葡聚糖蔗糖酶及其家族在結構與功能上的研究進展

黎志德，劉桂云，常國煒，梁達奉，黃曾慰

（廣東省科學院生物與醫(yī)學工程研究所，廣東省酶制劑與生物催化工程技術研究中心，廣東廣州 510316）

葡聚糖是一類結構多樣的天然產物，普遍存在于細菌、真菌以及植物等生命體中[1]。α-葡聚糖因具有穩(wěn)態(tài)調節(jié)腸道菌群的特性，被認為是一種重要的膳食補充劑[2]。因此，關于如何高效精準合成α-葡聚糖的研究被愈發(fā)重視，以葡聚糖蔗糖酶為代表的糖苷水解酶第70 家族則是眾多生物合成工具中的佼佼者。此家族催化產物難以化學合成，具有結構和生理功能多樣等特點，同時由于不需加入昂貴的UDP-葡萄糖，相較于其他合成工具，在生產成本上呈現明顯優(yōu)勢[3-5]。

葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrases，GSs）又被稱為葡萄糖基轉移酶（Glucosyltransferase，Gtf），是糖苷水解酶第70 家族的首個成員，由乳酸菌分泌并可以催化蔗糖合成α-葡聚糖。葡聚糖蔗糖酶被劃分為GtfA、GtfB、GtfC 和GtfD（Glucosyltransferase A/B/C/D）四個亞家族。它們在蛋白質結構上均以4 個保守氨基酸序列作為活性基序，由Asp、Glu 和Asp 組成催化殘基[6]，反應過程中包含供體糖鏈中α-糖苷鍵的斷開[7,8]及酶-糖基中間體的形成[9]。在碳水化合物活性酶數據庫分類系統(tǒng)中，由于糖苷水解酶第13、17 和70 家族在功能，活性位點和蛋白序列的相似性，三者都被劃分到GH-H 超家族[10]。本研究團隊在利用葡聚糖蔗糖酶生產特定分子量α-葡聚糖有一定研究基礎，在此論文中將主要闡述葡聚糖蔗糖酶及其家族蛋白結構和功能之間的聯系，并展望在食品、醫(yī)學和生物材料中應用的潛力。

1 α-葡聚糖的結構及合成酶

葡聚糖蔗糖酶及其家族成員可將蔗糖或淀粉類底物轉化為由α-D-吡喃葡萄糖單體構成的多糖。這些酶多數來源于明串珠菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，少數來源于嗜果糖乳酸菌屬，酒球菌屬和腸球菌屬[11,12]。多數菌株只分泌一種葡聚糖蔗糖酶，少數能產生多種，如腸膜明串珠菌NRRL B-1299[13-15]。同一菌株內不同的葡聚糖蔗糖酶可產生多種產物[16]或協同生成單一產物[15]。不同菌株的分泌條件各異，如鏈球菌為組成型表達[17]，明串珠菌受到蔗糖特異性誘導表達[18-20]。不同的酶和反應條件，可產生糖苷鍵組成、分子量和分支程度各異的α-葡聚糖，結構差異導致了理化性質和生理活性的多樣性。一般而言，可以根據α-葡聚糖主鏈上主要的糖苷鍵類型，分為四類：Dextran、Mutan、Reuteran 和Alternan。

1.1 主要由α-1,6鍵連接為主要構成的Dextran

Dextran，又名右旋糖酐，是水溶性α-葡聚糖，主要通過α-1,6 糖苷鍵連接形成長度和排列不一的糖鏈，糖鏈間由α-1,2，α-1,3 和α-1,4 糖苷鍵連接。相關合成酶首先在明串珠菌中發(fā)現，被命名為右旋糖酐蔗糖酶[21]，后續(xù)在鏈球菌屬[22]、乳桿菌屬[23]和魏氏菌屬[24]等菌種中均有發(fā)現。

