固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物

馬麗莎，鄭光明，尹 怡，謝文平，單 奇，林嘉薇，李麗春，劉書貴，趙 城，戴曉欣，魏琳婷

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外來(lái)入侵水生生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫與綠色養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380）

稻漁綜合種養(yǎng)模式是我國(guó)主推的水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色生產(chǎn)技術(shù)，然而農(nóng)藥污染卻對(duì)其混養(yǎng)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全造成潛在威脅。氟蟲腈是一種昆蟲γ-氨基丁酸受體阻滯劑［1］，因具有廣譜、高效的殺蟲活性而在世界范圍內(nèi)得到廣泛使用。但氟蟲腈具有環(huán)境持久性、生物蓄積性、高毒性等均危害［2-3］，且在環(huán)境中可代謝成強(qiáng)于自身毒性的氟甲腈、氟蟲腈砜等代謝物［4］。因此，歐盟、美國(guó)及我國(guó)等均制定了食品中氟蟲腈的最大殘留限量［5-6］，同時(shí)歐盟及我國(guó)嚴(yán)禁在水稻等農(nóng)作物病蟲害防治上使用氟蟲腈［7-8］。但目前我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中仍有檢出氟蟲腈及其代謝物的報(bào)道［9］，表明我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中存在氟蟲腈超劑量、超范圍使用的問(wèn)題。噴灑于農(nóng)作物的氟蟲腈有60%~98%滯留于土壤或空氣粉塵中［10］，可通過(guò)降水、灌溉、浸出等形式遷移至水環(huán)境中［11］，在稻漁水產(chǎn)品中形成富集，從而引發(fā)稻漁水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題，再經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康。

目前國(guó)內(nèi)外水體中氟蟲腈及其代謝物的測(cè)定多集中于江河、城市污水及養(yǎng)殖水體等［12-15］，尚無(wú)稻漁水體的研究報(bào)道。稻漁水體受農(nóng)業(yè)及漁業(yè)活動(dòng)的雙重影響，富含土壤微粒、藻類、脂類、色素及腐殖酸等干擾物，其基質(zhì)成分與上述水體差異較大，故文獻(xiàn)方法不一定適用于稻漁水體。鑒于氟蟲腈已受到全球監(jiān)管系統(tǒng)的高度關(guān)注［16］，歐盟“毒雞蛋事件”更將其推上風(fēng)口浪尖，而我國(guó)稻漁水體可能已受到氟蟲腈污染，且農(nóng)藥污染主要通過(guò)養(yǎng)殖水體遷移至水產(chǎn)品中，因此為保障我國(guó)稻田漁業(yè)的綠色發(fā)展，建立稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

水樣中農(nóng)藥殘留分析的前處理方法有液液萃取法、吹掃捕集法、固相萃取法（SPE）及固相萃取膜片法等，但液液萃取法存在有機(jī)溶劑用量大、操作復(fù)雜、易乳化等缺點(diǎn)，吹掃捕集法及固相萃取膜片法的價(jià)格較昂貴，而固相萃取法集富集與凈化為一體，具有溶劑用量少、價(jià)格低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于水樣前處理。本研究采用SPE/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析稻漁水體中的氟蟲腈及其代謝物，方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、高效，方法檢出限為0．5 ng/L，低于環(huán)境水體中氟蟲腈及其代謝物的常見(jiàn)濃度（1．5~200 μg/L）［13］。方法的建立可為稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估提供技術(shù)支撐，對(duì)控制和監(jiān)管稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物殘留，確定其對(duì)稻漁水產(chǎn)品的安全隱患具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫6470三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）；12通道半自動(dòng)固相萃取裝置（美國(guó)嘉仕達(dá)公司）；Supelco ENVI-18 SPE柱（500 mg/3 mL，美國(guó)Supelco公司）；Oasis HLB SPE柱（500 mg/6 mL，美國(guó)沃特世公司）；Bond Elut SAX SPE柱（500 mg/6 mL，美國(guó)安捷倫公司）；Whatman玻璃纖維濾紙（1．6、0．7 μm，英國(guó)沃特曼公司）；混合纖維素酯微孔濾膜（0．8 μm，上海興亞凈化材料廠）；C18固相萃取膜片（47 mm，德國(guó)Sigma-Aldrich公司）。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99%，德國(guó)Dr．Ehrenstorfor公司）；乙腈、二氯甲烷（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制分別稱取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜及氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0．01 mg），用乙腈定容至10 mL，配制成1．0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

