QuEChERS-超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定鮮蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物

熊 雯 易路遙 晏 亮 程一鑫 楊婷婷 郭春梅 虞雪軍 章 紅

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心, 南昌 330029)

氟蟲(chóng)腈，英文通用名為fipronil，商品名為銳勁特(Regent)，分子式：C12H4Cl2F6N4OS，分子量：437.2，是由原法國(guó)羅納-普朗克公司于1987年開(kāi)發(fā)的苯基吡唑類(lèi)高效廣譜性殺蟲(chóng)劑。

氟蟲(chóng)腈在環(huán)境中主要以水解、光解及微生物降解為主，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物有9種[1]，其中，氟蟲(chóng)腈砜、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈亞砜是目前關(guān)注最多的三種代謝物[2-4]。在大鼠、小鼠以及人體內(nèi)，氟蟲(chóng)腈的主要代謝產(chǎn)物是氟蟲(chóng)腈砜[5]，在植物、土囊代謝中，氟甲腈是最重要的光解產(chǎn)物[6]；在水生態(tài)中，通過(guò)生物與非生物共同作用，氟蟲(chóng)腈主要降解成氟甲腈、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈砜[7，8]。研究表明，氟蟲(chóng)腈砜作用于γ-氨基丁酸受體，毒性比母體大6倍； 氟甲腈對(duì)小鼠及家蠅的毒性與氟蟲(chóng)腈差不多；然而這3種代謝產(chǎn)物都不容易進(jìn)一步降解 ，因此對(duì)環(huán)境危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于母體氟蟲(chóng)腈[6,9，10]。

2017年8月，持續(xù)發(fā)酵的“毒雞蛋”事件，在45個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)了受氟蟲(chóng)腈污染的雞蛋或蛋品，包括歐盟26國(guó)、中國(guó)香港、美國(guó)、俄羅斯、南非和土耳其等國(guó)家或地區(qū)。針對(duì)蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的限量，我國(guó)暫未做出規(guī)定，GB2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中僅規(guī)定了氟蟲(chóng)腈(以氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜之和計(jì))在24項(xiàng)植物源性食品中殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，限量在0.02～0.1mg/kg之間[11]；中國(guó)香港特別行政區(qū)《食物內(nèi)除害劑殘余規(guī)例》規(guī)定了蛋類(lèi)氟蟲(chóng)腈(以氟蟲(chóng)腈與氟蟲(chóng)腈砜之和計(jì))最大殘留限量為0.02mg/kg[12]；澳大利亞新西蘭食品管理局規(guī)定蛋類(lèi)氟蟲(chóng)腈(以氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜之和計(jì))最大殘留限量為0.02mg/kg[13]；日本肯定列表中規(guī)定蛋類(lèi)氟蟲(chóng)腈最大殘留限量為0.02mg/kg[14]；歐盟規(guī)定蛋類(lèi)氟蟲(chóng)腈(以氟蟲(chóng)腈與氟蟲(chóng)腈砜之和計(jì))最大殘留限量為0.005mg/kg[15]。

QuEChERS方法是一種簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力、廉價(jià)、成本低、試劑用量小、檢測(cè)范圍廣、高效的樣品前處理技術(shù)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜因其高選擇性、高靈敏度成為農(nóng)藥殘留分析中最常用的檢測(cè)技術(shù)。目前QuEChERS結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已被國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥獸藥殘留分析機(jī)構(gòu)廣泛采納。本實(shí)驗(yàn)采用Querchers方法對(duì)雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋進(jìn)行前處理，運(yùn)用液相串聯(lián)質(zhì)譜三重四級(jí)桿的MRM模式檢測(cè)氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物，并采集雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋共159批次樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-TQS質(zhì)譜儀，色譜柱-C18(美國(guó)Waters)；離心機(jī)(美國(guó)ThermoFisher)；渦旋混合器(德國(guó)IKA)。

氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度均大于98%；氟甲腈購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，含量100mg/L；乙腈、甲醇等有機(jī)試劑均為色譜純(Sigma)；NaCl為分析純(國(guó)藥集團(tuán))；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)(島津公司)

