）分別為25、20 V，碰撞能（CE）分別為24、14 V。在最佳條件下，可獲得尖銳，較為對稱的色譜峰形。

1.4 樣品處理

將水樣過濾后量取100 mL，加入適量吸附劑充分振蕩，然后利用外磁場將吸附劑與水樣分離，最后以解吸溶劑洗脫吸附劑上的氯胺酮。解吸溶液經(jīng)0．22 μm微孔濾膜過濾后，應用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 磁性生物炭的表征分析

2.1.1 掃描電鏡分析由圖1A可知Fe3O4納米粒子呈近似球形。磁性生物炭的掃描電鏡圖（圖1B）顯示，磁性生物炭表面缺陷較多，具有粗糙的三維立體結構，有利于增大生物炭的總比表面積。在50 000倍放大倍數(shù)下可以清晰觀察到Fe3O4納米粒子成功附著在生物炭表面（圖1C），證明磁性生物炭成功合成。

圖1 Fe3O4（A）和MBC（B~C）的掃描電鏡圖Fig．1 SEM images of Fe3O4（A）and MBC（B-C）B．1 200×，C．50 000×

2.1.2 振動樣品磁強計表征MBC在常溫條件下的磁滯回線呈光滑的S形（圖2），磁場強度達到一定值后，呈飽和磁化狀態(tài)，磁化強度不隨磁場強度的增大而變化，磁性生物炭的飽和磁化強度值為24．22 emu/g。當磁場強度減小到0時，磁化強度并不為0；繼續(xù)增加反向磁場，鐵磁材料達到反向飽和磁化狀態(tài)，說明其具有良好的磁響應性，在外部磁場下，可與樣品溶液有效分離。

圖2 磁性生物炭的磁滯回線Fig．2 Hysteresis loop of magnetic biochar

2.2 單因素實驗優(yōu)化

為了實現(xiàn)磁性生物炭對樣品的高效吸附，對吸附劑用量、吸附時間、溶液pH值進行了優(yōu)化。

2.2.1 吸附劑用量吸附劑用量是吸附過程中需要考慮的主要因素。通過測定萃取回收率對不同用量（1~9 mg）的磁性生物炭材料進行考察。由于MBC提供了豐富的活性吸附位點，萃取回收率隨著磁性生物炭量的增加而增加。當吸附劑用量為7 mg時，活性位點飽和，氯胺酮的萃取回收率最高；進一步增加MBC用量，氯胺酮的回收率反而下降。故選擇7 mg為最佳吸附劑用量。

2.2.2 吸附時間要達到良好的萃取效果需要充分的吸附時間，考察了振蕩時間為10~60 min時磁性生物炭的吸附效率。實驗結果顯示，初始階段回收率隨時間延長緩慢增加，隨著越來越多的吸附位點被占據(jù)，在50 min時吸附劑與被分析物之間達到吸附平衡，萃取效率不再隨時間的增加而變化。因此，選擇50 min為最佳吸附時間。

2.2.3 溶液pH值由于溶液的pH值對分析物的存在形式（解離或非解離）和吸附劑表面的電荷密度有較大影響，因此溶液的pH值在吸附過程中對萃取效率起著關鍵作用。氯胺酮pKa值為7．5，磁性生物炭的零點電荷為8．9。通過氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值考察了pH 2．0~12．0條件下氯胺酮的回收率（圖3），結果顯示，pH 9．0時吸附性能最佳，此時磁性生物炭表面帶正電，氯胺酮呈解離狀態(tài)，表面帶負電，兩者間以靜電吸附為主要作用力，吸附量大，回收率高。

圖3 溶液pH值對氯胺酮回收率的影響Fig．3 Effect of solution pH value on ketamine recovery

2.3 Box-Behnken設計實驗

在預實驗和單因素優(yōu)化實驗過程中發(fā)現(xiàn)MBC對氯胺酮具有很好的吸附性，吸附后的樣品中未檢出氯胺酮。解吸實驗發(fā)現(xiàn)甲醇-甲酸（95∶5，體積比）對氯胺酮有較高的回收率。因此，基于甲醇-甲酸混合溶液的Box-Behnken設計實驗對解吸條件進一步優(yōu)化，以解吸溶劑甲酸占甲醇的比例（A，%）、解吸體積（B，mL）、解吸時間（C，min）為連續(xù)變化的自變量，以氯胺酮的回收率為考察指標（響應值），在置信度為95%（α=0．05）條件下，設置三因素三水平的設計實驗。吸附條件：氯胺酮 為10 μg·L-1，在25℃恒 溫振蕩器中以155 r·min-1進行振蕩。所有實驗均進行3個平行，對照實驗在不添加吸附劑的條件下同時進行。表1詳細列出了設計矩陣和階乘水平，根據(jù)表1設置三因素三水平17次隨機實驗（表2）。

