植物乳桿菌拮抗致病大腸桿菌機(jī)制與應(yīng)用研究進(jìn)展

楊廣珠，張淑紅，李瀅，劉鳴，陳維，張菊梅，王涓，吳清平*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

關(guān)鍵字：植物乳桿菌；致病大腸桿菌；抑制；應(yīng)用

食源性致病菌廣泛存在于各種食品介質(zhì)，并可以通過多種途徑（如原料、加工、零售等）污染食品，對(duì)食品安全和消費(fèi)者健康構(gòu)成了重大威脅[1]。美國疾控中心（Centers of Disease Control and Prevention，CDC）數(shù)據(jù)顯示，2009～2018 年間美國報(bào)道131 525 例食源性感染病例，其中49%由致病菌引起，以大腸桿菌O157、沙門氏菌為主[2]。我國CDC 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020 年我國共報(bào)告776 起食源性致病菌感染病例，病原菌主要為大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）、沙門氏菌（Salmonella）、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus）[3]。大腸桿菌根據(jù)其攜帶的毒力因子可分為五個(gè)重要致病類型：產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga Toxin-ProducingE.coli，STEC）、腸致病性大腸桿菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC）、腸集聚性大腸桿菌（EnteroaggregativeE.coli，EAEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC）[4]。STEC 是對(duì)人類健康潛在危害最大的致病型，所產(chǎn)志賀毒素（Shiga Toxin，STX）可引起人出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagic Colitis，HC）和溶血性尿毒癥綜合征（Hemolytic Uremic Syndrome，HUS）等嚴(yán)重癥狀，致死率非常高[5]。近年來，國內(nèi)外由E.coli引起的食品污染和食源性疾病暴發(fā)不斷，對(duì)人們的身體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，給食品企業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[6]。2011 年5 月～7 月，德國暴發(fā)3 816例因食用受STEC O104:H4 污染的豆芽引起的腸胃炎，其中845 例患者臨床癥狀表現(xiàn)為HUS[7]。據(jù)Majowicz等[8]統(tǒng)計(jì)，1990～2012 年間STEC 在全球每年可引起2 801 000 例急性疾病，其中報(bào)道3 890 例HUS 和230例死亡。本團(tuán)隊(duì)在2012～2016 年間對(duì)全國13 個(gè)城市的零售食品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查，Zhang 等[9]從其中33 份食品分離得到EPEC 菌株，基因組分析結(jié)果顯示它們普遍攜帶多種毒力基因。其中80.5%的菌株對(duì)3 種以上的抗生素產(chǎn)生抗性，說明高毒力EPEC 耐藥情況嚴(yán)峻，其感染后所導(dǎo)致的食源性疾病相比于普通E.coli的治療難度更高。同時(shí)，Zhang 等[10]還發(fā)現(xiàn)來源于肉制品和蔬菜的35 株E.coliO157-non H7 均表現(xiàn)為多重耐藥性（耐藥性100%），其中94.3%的菌株對(duì)5 種及以上的抗生素耐受，并首次報(bào)道在零售食品中檢出攜帶mcr-1/IncI2 質(zhì)粒的E.coliO157:H26 和E.coliO157:H4，致病E.coli的耐藥現(xiàn)狀及傳播風(fēng)險(xiǎn)令人擔(dān)憂。隨著致病E.coli導(dǎo)致的食源性疾病報(bào)道逐漸增多，高毒力多重耐藥菌的出現(xiàn)也給疾病防控帶來巨大挑戰(zhàn)，探索高效、安全的新型生物防控技術(shù)成為國際研究的熱點(diǎn)。

