微生物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶研究進展

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(河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003)

糖蛋白、糖脂和多糖存在于許多生物的細胞表面,參與細胞識別、細胞分化和各種受體與配體間的相互作用過程。這些有生物活性的聚糖中含有一種具有九碳結(jié)構(gòu)骨架的酮基酸性單糖,其衍生物被稱為唾液酸(Sialic Acids,SAs)。SAs是一類普遍存在于生物系統(tǒng)中的天然糖酸類化合物,因最初是從牛下頜唾液腺中分離出而得名[1-2]。目前確定的SAs有50多種天然衍生物,其中最常見的有N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic Acid,Neu5Ac)、N-羥乙酰基神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic Acid,Neu5Gc)和脫氨基神經(jīng)氨酸(2-keto-deoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonic Acid,KDN)(圖1)以及O-甲基、O-乳酰基、O-磺基、O-磷酸基和單或多個O-乙?；苌颷3]。SAs通常以短鏈殘基的形式,通過α-糖苷鍵連接在細胞膜最外面的糖類部分以及分泌的糖脂、糖蛋白和脂多糖等糖綴合物的尾端[4],是細胞信息傳輸?shù)氖讉€接觸位點,在很多病理和生理進程中起著重要的作用,如細胞間的信息通訊、細胞增殖分化、腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移、免疫反應調(diào)節(jié)等[5-6]。另外,在神經(jīng)系統(tǒng)中,唾液酸的表達尤為豐富,其中聚唾液酸共價修飾的神經(jīng)細胞粘附分子,是聚唾液酸的主要載體蛋白。唾液酸是大腦神經(jīng)節(jié)苷脂及糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的主要構(gòu)成部分,對大腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育具有重要的作用[7]。因此,在食品中外源性的添加SAs可促進嬰兒的大腦發(fā)育及認知能力,在功能性食品的開發(fā)中具有廣泛的應用前景。

圖1 三種常見的唾液酸衍生物分子結(jié)構(gòu)[8]Fig.1 Three common molecular structures of sialic acid derivatives[8]

唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一種典型的含有二硫鍵的Ⅱ型跨膜糖蛋白,通常位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)側(cè)[9],負責將唾液酸從活化的糖基供體—CMP-Neu5Ac轉(zhuǎn)移至受體糖鏈末端半乳糖或乙酰氨基半乳糖上,進而合成唾液酸化糖鏈,屬糖基轉(zhuǎn)移酶家族,是生物合成唾液酸化寡糖的關(guān)鍵酶[10]。迄今為止,唾液酸轉(zhuǎn)移酶已在哺乳動物的器官、細菌及病毒中被識別,其酶活性、作用底物和催化特異性、晶體結(jié)構(gòu)等均有所差異。當前國內(nèi)關(guān)于唾液酸轉(zhuǎn)移酶的研究大多以動物來源為主,而對于細菌來源的研究還有所欠缺。哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有嚴苛的受體底物特異性,對糖的類別和構(gòu)成的鍵型專一性要求特別高[11],而細菌來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具備更加廣泛的底物特異性,如Pd2,6ST(Pasteurella damselae 2,6-sialyltransferase)能以C2位巖藻糖基化的半乳糖作為受體底物,把Neu5Ac轉(zhuǎn)移至2′-Fucosyllactose中半乳糖的C6位。細菌來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶目前已被廣泛用于合成各式各樣天然的以及非天然的唾液酸化寡糖,并作為碳水化合物活性酶(CAZy)數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org)的一部分,用于生物學研究[12]。本文主要對唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物來源與分類、晶體結(jié)構(gòu)、催化反應機理、酶學性質(zhì)、異源表達以及在唾液酸寡糖合成中的應用等幾個方面進行了綜述,為唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶學特性的研究以及開發(fā)具備各種生物學功能的唾液酸化寡糖提供一定的理論參考依據(jù)。

1 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物來源與分類

細菌酶對糖類化合物的修飾和合成非常重要,與哺乳動物酶相比,細菌來源的酶具有穩(wěn)定性強、活性較高的特點。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物來源主要為大腸桿菌(Escherichiacoli)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)、淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)等一些致病菌。在CAZy數(shù)據(jù)庫中,基于唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)序列的同源性,所有已知的唾液酸轉(zhuǎn)移酶被分為六個糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)家族,其中有5個GT家族來自細菌,分別為GT4、GT38、GT42、GT52和GT80[13]。根據(jù)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物特異性和催化生成糖苷鍵的連接方式,該類酶被進一步細分為α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶、α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶和α-2,8 唾液酸轉(zhuǎn)移酶,分別以α-2,3、α-2,6和α-2,8糖苷鍵將CMP-Neu5Ac的唾液酸殘基連接至新的糖基受體上,形成不同的唾液酸化糖苷化合物[14-15]。唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物來源及劃分歸類見表1。