1.2 材料

雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋(市售)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品10mg于100mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解，用乙腈定容至刻度，配制濃度為100 mg/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20℃條件下儲(chǔ)存。氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)混合使用液( 5 mg/L) 由乙腈稀釋氟蟲(chóng)腈及其代謝物單標(biāo)儲(chǔ)備液制得。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液適量，置10ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度,搖勻得到10，20，50，100，200和500μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于 4 ℃ 條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色譜柱；柱溫30℃；進(jìn)樣量:2μL；流動(dòng)相:A相為水，B相為乙腈。流速：0.4mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的洗脫程序

離子源：ESI源；掃描方式：MRM負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：1500V；干燥氣溫度500℃，干燥氣流速800L/h；錐孔氣流速 150L/h；氟蟲(chóng)腈及其代謝物的質(zhì)譜信息見(jiàn)表2。

表2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的質(zhì)譜信息

續(xù)表2

1.5 樣品前處理

稱(chēng)取5g經(jīng)均漿后的樣品，準(zhǔn)確加入5mL1%甲酸水溶液，振蕩30s，加入3.0g NaCl，渦旋30s，8000r/min離心5min，取1mL上清液，待凈化。將1mL上清液轉(zhuǎn)移至2mL凈化管中(含PSA 50mg、C1850mg、MgSO4100mg)，渦旋30s，10000r/min 離心1min，取上清液，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道[4,16,17]的氟蟲(chóng)腈及其代謝物的提取溶劑一般采用乙腈、酸化乙腈、乙腈水溶液,考慮鮮蛋含水量超過(guò)80%，實(shí)驗(yàn)僅考察了乙腈、含1%甲酸乙腈以及含5%甲酸乙腈的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純乙腈對(duì)4個(gè)化合物的平均提取率僅為79.3%，而酸化乙腈具有較好的提取效果。這可能是由于氟蟲(chóng)腈及其代謝物屬于弱堿性化合物，更易溶于酸性溶劑的原因。對(duì)比含1%甲酸乙腈與含5%甲酸乙腈，發(fā)現(xiàn)兩種溶劑提取效果相差無(wú)幾，各化合物回收率均達(dá)83%以上。因此，選用含1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 氯化鈉質(zhì)量的選擇

鮮蛋經(jīng)1%甲酸乙腈振蕩提取，得到乙腈水混合提取溶液，加入一定量的氯化鈉鹽析分層，能使乙腈層更好的沉淀鮮蛋中的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)采用5mL1%甲酸乙腈溶液，3g氯化鈉，發(fā)現(xiàn)乙腈與水溶液能快速分層，目標(biāo)物回收率均達(dá)到85%以上，且乙腈層較為澄清。

2.3 QuEChERS凈化條件的優(yōu)化

PSA通過(guò)氫鍵和化合物作用，可去除脂肪酸、部分有機(jī)酸、糖和色素。C18吸附劑是在硅膠基質(zhì)上接有十八烷基，對(duì)油脂、甾醇和維生素的去除效果顯著。結(jié)合鮮蛋基質(zhì)特性以及氟蟲(chóng)腈類(lèi)化合物的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用混合型凈化劑結(jié)合無(wú)水硫酸鎂進(jìn)一步除水，并對(duì)PSA、C18和無(wú)水硫酸鎂用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明50mgPSA，50mgC18、100mg無(wú)水硫酸鎂時(shí)目標(biāo)化合物平均回收率最高，同時(shí)各化合物的回收率均到達(dá)88%以上，本實(shí)驗(yàn)室采用該組合作為最佳QuEChERS凈化劑。

2.4 色譜條件的選擇和優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色譜柱，考察了甲醇-水與乙腈-水兩種流動(dòng)相，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-水作為流動(dòng)相，化合物整體峰型較好；部分文獻(xiàn)報(bào)道水相溶劑添加甲酸，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)水相添加甲酸后，氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜響應(yīng)略有抑制，尤其是氟蟲(chóng)腈，其響應(yīng)值降低更為明顯。因此，選用乙腈-水作為流動(dòng)相。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的離子流圖見(jiàn)圖1。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍與檢出限