植物乳桿菌（Lactiplantibacillusplantarum，Lb.plantarum）是一種不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，廣泛存在于發(fā)酵食品、腸道、糞便中，具有兼性厭氧的生長特性，常作為發(fā)酵劑用于發(fā)酵食品的制作加工，或作為防腐劑用于食品保鮮[11]。植物乳桿菌對(duì)酸性環(huán)境和膽鹽具有較強(qiáng)的耐受性，可定植于腸道中，是拮抗病原菌的理想菌種，具有良好的安全特性[12]。作為常用的益生菌，植物乳桿菌已被歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和美國食品藥品監(jiān)督局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）列入安全資格認(rèn)證（Qualified Presumption of Safety，QPS）和公認(rèn)安全食品（Generally Recognized as Safe，GRAS）[13]，目前我國衛(wèi)生部也已將其列入新資源食品目錄。本團(tuán)隊(duì)李婧怡發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LP63-4 可抑制牛奶中的單核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes），商燕燕等[14]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LP1Z 所產(chǎn)的活性蛋白可顯著抑制幽門螺旋桿菌（Helicobacterpylori）?；谇捌谘芯勘砻鳎参锶闂U菌對(duì)多種致病菌有抑制作用，尤其高效拮抗致病E.coli，是一種可產(chǎn)生新型生物抗菌物質(zhì)且極具開發(fā)潛力的功能菌種[11]。本文綜述了近年來報(bào)道的植物乳桿菌抑制致病E.coli的作用機(jī)制，并對(duì)其在畜禽/水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品加工和臨床中的應(yīng)用進(jìn)行了探討。

1 植物乳桿菌對(duì)致病大腸桿菌拮抗作用機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌對(duì)E.coli抑菌效果存在菌株特異性，即不同菌株可通過不同的機(jī)制發(fā)揮抗菌作用[15]。部分具有高效抗菌活性的植物乳桿菌可通過產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物、增強(qiáng)腸黏膜屏障、與大腸桿菌競(jìng)爭(zhēng)粘附位點(diǎn)以及調(diào)節(jié)腸道免疫功能等方式發(fā)揮抑制作用。某些特定的菌株可同時(shí)產(chǎn)生多種抗菌機(jī)制，通過多途徑協(xié)同作用發(fā)揮高效抗菌功能[12]。

1.1 代謝活性物質(zhì)

植物乳桿菌在生長過程中可產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物，如乳酸、苯乳酸等有機(jī)酸。這些疏水性有機(jī)酸以未解離形式存在，通過滲透進(jìn)入細(xì)胞膜后在靶細(xì)胞內(nèi)解離進(jìn)而酸化細(xì)胞質(zhì)。胞內(nèi)pH 改變則干擾各種依賴于pH的物質(zhì)運(yùn)輸和生命活動(dòng)，從而抑制細(xì)菌生長，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。這些有機(jī)酸不僅增加了食品中的風(fēng)味物質(zhì)，還能有效防控致病微生物污染[17]。前期研究中，本團(tuán)隊(duì)Zeng 等[18]從世界長壽村的發(fā)酵食品中分離獲得3 株可抑制STEC O157:H7 和EPEC 的植物乳桿菌，這些植物乳桿菌在發(fā)酵過程中能高效合成乳酸、檸檬酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸，對(duì)多重耐藥致病E.coli具有明顯的拮抗作用。另外，Niku-Paavola 等[19]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸與其產(chǎn)生的蛋白類抑菌物質(zhì)具有協(xié)同作用，可進(jìn)一步提升乳酸菌源蛋白的功能。