表1 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的微生物來源及分類Table 1 Microbial sources and classification of sialyltransferase

2 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)

唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一種II型跨膜糖蛋白,其結(jié)構(gòu)(圖2[31])由一段短N-末端胞質(zhì)尾區(qū)(cytoplasmic tail)、相對較短的跨膜域(TMD)、一段所謂的“莖”區(qū)域(stem region)以及一長段暴露于高爾基體內(nèi)的C-末端催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)組成。其中N-末端是與糖基供體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,負責糖基供體的特異性識別,相對較短的TMD對唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶在高爾基體膜定位中起著關(guān)鍵作用,而蛋白質(zhì)大小的變化通常由莖部長度的差異決定[32],最近報道表明,ST6GalI的莖區(qū)可以在鑒別糖蛋白受體方面發(fā)揮作用,并對催化結(jié)構(gòu)域進行空間控制[33],此外唾液酸轉(zhuǎn)移酶可通過催化結(jié)構(gòu)域進行同源或異源寡聚化,增強其在高爾基體系中的保留活性。

圖2 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 The crystal structure of sialic acid transferase

唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶依據(jù)其結(jié)構(gòu)折疊形式的不同,可以劃分成兩類:GT-A(glycosyltransferase A)折疊和GT-B(glycosyltransferase B)折疊。其中GT-A 折疊由單個核苷酸結(jié)合的Rossmann結(jié)構(gòu)域組成,以 DXD 基序作為結(jié)束,具有典型的三明治結(jié)構(gòu)和較小的折疊[34]。GT-A酶含有對催化作用至關(guān)重要的Asp-x-Asp(DxD)保守序列,對金屬離子具有依賴性,但微生物來源的GT-A折疊唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有不用結(jié)合DxD的兩種特異體,通常不需要金屬離子的催化。GT-B折疊由兩個獨立的Rossmann結(jié)構(gòu)域組成,連橋區(qū)域及催化活性位點位于兩個結(jié)構(gòu)域之間。雖然一些非唾液酸轉(zhuǎn)移酶的GT-B酶可能需要二價金屬離子提高催化活性,但迄今為止所表征的GT-B折疊的糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)中未見與催化相關(guān)的結(jié)合金屬離子[35-36]。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)研究對進一步理解唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶受體底物特異性以及細胞內(nèi)糖基化機制至關(guān)重要。

迄今為止,在所有已知的細菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶中,共有7種唾液酸轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)被報道,分別是CAZy GT42家族的空腸彎曲桿菌α-2,3/8唾液酸轉(zhuǎn)移酶Cst-II 和α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶Cst-I、CAZy GT52家族的腦膜炎奈瑟氏球菌α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶、GT80家族的多殺巴斯德氏菌PmST1、弧菌科發(fā)光細菌JT-ISH-224 pst3-224和pst6-224以及腦膜炎奈瑟氏球菌α-2,3/6唾液酸轉(zhuǎn)移酶[37]。2004年Chiu等[38]首次報道了來自空腸彎曲桿菌的多功能唾液酸轉(zhuǎn)移酶Cst-II(GT42家族)的晶體結(jié)構(gòu),空腸彎曲桿菌CstII晶體結(jié)構(gòu)研究表明,CstIIΔ32的每個單體由259個氨基酸殘基組成。這些殘基構(gòu)成了兩個結(jié)構(gòu)域,第一結(jié)構(gòu)域(1～154,189～259位氨基酸殘基)為混合性α/β折疊,第二個較小的區(qū)域(155～188位氨基酸殘基)在活性位點上形成一種類似于蓋狀結(jié)構(gòu)的折疊,此結(jié)構(gòu)域的175～187位氨基酸殘基僅在與CMP-NeuAc底物完全結(jié)合時才發(fā)生有序排列。首個細菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶晶體結(jié)構(gòu)的確定為此類酶結(jié)構(gòu)和機制以及受體特異性的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。Breton等[39]研究發(fā)現(xiàn),空腸彎曲菌(CampylobacterjejuniOH4384)所產(chǎn)生的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶CstI和CstII有42%氨基酸序列是一致的,同屬于GT-A結(jié)構(gòu),CstII是雙功能酶,可以α-2,3/8糖苷鍵催化唾液酸轉(zhuǎn)移至新的糖基受體上,而Cst I是單功能酶,僅表現(xiàn)出α-2,3轉(zhuǎn)移酶活性,對半乳糖苷受體表現(xiàn)出高度特異性。Nhung Huynh等[40]研究了美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)來源的Δ15Pd2,6ST(N)的晶體結(jié)構(gòu)。Δ15Pd2,6ST(N)晶體的每個不對稱單元中含有四個單體,每個單體由24～497位氨基酸殘基有序組成,第一個N-末端結(jié)構(gòu)域(24～111位氨基酸殘基)是最小的結(jié)構(gòu)域,采用類似于免疫球蛋白的折疊方式,第二結(jié)構(gòu)域(112～334位氨基酸殘基)和第三結(jié)構(gòu)域(335～497位氨基酸殘基)是兩個獨立的 Rossmann結(jié)構(gòu)域,CMP的結(jié)合位點位于兩個Rossmann結(jié)構(gòu)域之間的裂縫中,構(gòu)成了GT-B折疊。