葡聚糖蔗糖酶各家族成員中，右旋糖酐蔗糖酶是被鑒定最多，研究最為廣泛的，催化產物由占多數的α-1,6 糖苷鍵和少量α-1,3 糖苷鍵組成，以線性結構為主，如最常見的商業(yè)化菌株LeuconostocmesenteroidesNRRB-512F，可將蔗糖轉化為由95%的α-1,6 糖苷鍵和5%的α-1,3 糖苷鍵連接組成的右旋糖酐，相對分子質量可達1 000 ku[25]。少數菌株催化產物具有高度支化結構，如LeuconostoccitreumNRRL B-1299，所生成的右旋糖酐中除占主要的α-1,6 糖苷鍵外，還包含約30%的α-1,2 及少量α-1,3 糖苷鍵[26]。該菌株分泌的六種葡聚糖蔗糖酶，分別命名為DSR-A、DSR-B、DSR-E、DSR-M、DSR-P 和BRS-A。其中DSR-A、DSR-B、DSR-P 和DSR-M 的催化產物以α-1,6 糖苷鍵連接為主[13-15]，DSR-E 和BSR-A 則催化生成α-1,2 糖苷鍵分支。DSR-E 有兩個具備完整催化活性及高度區(qū)域特異性的催化結構域，并通過葡聚糖結合結構域連接[27]。第一催化結構域（CD1）合成以α-1,6 鍵為主的線性葡聚糖鏈，第二催化結構域（CD2）通過合成α-1,2 糖苷鍵來修飾葡聚糖受體形成分支[27]。BSR-A與DSR-E 的第二催化結構域具有顯著的序列同源性，催化生成α-1,2 糖苷鍵分支的反應特異性和高效的催化活性[15,28,29]。LeuconostoccitreumNRRL B-742 合成產物具有由α-1,6 糖苷鍵連接的主鏈和單個α-1,3 糖苷鍵接枝組成的梳狀結構[30]。后續(xù)研究通過序列比對分析，鑒定出一種可在高α-1,3 糖苷鍵含量葡聚糖鏈中建立分支的葡聚糖蔗糖酶，并命名為BSR-B。此類具有相似分支特異性的葡聚糖蔗糖酶在欺詐明串珠菌和昆氏乳桿菌等菌株分布較為普遍[31,32]。

1.2 由α-1,3 鍵連接為主要構成的Mutan

Mutan，又名變聚糖，是不溶于水的α-葡聚糖，主鏈中由大于50%的α-1,3 糖苷鍵和少量的α-1,6 鍵連接組成。合成Mutan 的突變蔗糖酶主要存在于鏈球菌中，如StreptococcusmutansGS5，同時在乳酸桿菌和明串珠菌中也有發(fā)現[33]。變形鏈球菌和遠緣鏈球菌將蔗糖轉化為不溶性葡聚糖是齲齒發(fā)生的關鍵步驟[33,34]。

1.3 由α-1,4 鍵構成主鏈，α-1,6 鍵連接支鏈的Reuteran

Reuteran，又名羅伊糖，是水溶性α-葡聚糖，通過單個α-1,6 糖苷鍵橋接各段α-1,4 糖苷鍵組成的糖鏈。羅伊糖蔗糖酶，又名4,6-α-葡萄糖基轉移酶，主要存在于羅伊氏乳桿菌中，催化產物由數量不一的α-1,4 和α-1,6 糖苷鍵連接構成[35-37]。被研究最多的是益生菌Lactobacillusreuteri121，能合成由α-1,4 糖苷鍵連接主鏈，α-1,6 鍵連接單個分支和短鏈的羅伊糖，三者比例為52:15:37，相對分子質量可達40 000 ku[23]。

1.4 由α-1,3 鍵和α-1,6 鍵交替連接構成的Alternan

Alternan，又名交替糖，是水溶性α-葡聚糖，由α-1,6與α-1,3 糖苷鍵交替連接主鏈，并由α-1,6 糖苷鍵連接短分支組成。交替糖蔗糖酶在明串珠菌和變異鏈球菌中均有發(fā)現，首次發(fā)現于LeuconostocmesenteroidesNRRL B-1335，催化產物由46.9%的α-1,6 和35.0%的α-1,3 糖苷鍵連接[38]。交替糖蔗糖酶具有兩種催化反應模式，一種是聚合反應，即以蔗糖為唯一底物將葡萄糖殘基從蔗糖分子上轉移生成長鏈聚合物；另一種是受體反應，即將蔗糖的葡萄糖殘基轉移到其他受體分子上生成低聚合度的糖鏈[39]。交替糖因其獨特鍵型，在具有較右旋糖酐更高水溶性和更低固有粘度的同時，還具備較高抗水解性和益生元活性[40,41]。