除有機(jī)酸外，多肽及蛋白類物質(zhì)也是植物乳桿菌重要的抗菌代謝物質(zhì)之一。這些由益生菌合成并分泌到胞外、具有抗菌作用的活性多肽又被稱為細(xì)菌素（Bacteriocin）。參考Collins 等[20]的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌素根據(jù)分子量大小可分為三類（表1）：I 類細(xì)菌素是一類以羊毛硫細(xì)菌素為主的小分子熱穩(wěn)定多肽（≤5 ku），可與靶細(xì)胞膜的脂質(zhì)II 結(jié)合，抑制肽聚糖的正常合成進(jìn)而干擾合成細(xì)胞壁，同時(shí)可在細(xì)胞膜上形成孔洞導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]，I 細(xì)菌素以廣泛應(yīng)用于食品保鮮的Nisin 為典型代表[22]。II 類細(xì)菌素是一類不需要修飾、熱穩(wěn)定性好的小分子多肽（≤10 ku），根據(jù)其特點(diǎn)可分為4 個(gè)亞類，IIa 類是片球菌素類細(xì)菌素，以片球菌素Pediocin PA-1典型代表[23]；IIb 類為雙肽細(xì)菌素，通常以兩種肽的協(xié)同作用發(fā)揮最大的活性，當(dāng)一種肽在低濃度時(shí)則沒有活性或活性很低，如植物乳桿菌素Plantaricin EF 由PlnE和PlnF 組成[21]。而IIc 和IId 分別為環(huán)肽細(xì)菌素和單肽/線狀細(xì)菌素[20]。II 類細(xì)菌素主要通過改變細(xì)胞膜通透性，使膜電位發(fā)生變化，最終形成孔隙使細(xì)胞內(nèi)容物流出導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。III 類細(xì)菌素主要為大分子蛋白質(zhì)，對(duì)熱不穩(wěn)定，分為IIIa 和IIIb 兩類，其中IIIa 類的作用機(jī)制為切割靶細(xì)胞細(xì)胞壁的肽聚糖，破壞靶細(xì)胞的完整性[25]；IIIb 類則是阻礙靶細(xì)胞吸收葡萄糖，同時(shí)擾亂膜電位，導(dǎo)致小分子物質(zhì)滲漏[26]。

表1 益生菌細(xì)菌素分類及其作用機(jī)制Table 1 The classification of probiotic bacteriocins

植物乳桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素主要?dú)w屬于I 類和II類[16]，因菌株間存在差異，不同來源的植物乳桿菌可產(chǎn)生分子量大小不同的細(xì)菌素，并靶向作用于不同的病原菌（表2）。Lyu 等[27]從魚肉中分離到一株具有廣譜抑菌作用的植物乳桿菌DY4-2，其分泌的細(xì)菌素DY4-2穩(wěn)定性較好，在多種極端條件下（如pH 值、溫度等）仍具有良好的抗菌活性。據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，植物乳桿菌素的分泌受培養(yǎng)時(shí)間、溫度、碳源、氮源和氯化鈉濃度等條件影響，最近研究表明群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用[28]。Man 等[29]將植物乳桿菌NMD-17 與300 株菌株分別進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其與瑞士乳桿菌NMD-86共培養(yǎng)可增強(qiáng)其抑菌能力。通過對(duì)基因表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)使細(xì)菌素合成相關(guān)基因plnB、plnD、plnE、plnF和群體感應(yīng)相關(guān)基因LuxS的表達(dá)水平分別增加1.81～4.13 倍。對(duì)此現(xiàn)象，研究者認(rèn)為可能是共培養(yǎng)菌株瑞士乳桿菌NMD-86 刺激植物乳桿菌NMD-17 的防御系統(tǒng)使其細(xì)胞數(shù)量增加，隨后群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子AI-2 也增加。當(dāng)AI-2 濃度達(dá)到閾值時(shí)，細(xì)菌素合成的相關(guān)基因被激活。上述結(jié)果說明群體感應(yīng)系統(tǒng)也是調(diào)控植物乳桿菌細(xì)菌素分泌的重要因素之一，然而這種刺激分泌是具有菌株特異性的。

此外，除了有機(jī)酸、活性肽，植物乳桿菌還可向胞外分泌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）以抵御外界環(huán)境的影響[30]。Ayyash 等[31]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌分泌的EPS-C70 可顯著抑制STEC O157:H7 生長。Wang 等[32]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌YW32 分泌的耐高溫EPS 可通過干擾細(xì)胞表面黏附、細(xì)胞識(shí)別機(jī)制抑制STEC O157 生物膜的形成[16]。