表1 響應面優(yōu)化實驗表Table 1 Response surface optimization experiment

2.3.1 方差分析根據(jù)表2結果，對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，建立回歸模型，得到殘差分析線性方程為Y=95．49-1．32A+1．78B+1．90C-0．39AB+6．62AC+2．57BC-3．81A2-5．01B2-10．31C2。方程中的正號表示參數(shù)之間的協(xié)同作用，負號表示拮抗作用。

表2 三因子Box-Behnken實驗設計（n=3）Table 2 Box-Behnken experiment design with three independent variables（n=3）

對實驗結果分別進行方差分析（ANOVA），通過F檢驗和P值評估模型的顯著性和適用性。方差分析結果如表3所示，該模型F值（15．31）大于臨界值F0．05（2，14）=3．739，P值小于0．01，表明差異極顯著，模型能夠準確預測變異量，建模成功。失擬項P值為0．675 6，差異不顯著，表明本研究所得方程與實際實驗擬合中的非正常誤差所占比例較小，可以用該回歸方程取代實驗中的真實點對結果進行分析。

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

（續(xù)表3）

2.3.2 各因素交互作用分析根據(jù)回歸分析結果繪制解吸溶劑甲酸比例、解吸體積、解吸時間三因素對氯胺酮回收率影響的響應面圖及等高線圖（圖4）。

圖4 交互作用對氯胺酮回收率的響應面圖及等高線圖Fig．4 The response surface plots and contour maps of the interaction on the recovery of ketamine

由圖可看出，甲酸比例與解吸體積、甲酸比例與解吸時間、解吸體積與解吸時間的響應面圖均呈凸形曲面。圖4A曲面較緩，表明甲酸比例與解吸體積的交互作用相對不明顯；圖4B、4C響應面圖曲面較陡且等高線圖呈橢圓形，表明甲酸比例和解吸時間交互作用相對明顯，而解吸體積和解吸時間交互作用最明顯，與方差分析表一致。通過統(tǒng)計軟件Design-Expert對模型進行優(yōu)化和求解，得到水中氯胺酮的最佳檢測條件為：解吸劑（V甲酸∶V甲醇=5∶95）、解吸劑體積5．6 mL、解吸時間53 min。

2.4 檢出限與定量下限

在最優(yōu)條件下對所建立的方法進行評估，并分別以信噪比（S/N）約為3和10計算檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。在1~100 μg·L-1線性范圍內(nèi)，氯胺酮的峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）呈良好的線性關系Y=35．3X，相關系數(shù)（r）為0．999 7，LOD和LOQ分別為0．263 μg·L-1和0．878 μg·L-1。

2.5 實際樣品分析

采用所建立的方法測定3種不同水樣（自來水、礦泉水、純凈水）中氯胺酮的含量，結果均未檢出。自來水樣品中氯胺酮的加標（10 μg·L-1）色譜圖如圖5所示。向3種陰性水樣中分別添加1、10、20、50 μg·L-14個水平的氯胺酮標準溶液，在最佳條件下考察方法的回收率和相對標準偏差（RSD），樣品回收率結果見表4。氯胺酮在3種樣品中的回收率為84．0%~99．9%，其日內(nèi)和日間RSD分別為0．40%~3．4%和0．25%~1．9%。表明該方法具有良好的準確性和精密度，可用于水中氯胺酮含量的檢測。

圖5 自來水樣品加標（10 μg·L-1）色譜圖Fig．5 Chromatogram of a spiked（10 μg·L-1）tap water sample

表4 樣品加標回收率及相對標準偏差Table 4 The recoveries and relative standard deviations of actual samples

3 結論

本實驗以磁性生物炭為吸附劑萃取水中的氯胺酮，并結合超高效液相色譜-質(zhì)譜進行測定。優(yōu)化的條件為：磁性生物炭材料用量為7 mg、吸附時間50 min、溶液pH值9．0、解吸劑（V甲酸∶V甲醇=5∶95）、解吸劑體積5．6 mL、解吸時間53 min。結果表明，所建立的方法具有良好的重復性和準確度，方法簡便、快速、準確，滿足實際檢測要求，適用于水中氯胺酮的檢測，為我國質(zhì)檢部門在食品監(jiān)管、打擊飲用水中非法添加物和禁毒方面的工作提供了技術參考。