2 糖苷水解酶第70 家族各亞家族成員的結構和功能特性

按照合成產物中糖苷鍵的差異，葡聚糖蔗糖酶GtfA 亞家族主要包括右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，DS，EC 2.4.1.5）、變聚糖蔗糖酶（Mutansucrase，MS，EC 2.4.1.125）和交替葡聚蔗糖酶（Alternansucrase，AS，EC 2.4.1.140）等，均對蔗糖有催化活性[42]。糖苷水解酶第70 家族中除葡聚糖蔗糖酶亞家族GtfA 以外，還有一類具有4,3/6-α-葡萄糖基轉移活性的成員，即GtfB、GtfC 和GtfD，這三個亞家族成員又被統(tǒng)稱為α-GTase，對蔗糖沒有活性，對淀粉/糊精底物表現出歧化活性[43]，可生成由α-糖苷鍵連接的寡糖和多糖，部分產物為可溶性膳食纖維且具有益生元潛力[44-46]。

α-GTase 酶的微生物起源、結構域、反應和產物特異性不同于葡聚糖蔗糖酶，但具有較高的序列相關性[47]。有研究通過代表性家族成員全序列比對，以及對部分GtfB，GtfC 和GtfD 的序列預測，以Lactobacillus reuteri121 GtfB，Exiguobacteriumsibiricum255-15 GtfC 和AzotobacterchroococcumGtfD 作為查詢序列進行BLAST 分析后構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現三個亞家族酶學性質上呈現的葡聚糖蔗糖酶/α-淀粉酶中間特性也體現在它們在系統(tǒng)發(fā)育樹上所處位置。此外，由于糖苷水解酶第13 和70 家族成員在結構和催化機制上有一定相似性，如α-保留的雙置換催化機制以及（β/α）8桶結構，因此推測α-GTase 可能進化自一種屬于糖苷水解酶第13 家族的α-淀粉酶[48,49]。

圖1 糖苷水解酶第13 和70 家族之間蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of protein sequences between families GH13 and 70

2.1 糖苷水解酶第70 家族GtfA 亞家族

因為葡聚糖蔗糖酶的大分子結構（分子量約在120～200 ku）導致適合X-衍射研究的晶體難以生成，所以目前僅有四個糖苷水解酶第70 家族成員的晶體結構被確定，并闡明其結構域組成[50]。其中對α-GTase的結構與功能關系和產物特異性的了解更為有限，已報道一種僅包含供體亞位點的3D 結構（Lactobacillus reuteri121GtfB-ΔNΔV）。Vuji?i?-?agar 等[6]率先通過截短Lactobacillusreuteri180 的葡聚糖蔗糖酶N-末端745 個殘基后獲得高分辨率晶體結構，即Gtf180-ΔN，并對α-葡聚糖的催化合成機制進行詳細闡述。后續(xù)研究中通過類似方法，在保留全部催化功能前提下，截斷約240 到840 個N-末端殘基后獲得多個葡聚糖蔗糖酶的蛋白質結構[51,52]。研究發(fā)現被截斷的N-末端可能是細胞壁附著域，且在不同蛋白之間存在顯著的長度和結構差異[47]；不同蛋白的催化活性部分在結構上高度相近，且與糖苷水解酶第13 家族有相似保守基序[53,54]。在糖苷水解酶第13 和70 家族中，催化核心都由可疊加的結構域A、B 和C 構成，結構域A 具有一個帶有催化三元組的TIM 桶或（β/α）8桶結構和保守基序Ⅰ-Ⅳ。這些基序包含催化殘基及底物結合殘基，被視為與酶功能密切相關的特異性序列指紋[55-57]。此結構首先在糖苷水解酶第13 家族中被發(fā)現，然后在葡聚糖蔗糖酶也發(fā)現類似結構。兩者差異在于前者的保守基序順序為I-II-III-IV，葡聚糖蔗糖酶的（β/α）8桶是循環(huán)排列，保守基序Ⅰ位于結構域A 的C 末端部分。葡聚糖蔗糖酶中催化核心包括了結構域Ⅳ和Ⅴ。其中結構域Ⅴ對糖鏈延長非常重要。如Leuconostoc mesenteroidesNRRL B-1355 DSR-S的結構域Ⅴ若連續(xù)缺失會導致合成效率降低和產物分子量的減少[49]；通過截斷Gtf180-ΔN 的遠端結構域Ⅴ也可使產物分子量減少[58]。由于結構域Ⅴ包含葡聚糖結合口袋，并隨著圍繞結構域Ⅳ和Ⅴ間的鉸鏈移動而改變位置[59]，表明兩者通過將結合的中間體移離或移向活性中心來輔助多糖的合成。葡聚糖蔗糖酶具有一種不同尋常的“U 型折疊”結構域，其中5 個結構域中的4 個（除結構域C以外）是由兩組不連續(xù)的多肽鏈片段夠成。這種獨特的結構域被認為是由糖苷水解酶第13 家族的α-淀粉酶通過基因復制的進化途徑產生[6]。

