基于QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)八角中莽草毒素的研究

鐘玉心，王 宇，錢振杰，陳彥宏，張 輝，王 偉，何詠欣，楊嘉鑫威，龔海錕，徐振林

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2．廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511405；3．黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510700）

八角（Illicium verum Hook.f），也稱八角茴香（Illicium verum），為八角屬八角種植物，其種植歷史悠久，用途廣泛，在亞洲地區(qū)常用作烹飪調(diào)料［1］，因具有鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜功能，通常被當(dāng)作中藥用于治療嘔吐、胃痛［2］。同屬多種植物如莽草、野八角、日本莽草與八角形態(tài)相似，但均含有莽草毒素（Anisatin）（結(jié)構(gòu)式見圖1），因此具有不同程度的毒性，誤用會(huì)引起中毒［3］。莽草毒素屬于倍半萜內(nèi)酯神經(jīng)毒素，其半數(shù)致死量（LD50）為0．76 mg/kg［4］。在歐美地區(qū)，因飲用混淆或摻假了日本莽草（Illicium anisatum L.）的八角茴香茶引起的中毒事件時(shí)有報(bào)道［5］。在中國也發(fā)生過誤服莽草而導(dǎo)致的中毒事件［6］。由于八角與其偽品莽草等同科植物的外觀形態(tài)非常相似，僅從完整干果外觀難以將其準(zhǔn)確區(qū)分；對(duì)于缺乏形態(tài)特征的八角茴香粉，更無法通過外形鑒別真?zhèn)?，?dǎo)致八角產(chǎn)品易因原料誤摻莽草而引發(fā)中毒事件。因此，建立一種準(zhǔn)確的八角摻偽鑒別和質(zhì)量控制方法顯得尤為重要。

圖1 莽草毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig．1 Chemical structure of anisatin

目前，已有研究報(bào)道八角茴香及其偽品的鑒別方法，如采用形態(tài)學(xué)分析方法，通過熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡對(duì)八角及其偽品進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)鑒別［4，7］；采用頂空固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法比較八角茴香及其偽品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類與含量的差異［6］；基于八角茴香與偽品在毒性成分莽草毒素含量上的差異［8］，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對(duì)引起中毒的特征成分莽草毒素進(jìn)行定量分析［4］。其中，HPLC-MS/MS是最常用的八角偽品毒性成分檢測(cè)方法，可在中毒事故發(fā)生后早診斷早干預(yù)，降低莽草毒素中毒的死亡率。目前中國藥典僅規(guī)定了八角中反式茴香腦的含量［9］，而對(duì)莽草毒素尚未指定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。現(xiàn)有的HPLC-MS/MS法主要采用液液萃取、固相萃取的前處理方式，耗時(shí)較長。QuEChERS前處理技術(shù)具有快速、簡單、廉價(jià)、高效、安全的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析，在生物毒素領(lǐng)域也開始得到應(yīng)用［10］。本文基于QuEChERS前處理方法，建立了八角中莽草毒素的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，并用于市售八角茴香中莽草毒素含量的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：5230-87-5，純度97．4%）、甲酸（色譜純）（美國Sigma Aldrich公司）；甲醇、乙腈（LC/MS級(jí)，美國Thermo公司）；乙酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑公司）；QuEChERS鹽包（4．0 g無水硫酸鎂，1．0 g氯化鈉）、乙酸緩沖鹽萃取鹽包（6．0 g無水硫酸鎂，1．5 g乙酸鈉）、檸檬酸緩沖鹽萃取鹽包（4．0 g無水硫酸鎂，1．0 g氯化鈉，1．0 g二水合檸檬酸鈉，0．5 g檸檬酸氫二鈉）均購于美國Agilent公司；N-丙基乙二胺（PSA）、C18和石墨化碳黑（GCB）均購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用八角樣品均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB Sciex 5500 QTRAP，美國AB SCIEX公司）；電子天平（CP225D，德國Sartorius公司）；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）；高速冷凍離心機(jī)（Sorvall ST 16R，美國Thermo公司）；多位點(diǎn)渦旋振蕩器（Multi Reax，德國Heidolph公司）；圓周振蕩器（MA 3 basic，德國IKA公司）；Accucore aQ C18色譜柱（2．1 mm×150 mm，2．6 μm，美國Thermo公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1．0 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0．01 mg），以甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，于-20℃保存。

莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1．0 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取100 μL莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，于-20℃保存。

莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈稀釋定容，配制成1．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

稱取0．5 g樣品（精確至0．01 g）至50 mL具塞離心管中，加入1顆陶瓷均質(zhì)子、5 mL超純水、10 mL乙腈，渦旋提取10 min，加入乙酸緩沖鹽萃取鹽包，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min，以8 000 r/min離心3 min。吸取2 mL上清液至QuEChERS樣品凈化管中（內(nèi)含200 mg PSA、50 mg GCB），渦旋1 min，以8 000 r/min離心3 min，過0．22 μm有機(jī)微孔濾膜，供HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：Accucore aQ C18柱（2．1 mm×150 mm，2．6 μm）；流動(dòng)相：A為甲醇，B為含0．1%甲酸的水溶液；流速：0．3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40℃；梯度洗脫程序：0~4．0 min，95% B；4．0~7．0 min，95%~20% B；7．0~9．0 min，20% B；9．0~9．1 min，20%~95% B；9．1~12．0 min，95%B。

1.5.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；離子掃描模式：負(fù)離子模式（ESI-）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；離子源溫度：500℃；氣簾氣：206．8 kPa（30 psi）；離子化電壓：4 500 V；碰撞氣：55．2 kPa（8 psi）；輔助加熱器1（GS1）：344．7 kPa（50 psi）；輔助加熱器2（GS2）：344．7 kPa（50 psi）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex Analyst Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，Multi Quant（3．0．2）軟件處理數(shù)據(jù)，Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以甲醇-水（1∶1）為溶劑，配制100 ng/mL的莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入質(zhì)譜系統(tǒng)，進(jìn)行正負(fù)離子掃描，篩選母離子。結(jié)果表明：負(fù)離子模式下分子離子［M-H］-（m/z327．1）的響應(yīng)值最高。在-5~-50 eV范圍內(nèi)逐步改變碰撞能量，直至母離子強(qiáng)度為基峰強(qiáng)度的1/3，篩選出m/z297．1、126．9的子離子，組建MRM離子對(duì)，并優(yōu)化去簇電壓及碰撞能量。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 莽草毒素質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for anisatin

2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

考察了普通C18色譜柱和aQ柱對(duì)莽草毒素的分離效果，結(jié)果表明，兩者均可對(duì)莽草毒素進(jìn)行測(cè)定，但不同色譜柱上的峰形差別較大。莽草毒素在aQ色譜柱上的峰形尖銳，分離效果好，故選擇aQ柱作為分析柱?？疾炝艘译?水、甲醇-水、甲醇-0．1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的效果。結(jié)果表明，以乙腈-水為流動(dòng)相的分離效果較差，存在峰重疊現(xiàn)象，調(diào)節(jié)梯度洗脫程序也無法得到滿意的分離效果；而甲醇極性弱于乙腈，能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物和雜質(zhì)的分離；加入0．1%甲酸雖抑制了莽草毒素電離導(dǎo)致響應(yīng)有所降低，但可減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。故選擇甲醇-0．1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。在優(yōu)化洗脫程序下，莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液與加標(biāo)樣品的色譜圖見圖2。

圖2 莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）與加標(biāo)樣品（B）的色譜圖Fig．2 Chromatograms of anisatin standard solution（A）and a spiked sample（B）

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇QuEChERS常用的提取溶劑為甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。相較于其它提取溶劑，乙腈具有很好的破壁作用及無機(jī)鹽鹽析作用，加入無機(jī)鹽可使乙腈與水相分層，提高提取效率［11-12］。本實(shí)驗(yàn)首先考察了乙腈為提取溶劑時(shí)的提取效率；同時(shí)考察了加入1%乙酸對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示，乙腈的提取率達(dá)97%，而1%乙酸的加入對(duì)提取率的影響不明顯，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 緩沖鹽體系的選擇本實(shí)驗(yàn)比較了普通QuEChERS鹽包（1．0 g氯化鈉，4．0 g無水硫酸鎂）、乙酸緩沖鹽萃取鹽包（6．0 g無水硫酸鎂，1．5 g乙酸鈉）、檸檬酸緩沖鹽萃取鹽包（4．0 g無水硫酸鎂，1．0 g氯化鈉，1．0 g二水合檸檬酸鈉，0．5 g檸檬酸氫二鈉）、氯化鈉對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，使用普通QuEChERS鹽包及氯化鈉作為鹽析劑時(shí)，回收率分別為92．9%及94．4%；使用檸檬酸緩沖鹽萃取鹽包的回收率最低，僅為77．7%；而使用乙酸緩沖鹽萃取鹽包的回收率可達(dá)98．0%。因此本實(shí)驗(yàn)采用乙酸緩沖鹽萃取體系。