空白基質(zhì)提取液：陰性樣品按照“1．2．2”和“1．2．3”條件進(jìn)行前處理，獲得空白基質(zhì)提取液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈定容為1 000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用前以空白基質(zhì)提取液配制成0．5~100 ng/mL的工作曲線溶液。

1.2.2 水樣的采集與過(guò)濾采集表層（0~0．5 m）水樣，經(jīng)1．6 μm玻璃纖維濾紙過(guò)濾去除較大雜質(zhì)，再經(jīng)0．7 μm玻璃纖維濾紙過(guò)濾后，備用。

1.2.3 樣品的濃縮依次用6 mL乙腈和6 mL去離子水活化Supelco ENVI-18 SPE柱，量取500 mL水樣以約3 mL/min過(guò)柱，再用6 mL去離子水淋洗SPE柱，棄去流出液后抽干，最后用9 mL乙腈洗脫。洗脫液置于50℃氮吹儀吹干，用乙腈定容至0．5 mL，過(guò)有機(jī)膜，待測(cè)。

1.2.4 UPLC-MS/MS條件色譜柱：安捷倫SB-C18柱（2．1 mm×100 mm，1．8 μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A為0．1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸銨），B為乙腈；梯度洗脫條件：0~1 min，40% B；1~4 min，40%~80% B；4~6 min，80% B；6~6．1 min，80%~40% B；6．1~8 min，40% B；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0．4 mL/min。

離子源：電噴霧電離源，負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；鞘氣溫度：350℃，噴霧電壓：3 500 V，鞘氣流速：12 L/min，干燥氣流速：10 L/min，霧化氣壓力：3．10×105Pa，離子源溫度：325℃。目標(biāo)化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for fipronil and its metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 濾膜的選擇玻璃纖維濾紙及混合纖維素酯濾膜均可用于水樣預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻漁水樣較混濁，含大量土壤微粒、藻類等雜質(zhì)，采用混合纖維素酯濾膜過(guò)濾水樣時(shí)雜質(zhì)會(huì)堵塞濾膜導(dǎo)致流速較慢，而玻璃纖維濾紙過(guò)濾水樣時(shí)無(wú)堵塞且流速較快。這可能與玻璃纖維濾紙具有毛細(xì)纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)，與同等纖維素濾紙相比，玻璃纖維濾紙可吸附更多水分，且其聚酯分隔層使其具有較強(qiáng)通透性利于液體濾過(guò)。故實(shí)驗(yàn)選用玻璃纖維濾紙。

2.1.2 萃取方式的選擇固相萃取法具有溶劑用量少、操作方便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是環(huán)境水樣常用的前處理方法。固相萃取膜片（SPE disk）是近年環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域備受關(guān)注的固相萃取技術(shù)，其流速可達(dá)10~100 mL/min，尤其適用于大體積水樣中殘留物的萃取。實(shí)驗(yàn)分別于500 mL陰性稻漁水樣中添加5 ng氟蟲腈及其代謝物，分別采用上述兩種方法萃取水樣中的目標(biāo)物，并比較兩者的回收率、實(shí)驗(yàn)效率及性價(jià)比。結(jié)果表明：SPE及SPE disk法［13］的回收率均在70%~120%之間，SPE disk法的實(shí)驗(yàn)效率為SPE法的4倍，但其膜片的價(jià)格為SPE柱的10倍，且SPE disk法一次僅能處理1個(gè)水樣，SPE法一次可同時(shí)處理24個(gè)水樣。可見(jiàn)當(dāng)取樣量較少時(shí)，SPE disk法的優(yōu)勢(shì)并不明顯，SPE法的性價(jià)比相對(duì)較高，故實(shí)驗(yàn)選擇SPE法。