3 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化反應機理

盡管不同來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶在其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上存在差異,但所有的唾液酸轉(zhuǎn)移酶都是反向型(inverting)糖基轉(zhuǎn)移酶[41],遵循一個單一的取代機制,催化CMP-唾液酸供體底物中α-唾液酸化糖苷鍵的形成。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用基礎(chǔ)在于該酶可促進受體對供體底物唾液酸殘基C-2的親核攻擊,經(jīng)過一個氧鎓正離子的過渡態(tài),利用另一酶群的靜電穩(wěn)定或局部質(zhì)子化作用協(xié)助CMP唾液酸殘基轉(zhuǎn)移[32]。糖基轉(zhuǎn)移酶活性位點的共同功能特征是可有效地排除催化中心的水分子,減少催化反應過程中出現(xiàn)“錯誤水解”的可能性[42]。Kakuta等[43]提出了來源于發(fā)光弧菌JT-ISH-224的Δ16psp26ST催化α-2,6糖苷鍵的底物與CMP-Neu5Ac反應的催化機理(圖3):在此催化反應中,Asp232上的羧基負離子為酶的催化活性中心,它能和半乳糖C-6位羥基上的質(zhì)子進行結(jié)合,以加強羥基的親核性,同時由此羥基上的氧原子進攻CMP-Neu5Ac上唾液酸的C-2位,此時位于酶活性中心的His405提供質(zhì)子給CMP內(nèi)和磷原子相鄰的氧原子,從而使氧鎓正離子的過渡態(tài)得以穩(wěn)定,最后以α-2,6糖苷鍵將唾液酸殘基從CMP-Neu5Ac轉(zhuǎn)移到半乳糖上。

圖3 α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化反應機理Fig.3 The catalytic reaction mechanism of α-2,6-sialyltransferase

4 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶學性質(zhì)

唾液酸轉(zhuǎn)移酶因來源不同,相對分子質(zhì)量、最適溫度、最適pH及最適作用底物等性質(zhì)也各不相同。細菌來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的相對分子質(zhì)量一般在30000～60000之間,同一菌株的不同唾液酸轉(zhuǎn)移酶的相對分子質(zhì)量也存在較大差異,如明亮發(fā)光桿菌JT-ISH-224來源的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的相對分子質(zhì)量為58518,而α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶的相對分子質(zhì)量為43995[24]。已發(fā)現(xiàn)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的最適溫度范圍一般為30～40 ℃,少數(shù)會在25 ℃,最適pH通常在7.0～9.0之間,但大多來自海洋細菌的唾液酸轉(zhuǎn)移酶在酸性條件下活性較高,如來源于明亮發(fā)光桿菌和海洋弧菌JT-FAJ-16的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶,最適pH范圍為5.0～6.0[44]。唾液酸轉(zhuǎn)移酶通常不需要金屬離子作為輔因子,但也有個別微生物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶由于二價金屬離子的存在使其酶活性明顯提高,如腦膜炎奈瑟氏球菌來源的PSTNMα-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶,加入20 mmol/L的 Mg2+后酶活性增加了4倍[17]。與哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶相比,微生物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有廣泛的底物特異性,如來源于幽門螺桿菌α-2,3/6唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶,乳糖、N-乙酰-D-乳糖胺(LacNAc)及乳糖-N-二糖(Lacto-N-biose)都可作為其合成的底物[45]。