2.3.3 凈化劑及其用量的選擇八角中含有大量的反式茴香醚及莽草酸［13］，必須進(jìn)行凈化，避免雜質(zhì)干擾檢測(cè)、污染質(zhì)譜系統(tǒng)。QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB［12］。PSA可以消除樣品中的有機(jī)酸、色素、糖類、脂肪酸等雜質(zhì)［14］，C18可去除油脂和弱極性雜質(zhì)［15-16］，GCB可去除色素及平面結(jié)構(gòu)物質(zhì)［17-18］。因此，考察了上述3種凈化劑對(duì)莽草毒素回收率的影響（圖3）。結(jié)果顯示，C18對(duì)莽草毒素的吸附作用最大，其平均回收率僅為64%；而隨著PSA用量的增加，莽草毒素的回收率不斷提高，PSA用量為200 mg時(shí)與500 mg的回收率相近，因此選擇200 mg PSA作為凈化劑；GCB雖對(duì)莽草毒素有一定的吸附，但其對(duì)色素的凈化效果較佳，經(jīng)GCB凈化后的提取液最澄清。因此考察了PSA與GCB復(fù)合凈化的回收率。在綜合考慮回收率、色素凈化效果與成本的基礎(chǔ)上，200 mg PSA+50 mg GCB可取得最佳的凈化效果。

圖3 不同凈化劑對(duì)莽草毒素回收率的影響（n=6）Fig．3 Effect of different purificants on anisatin recoveries（n=6）

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)八角中反式茴香醚、有機(jī)酸、色素等雜質(zhì)的存在對(duì)莽草毒素的檢測(cè)存在干擾。本實(shí)驗(yàn)將莽草毒素配制在乙腈中得到樣品A；對(duì)八角樣品進(jìn)行前處理得到樣品B；對(duì)八角樣品進(jìn)行前處理后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液得到樣品C，對(duì)上述3個(gè)樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，并分別以A、B、C作為其回收率值考察基質(zhì)效應(yīng)（ME）。

當(dāng)ME為正值，表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME為負(fù)值，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。ME的絕對(duì)值大于50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，20%~50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，而小于20%則為弱基質(zhì)效應(yīng)［19-21］。結(jié)果表明，莽草毒素經(jīng)本方法處理后存在弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)（-8．6%），對(duì)結(jié)果影響較小。

2.4.2線性范圍與檢出限以乙腈為溶劑，配制1．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0 ng/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=2 029．358 55x+133．657 11。結(jié)果顯示，莽草毒素在1．0~100．0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）達(dá)到0．999 99。分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）［22］，莽草毒素的LOD和LOQ分別為0．006 mg/kg和0．02 mg/kg。與現(xiàn)行方法相比，本方法具有操作簡單、快速和定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)［1，4］。

2.4.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以八角粉為基質(zhì)，添加0．02、0．20、0．40、1．00 mg/kg 4個(gè)水平的莽草毒素標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，考察回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。由表2可知，莽草毒素的平均回收率為92．5%~112%，RSD為1．1%~6．0%，方法準(zhǔn)確度和精密度滿足GB/T 27404-2008［23］的要求，可應(yīng)用于八角中莽草毒素的分析檢測(cè)。

表2 莽草毒素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of anisatin（n=6）

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的10份八角樣品進(jìn)行測(cè)定，其中2份樣品莽草毒素的含量小于0．02 mg/kg，7份含量為0．02~0．30 mg/kg，1份含量為2．96 mg/kg。由于莽草毒素含量大于1．00 mg/kg應(yīng)考慮存在摻假可能［8］，因此市售八角存在潛在的摻假問題，有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究建立了一種八角中莽草毒素的QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法前處理簡單快捷，方法學(xué)指標(biāo)滿足檢測(cè)要求，適用于八角中莽草毒素的含量檢測(cè)及八角的真?zhèn)舞b別，在八角的食品安全監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。