2.1.3 固相萃取柱的選擇氟蟲腈及其代謝物為親脂性化合物［15］，Oasis HLB小柱可保留親水和親脂的化合物，被用于江河、養(yǎng)殖水體等環(huán)境水體中氟蟲腈及其代謝物的測(cè)定［12，14］。但實(shí)驗(yàn)表明：Oasis HLB小柱對(duì)稻漁水樣的凈化效果差，定容液渾濁呈黃色，總離子流圖（TIC）基線噪音大，基質(zhì)效應(yīng)大于50%。這可能與稻漁水樣富含親水、親脂性的脂類、色素、腐殖酸等干擾物有關(guān)。稻漁水樣受農(nóng)業(yè)活動(dòng)的影響，含有的色素、腐殖酸等雜質(zhì)多于江河、養(yǎng)殖水體等，而芳香結(jié)構(gòu)的腐殖酸極性強(qiáng)，聚脂肪結(jié)構(gòu)的腐殖酸極性較低［17］，Oasis HLB小柱在富集目標(biāo)化合物的同時(shí)也吸附了脂類、色素、腐殖酸等干擾物，強(qiáng)極性的乙腈可洗脫極性較大的色素及腐殖酸，因此Oasis HLB小柱的洗脫液呈黃色，其不適用于稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物的分析。

鑒于氟蟲腈及其代謝物呈弱酸性，在堿性環(huán)境下易解離、極性偏弱［18-19］，實(shí)驗(yàn)分別選用對(duì)弱極性化合物有強(qiáng)保留作用的Supelco ENVI-18 SPE柱及可萃取水樣中弱酸性化合物的Bond Elut SAX強(qiáng)陰離子交換SPE柱凈化稻漁水樣并富集目標(biāo)物。結(jié)果顯示：兩柱對(duì)稻漁水樣的凈化效果均較好，定容液清澈透明，TIC圖基線噪音較小。但Bond Elut SAX柱對(duì)目標(biāo)物的回收率偏低，為27．5%~87．3%，而Supelco ENVI-18 SPE柱的回收率為92．4%~101%，基質(zhì)效應(yīng)的絕對(duì)值為0．30%~38%，符合農(nóng)藥殘留分析要求?？梢?jiàn)，Supelco ENVI-18 SPE柱更適用于稻漁水樣中氟蟲腈及其代謝物的測(cè)定，其在富集目標(biāo)物的同時(shí)雖也吸附了稻漁水樣中脂類、腐殖酸等弱極性干擾物，但乙腈對(duì)這些弱極性干擾物的洗脫能力較小，因此乙腈洗脫溶液清澈透明，質(zhì)譜圖基線噪音較小。故實(shí)驗(yàn)選用Supelco ENVI-18柱。

2.1.4 固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化洗脫劑是決定回收率的關(guān)鍵因素。氟蟲腈及其代謝物與乙腈均含有—CN基團(tuán)，易被乙腈萃取出來(lái)［20］。但氟蟲腈及其代謝物的極性偏低，考慮到極性較大的乙腈對(duì)其溶解度可能較差，洗脫難度較大。故實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、乙腈-二氯甲烷（8∶2，體積比，下同）、乙腈-二氯甲烷（6∶4）3種不同極性溶劑的洗脫效果（見(jiàn)圖1）。結(jié)果顯示，乙腈洗脫的回收率優(yōu)于其余兩種洗脫溶劑，這可能與乙腈和目標(biāo)物含相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。有機(jī)溶劑的極性及化學(xué)結(jié)構(gòu)均能影響其對(duì)目標(biāo)物的洗脫效率，3種洗脫溶劑中乙腈-二氯甲烷（6∶4）的乙腈含量最低，因此其對(duì)目標(biāo)物的洗脫效果最差。故實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為洗脫溶劑，并在洗脫前用6 mL去離子水淋洗SPE柱，以除去富集在小柱上的水溶性雜質(zhì)。