通過葡聚糖蔗糖酶的結構及其酶-供體底物-受體底物復合物證實了糖苷水解酶第13 和70 家族具有相似的催化機制。即供體底物蔗糖的α-1,2-糖苷鍵首先在酶的亞位點-1 和+1 間被裂解，并在亞位點-1 形成葡萄糖基-酶的中間體。然后通過轉糖基化或聚合反應，將糖基部分轉移到正在生長的葡聚糖鏈上的非還原糖端；或通過受體反應或水解反應，將糖基部分轉移到的麥芽糖或水分子等受體底物上[9,60]。Gtf180-ΔN 與麥芽糖復合物的晶體結構表明，亞位點+1 和+2 與受體底物相互作用的殘基分別來自保守基序Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，以及結構域B 等非保守區(qū)域[6]。通過誘變試驗證實受體結合亞位點+1 和+2 上的殘基共同形成的物理化學微環(huán)境決定了糖苷鍵連接特異性[60,61]，說明通過改變有限數量的殘基就足以使葡聚糖蔗糖酶呈現不同的特異性，從而實現對α-葡聚糖糖苷鍵比例的控制。對保守基序Ⅳ下游的亞位點+2 殘基進行突變會顯著改變糖苷鍵的連接比例[23,36,49,62]，進一步突變保守基序Ⅱ能合成天然產物中不存在的α-1,4 糖苷鍵或減少分支數量[23,63-65]。因此可通過部分或完全堵塞Gtf180 形成分支所需的+1 亞位點上方的溝槽，可使合成產物中分支減少；相反，對在螺旋α4 亞位點+2 附近的一些殘基進行突變會產生超支化聚合物[65,67,68]；另有報道稱，相關位點的突變會導致多糖相對分子質量改變[69,70]，通過突變亞位點+1 和+2 的受體結合殘基，可改變酶對糖鏈生長中受體底物鏈的親和力，顯著影響多糖與低聚糖合成比例[61,71]。

圖2 Gtf180-ΔN 的結構Fig.2 Overall structure of Gtf180-ΔN

2.2 糖苷水解酶第70 家族GtfB 亞家族

GtfB 亞家族是糖苷水解酶第70 家族中首個與淀粉轉化相關的亞家族，僅在乳酸菌中發(fā)現，目前已報道幾種具有不同的反應和產物特異性的成員，如Lactobacillusreuteri121 GtfB 4,6-α-GTase，Lactobacillus fermentumNCC 2970 4,3-α-GTase 和Limosilactobacillus reuteriNCC 2613 GtfB 4,6-α-GTase。