選用不含待測(cè)組分的空白基質(zhì)樣品，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10、20、50、100、200和500μg/L)各500μL，渦旋混勻，靜置30min后，經(jīng)1.5節(jié)樣品前處理，獲得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為1、2、5、10、20和50μg/kg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以峰面積為縱坐標(biāo)y，濃度為橫坐標(biāo)x，各目標(biāo)化合物在1～50μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r) 為0.9960～0.9981。在基質(zhì)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比 S/N≥3確定方法檢出限(LOD)，氟蟲(chóng)腈及其代謝物方法檢出限達(dá)到0.1～0.2μg/kg，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的離子流圖

名稱(chēng)基質(zhì)線性回歸方程相關(guān)系數(shù)r檢出限(LOD)氟蟲(chóng)腈溶劑y=10351.4x-286.2190.99880.1雞蛋y=10167.2x+788.3410.99770.1氟甲腈溶劑y=5984.42x+168.4050.99910.2雞蛋y=6001.76x-771.7260.99810.2氟蟲(chóng)腈亞砜溶劑y=5263.13x+101.5020.99890.2雞蛋y=4848.05x+631.8010.99600.2氟蟲(chóng)腈砜溶劑y=10803.5x+783.4630.99830.1雞蛋y=9908.57x+824.8450.99710.1

2.5.2回收率

以空白樣品做添加回收實(shí)驗(yàn)，在雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋空白樣品中分別添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平分別為5、10、20μg/kg)，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)平行樣，按上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的回收率。三類(lèi)鮮蛋產(chǎn)品中，氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的回收率在88.1%～110.5%之間，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同基質(zhì)中各化合物的回收率

續(xù)表4

2.6 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中的基質(zhì)效應(yīng)由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現(xiàn)為離子增強(qiáng)或抑制作用[18]。實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率考察不同化合物的基質(zhì)效應(yīng)，其比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小[19]。分別比較純?cè)噭┖碗u蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋三種不同基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，在3種鮮蛋基質(zhì)中，氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的基質(zhì)效應(yīng)在85.5%～108.2%之間，基質(zhì)效應(yīng)均不明顯，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同基質(zhì)中各化合物的基質(zhì)效應(yīng)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)在江西省3個(gè)城市抽取了159批次樣品進(jìn)行了氟蟲(chóng)腈及代謝物的監(jiān)測(cè)，包括85批次雞蛋、43批次鴨蛋、31批次鵪鶉。其中，13批次雞蛋檢出氟蟲(chóng)腈砜，含量在0.00056～0.0012mg/kg之間；14批次鴨蛋檢出氟甲腈, 含量在0.00050～0.0011mg/kg之間；7批次鵪鶉蛋檢出氟蟲(chóng)腈砜，含量在0.00056～0.0021mg/kg之間。結(jié)果表明氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢出均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)際限量。

試驗(yàn)同時(shí)考察了氟蟲(chóng)腈代謝物在鮮蛋的分布情況，選擇含氟蟲(chóng)腈代謝產(chǎn)物的3批雞蛋、1批鴨蛋進(jìn)行了蛋黃、蛋清含量的比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅蛋黃檢出氟蟲(chóng)腈代謝產(chǎn)物，而蛋清未檢出該類(lèi)物質(zhì)。這這說(shuō)明氟蟲(chóng)腈代謝物易富集于蛋黃中。

3 結(jié)論

建立了針對(duì)3種鮮蛋基質(zhì)中氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的液相-質(zhì)譜的定量和定性方法，對(duì)提取試劑、凈化吸附劑條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)基質(zhì)效應(yīng)及方法學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)方法將QuEChERS 前處理與質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)鮮蛋中目標(biāo)化合物的快速準(zhǔn)確定量分析，在合理安排時(shí)間的情況下，3小時(shí)內(nèi)可以完成5～6批檢品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的準(zhǔn)確測(cè)定。