圖1 3種洗脫溶劑對(duì)氟蟲腈及其代謝物的回收率比較Fig．1 Comparison of the three elution solvents on recoveries of fipronil and its metabolites

2.1.5 氮吹溫度的選擇氮吹溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物降解，影響回收率，過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致濃縮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，降低實(shí)驗(yàn)效率，故選擇合適的氮吹溫度十分重要。考察了不同氮吹溫度（30、40、50、60℃）對(duì)氟蟲腈及其代謝物回收率的影響（圖2），發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)禍囟葹?0℃時(shí)，目標(biāo)物的回收率下降明顯；氮吹溫度為50℃時(shí)，不僅可獲得良好的回收率（91．8%~106%），還可縮短氮吹時(shí)間，故選擇氮吹溫度為50℃。

圖2 氮吹溫度對(duì)稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig．2 Effects of nitrogen blowing temperatures on recoveries of fipronil and its metabolites in rice fishing water

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

采用ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1）×100%的計(jì)算方法［21］考察基質(zhì)效應(yīng)（ME）。若|ME|＜20%，表明存在較弱的基質(zhì)效應(yīng)；若20%＜|ME|＜50%，表明存在中等的基質(zhì)效應(yīng)；若|ME|＞50%，表明存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示：氟蟲腈及其代謝物在稻漁水樣的|ME|為0．30%~38%（見(jiàn)表2），表明稻漁水樣對(duì)目標(biāo)物存在基質(zhì)影響，因此實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量下限用空白樣品的提取溶液分別配制氟蟲腈及其代謝物的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度為0．5、1、2、5、20、100 ng/mL，按“1．2．4”條件進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，并分別以信噪比S/N≥3和S/N≥10確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，氟蟲腈及其代謝物在0．5~100 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0．998，檢出限均為0．5 ng/L，定量下限均為1．5 ng/L（見(jiàn)表2）。

表2 氟蟲腈及其代謝物的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear relations，matrix effects，LODs，LOQs，recoveries and relative standard deviations of fipronil and its metabolites

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在空白稻漁水樣中分別添加3個(gè)不同濃度水平的氟蟲腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為81．6%~105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3．5%~7．0%，方法準(zhǔn)確度和精密度均滿足分析要求。加標(biāo)稻漁水樣的提取離子色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 稻漁水樣（加標(biāo)量為50 ng/L）的提取離子色譜圖Fig．3 Extracted ion chromatograms of fipronil and its metabolites of rice fishing water samples（spiked 50 ng/L）

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，采用本方法對(duì)采集于廣東省稻漁綜合種養(yǎng)池塘的13份稻漁水樣進(jìn)行分析。結(jié)果顯示有1份水樣檢出氟蟲腈及氟蟲腈砜，質(zhì)量濃度分別為1．03、1．71 ng/L，而作者在稻漁水產(chǎn)品［22］及稻漁土壤［23］中也檢出氟蟲腈及其代謝物，表明我國(guó)部分稻漁水產(chǎn)品可能已受到氟蟲腈及其代謝物的影響，建議進(jìn)一步加強(qiáng)其在稻漁水產(chǎn)品及稻漁養(yǎng)殖環(huán)境中殘留量的監(jiān)控。

3 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物的SPE/UPLC-MS/MS法。方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、價(jià)格低廉、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)普及推廣的潛力，可滿足稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物殘留的監(jiān)測(cè)需要，適用于稻漁水體中氟蟲腈及其代謝物殘留的批量分析。