Lactobacillusreuteri121 GtfB 4,6-α-GTase 是首個被報道具有淀粉轉化能力的糖苷水解酶第70 家族成員，其基因序列與葡聚糖蔗糖酶GtfA 具有高度一致性，但蔗糖轉化活性較低[72]。同時對低聚麥芽糖和淀粉表現出明顯的水解/轉糖基活性，可通過裂解α-1,4糖苷鍵后合成α-1,6 糖苷鍵，實現將α-1,6 葡聚糖短鏈連接到低聚麥芽糖或淀粉片段的非還原端，最終生成被稱為IMMPs（Isomalto/Malto-Polysaccharides）的水溶性淀粉衍生物。Lactobacillusreuteri121 GtfB 4,6-α-GTase 首選底物是具有較長α-1,4 糖苷鍵連接片段和較少α-1,4/α-1,6 分支點的糖鏈，產物具有更高的α-1,6 糖苷鍵比例。突變其轉糖基化活性的關鍵位點，可使其轉化為只具有水解活性的α-淀粉酶。其作用受體亞位點+2 與配體的直接作用，是α-1,6 轉糖基活性的關鍵位點[50,73,74]。

LactobacillusfermentumNCC 2970 4,3-α-GTase 與Lactobacillusreuteri121 GtfB 4,6-α-GTase 有70%的序列相同，差異集中在保守基序Ⅱ和Ⅳ。這些差異使其以直鏈淀粉和麥芽七糖為底物時，呈現4,3-α-葡萄糖苷轉移酶活性；以馬鈴薯V 型直鏈淀粉為底物時，產物變成通過單一的α-1,3 糖苷鍵線性或分支連接低聚麥芽糖片段組成。此前未見葡聚糖蔗糖酶催化合成類似產物的報道，而且從地衣和真菌中分離含有相同的連接類型的多糖主要由α-1,3 糖苷鍵連接且不存在α-1,4 分支點，因此推測GtfB 形成支鏈α-葡聚糖是與其開放的活性位點結構有關[75]。

LimosilactobacillusreuteriNCC 2613 GtfB 與大多數合成線性IMMPs 的GtfB 亞家族成員不同，當以馬鈴薯V 型直鏈淀粉為底物時，產物是由聚合度2 到7的低聚麥芽糖鏈組成，并通過α-1,4 糖苷鍵連接主鏈，α-1,6 糖苷鍵連接分支。這是首次發(fā)現乳酸菌將直鏈淀粉衍生為支化α-葡聚糖，其反應特異性與在非乳酸菌中發(fā)現的GtfD 亞家族成員類似。在三維結構模型中，LimosilactobacillusreuteriNCC 2613 GtfB 環(huán)A1 和B較Lactobacillusreuteri121 GtfB 短7 個和16 個殘基，且不含供體底物結合亞位點，因此推測更開放的活性位點結構將促使更多分支結構生成[76]。

2.3 糖苷水解酶第70 家族GtfC 亞家族

糖苷水解酶第70 家族GtfC 亞家族成員在非乳酸菌中發(fā)現，包括多種可適應極端溫度的細菌，如厚壁菌門桿菌綱的Exiguobacterium、Bacillus和Geobacillus，均為低G+C 含量的革蘭氏陽性菌[9,77]。