5 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異源表達

唾液酸轉(zhuǎn)移酶在生物體的含量普遍較低,較難提取并大量制備。隨著20世紀70年代重組DNA技術(shù)的建立及發(fā)展,以及DNA序列測定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系數(shù)據(jù)的積累,人們能較容易地克隆各種天然酶的基因,并利用適當載體導入到可以大量繁殖的生物系統(tǒng)里實現(xiàn)高效表達,提高了唾液酸轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量。Talafová等[30]從海藻糖巴氏桿菌中克隆出α-2,3唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因BtST1,經(jīng)PCR擴增后,定向插入到原核表達載體pET-51b(+),在載體表達的蛋白N端引入Strep標簽,隨后將重組表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進行表達。結(jié)果表明,在1 L大腸桿菌細胞培養(yǎng)物的細胞裂解物中可獲得大約31.3 mg的BtST1蛋白,其相對分子質(zhì)量約為 40 kDa,最適pH為9.0,最適作用溫度為37 ℃,以CMP-Neu5Ac為作用底物時,BtST1的催化效率為44.2 s-1mmol/L-1。Okino等[46]將發(fā)光桿菌(Photobacteriasp. JT-ISH-224)α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因插入到pTrc99A載體,重組表達質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1中進行表達,經(jīng)色譜純化,目的蛋白的最終產(chǎn)量約為24 mg,通過SDS-PAGE確定其分子量約為55 kDa,實現(xiàn)了α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的活性表達。Katharina等[26]從達可馬巴斯德菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的α-2,8唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因PdST,將其定向插入到表達載體pET23a(+)中得到重組表達載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,成功獲得了相對分子質(zhì)量為45300的PdST蛋白,在溫度25 ℃、pH8.0條件下,以CMP-Neu5Ac為供體、乳糖為受體底物時,該酶的酶活力水平可達5.7 U/mg。

6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶在唾液酸寡糖合成中的應用

利用酶促合成寡糖及其衍生物的可行性源于糖基轉(zhuǎn)移酶及糖核苷酸的有效性。近年來已開發(fā)了許多用于其合成的化學及化學酶促方法,明顯提高了酶的活性以及糖的制備量[47]。化學酶法合成結(jié)合了化學合成的靈活性和酶法合成的高度選擇性,是高效獲得復合碳水化合物的途徑。在細菌來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶未被識別與克隆之前,哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶,已被應用于酶法及化學酶法合成系統(tǒng)中,但由于它們在哺乳動物細胞的表達水平較低、具有嚴格的受體底物特異性,且核苷酸糖基供體CMP-Neu5Ac價格昂貴,限制了該類酶在唾液酸糖苷合成中的應用。相比之下,自從1996年Gilbert等[23]成功地克隆了來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋球菌的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶,越來越多的細菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶被應用到唾液酸糖苷的酶促合成中。唾液酸化寡糖的合成常采用“一鍋多酶”法,即將糖核苷酸供體CMP-唾液酸、相應的合成酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶及相應的受體底物在一個體系中進行有序的多步反應。在此系統(tǒng)中,所有酶的催化反應都可以在一個罐子里進行,不需要隔離中間產(chǎn)物,簡化了產(chǎn)品的凈化過程,大大節(jié)省了產(chǎn)品合成的時間。Yu等[48]利用多殺巴斯德氏菌α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶及美人魚發(fā)光桿菌α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶以乙酰甘露糖胺作為Neu5Ac前體,3-疊氮丙基乳糖苷(3-azidopropyl lactoside)為受體底物,在“一鍋多酶”系統(tǒng)中進行合成反應,產(chǎn)物Neu5Acα2,3LacβProN 3 和Neu5Acα2,6LacβProN 3的合成率分別可達84%、98%。一鍋多酶法也被應用于α-2,8糖苷鍵連接的唾液酸糖苷的合成中,Cheng等[49]報道了來源于空腸彎曲桿菌的CstIIΔ32I53S,該酶具有催化α-2,8糖苷鍵形成的活性,被用于一系列唾液酸化寡糖包括GM3(Neu5Acα2-3Lac)、GD3(Neu5Acα2-8Neu5Acα2-3Lac)、GT3(Neu5Acα2-8Neu5Acα2-8Neu5Acα2-3Lac)的酶促合成中。

7 結(jié)論與展望

糖生物學和糖醫(yī)學的發(fā)展極大地推動了寡糖合成的發(fā)展進程,唾液酸化的寡糖具有促進雙歧桿菌增值、降低血內(nèi)毒素及血氨、增強機體免疫力的作用,其合成研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點。微生物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有廣泛的底物特異性,在唾液酸寡糖的合成中具有廣闊的應用前景。但與國外相比,我國的唾液酸轉(zhuǎn)移酶研究還存在許多問題,如唾液酸轉(zhuǎn)移酶大多從國外進口,價格昂貴,增加了該酶在唾液酸寡糖合成中的應用成本;國內(nèi)唾液酸轉(zhuǎn)移酶微生物資源開發(fā)不足、唾液酸轉(zhuǎn)移酶種類較少,產(chǎn)量遠不能滿足市場需求;唾液酸轉(zhuǎn)移酶在細菌表達系統(tǒng)中的穩(wěn)定性、可溶性及活性蛋白水平較低,可利用性不高,應用范圍受到限制。因此,選育高產(chǎn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的菌株、完善唾液酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達與純化工藝依然是當前的研究重點。此外,在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究基礎(chǔ)上,設計具有改變唾液酸轉(zhuǎn)移酶底物特異性的酶突變體,對新型唾液酸糖苷化合物的開發(fā)具有重要的研究意義。