Exiguobacteriumsibiricum255-15 是嗜冷性非孢子形成細菌，從距今約200～300 萬年歷史的西伯利亞古凍土中分離[78,79]。Geobacillussp.12AMOR1 是嗜熱細菌，從深海高溫沉積物樣本中分離[80]。Exiguobacteriumsibiricum255-15 GtfC 的氨基酸序列與GtfB 亞家族相近，然而GtfC 亞家族缺乏葡聚糖蔗糖酶和GtfB 亞家族位于保守基序Ⅰ-Ⅳ的（β/α）8桶圓形排列。GtfC 亞家族與α-淀粉酶的核心結構域A-C類似，但結構域B 插入一段葡聚糖蔗糖酶特有的結構域Ⅳ。GtfC 酶缺失在葡聚糖蔗糖酶和GtfB 亞家族中典型的N-末端可變區(qū)和遠端結構域Ⅴ，并可能在C-末端存在一到兩個功能未知的Ig2 基序。GtfC 亞家族獨特結構域表明，可能存在在α-淀粉酶前體中插入結構域Ⅳ的相關事件，進一步體現了兩個糖苷水解酶家族間的進化路徑。Exiguobacteriumsibiricum255-15 GtfC 酶具有與Lactobacillusreuteri121 GtfB 相似的4,6-α-葡萄糖基轉移酶活性，可以裂解淀粉類底物的α-1,4 鍵并連續(xù)合成的α-1,6 鍵。其產物是被稱作IMMOs（IsoMalto-Malto/Oligosaccharides）的衍生物，且不會進一步聚合。IMMOs 中α-1,6 糖苷鍵比例與底物聚合度呈正相關，約有33%、44%和52%的α-1,6糖苷鍵存在于以麥芽六糖、麥芽七糖和V 型直鏈淀粉為底物的反應產物中。

2.4 糖苷水解酶第70 家族GtfD 亞家族

糖苷水解酶第70 家族GtfD 亞家族在多種與植物相關的細菌中發(fā)現，且在以馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉和聚合度4 至7 的低聚甘露糖等淀粉類為底物時表現出4,6-α-葡萄糖基轉移酶活性[81,82]。GtfD 在進化路徑上與GtfC 密切相關，都具有α-淀粉酶的折疊結構。但GtfD 在其微生物起源上有所不同，它不僅存在于芽孢桿菌和圓褐固氮菌等革蘭氏陽性菌中，也存在于如洋蔥假單胞菌和弗拉特氏菌等革蘭氏陰性菌中。

來源于PaenibacillusbeijingensisDSM 24997 和AzotobacterchroococcumNCIMB 8003 的GtfD 與直鏈淀粉反應時沒有形成連續(xù)的α-1,6 糖苷鍵，而是形成由單個α-1,6 鍵和α-1,4 或α-1,6 鍵連接的分支，產物高度支化。這兩種GtfD 酶合成產物分子量存在明顯差異，α-1,6 糖苷鍵節(jié)點數量和α-1,4 鍵連接片段長度也不一樣，在液相色譜圖上分別為單峰（13 000 ku）和雙峰（27 000 ku，19 ku）分布[81,83]。來源于chroococcum和Paenibacillusbeijingensis的GtfD 可將小麥淀粉轉化為抗性淀粉，結構與以蔗糖為底物的Lactobacillusreuteri121 GtfA 的催化產物類似[81,84]。

3 結論與展望

綜上所述，通過葡聚糖蔗糖酶及其家族的基因數據挖掘和蛋白結構分析，可以發(fā)現其產物特異性是由受體結合亞位點的各氨基酸殘基間相互作用決定，關鍵位點的變化往往能顯著改變催化產物的糖苷鍵組成、分子量和支化程度。從糖苷水解酶第13 家族的α-淀粉酶，到糖苷水解酶第70 家族的GtfD、GtfC 和GtfB 亞家族，最后到具有催化蔗糖活性的葡聚糖蔗糖酶（GtfA），各亞家族成員蛋白結構與功能的逐漸演化印證了它們在進化路徑上的相互關系，同時也展現了通過酶工程技術改造現有酶工具生產各類新型α-葡聚糖的潛力?？梢娧芯咳绾瓮ㄟ^對酶制劑催化合成或改造碳水化合物，調控催化產物的理化性質和加工特性，將是葡聚糖蔗糖酶用于食品生產或直接作為食品添加劑應用的關鍵。但是，由于目前對各活性位點間的相互影響機制，糖鏈延長階段的反應機理，特別是當中間產物超出催化結構域，甚至與遠端結構域結合時的反應機制依然缺乏了解，因此繼續(xù)深入研究相關課題，并基于已知結構與功能去理性設計更穩(wěn)定、更高效和更具操控性的葡聚糖蔗糖酶，將是未來食品酶工程的重要方向和挑戰(zhàn)之一。