植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物可高效拮抗致病大腸桿菌，然而低產(chǎn)量可能限制了在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，對(duì)活性物質(zhì)的合成機(jī)制進(jìn)行深入研究有助于其制備、純化以獲得更多的活性物質(zhì)，最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。

1.2 增強(qiáng)腸黏膜屏障功能

腸黏膜屏障是機(jī)體防控食源性致病菌入侵的第一道防線。緊密連接蛋白是影響腸上皮細(xì)胞功能、決定腸黏膜屏障防御能力的重要成分，包括跨膜蛋白Claudin、Occludin 和細(xì)胞質(zhì)支架蛋白Zonula Occludens（ZO）家族。這些蛋白主要存在于緊密細(xì)胞的間隙，可阻止有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)進(jìn)而保護(hù)腸道[41]。而絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）是腸上皮細(xì)胞間信號(hào)傳遞的關(guān)鍵物質(zhì)[42]。研究表明，致病E.coli進(jìn)入宿主體內(nèi)后，MAPK 信號(hào)通路被激活進(jìn)而改變緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量，最終破壞腸道黏膜屏障、損傷上皮細(xì)胞并增加其通透性[43]。在ETEC 侵染小鼠后，小鼠體內(nèi)Claudin-1 和Occludin含量顯著下降，ZO-1 也有所下降。而Han 等[44]用植物乳桿菌GL17 治療ETEC 小鼠，發(fā)現(xiàn)其可顯著緩解小鼠的體重減輕和空腸形態(tài)損傷等癥狀。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌GL17 可促進(jìn)小鼠腸道中緊密連接蛋白Claudin-1 和Occludin 的表達(dá)，維持小鼠體內(nèi)的腸道屏障完整性。另外，短鏈脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFAs）是腸道微生物發(fā)酵碳水化合物過程中的關(guān)鍵代謝物，而腸黏膜可利用SCFAs 以維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)[45]。Yu等[46]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8661可增加小鼠結(jié)腸中丁酸、異丁酸和丙酸含量，促進(jìn)植物乳桿菌CCFM8661保護(hù)小鼠結(jié)腸黏膜的完整性，減輕腸道內(nèi)有害物質(zhì)對(duì)結(jié)腸的病理損傷。因此，植物乳桿菌可通過調(diào)節(jié)相關(guān)緊密連接蛋白的表達(dá)和增加腸道內(nèi)的SCFAs 含量，促進(jìn)形成腸道內(nèi)屏障，保護(hù)機(jī)體腸道免受致病E.coli侵染引起的損傷。

1.3 競(jìng)爭(zhēng)粘附

附著于腸道上皮細(xì)胞是E.coli成功侵染腸道的第一步，進(jìn)而穩(wěn)固定植于腸道，導(dǎo)致宿主持久性感染[47]。而植物乳桿菌能與E.coli在同一環(huán)境中形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，保護(hù)腸道免受其繼續(xù)侵襲[48]。Wang 等[49]發(fā)現(xiàn)用107～109CFU/mL 植物乳桿菌ZLP001 預(yù)孵育可顯著抑制ETEC 粘附于腸道上皮細(xì)胞IPEC-J2。植物乳桿菌代謝的活性物質(zhì)也有助于競(jìng)爭(zhēng)粘附，Liu 等[50]發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物乳桿菌WLPL04 所產(chǎn)EPS 質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，可通過競(jìng)爭(zhēng)、置換和排斥三種方式顯著抑制STEC O157:H7 對(duì)HT-29 細(xì)胞的粘附。Singh 等[51]發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)植物乳桿菌的粘液結(jié)合蛋白Mubs5s6 并外源添加后可顯著降低EPEC 對(duì)Caco-2 和HT-29細(xì)胞的粘附率（分別降低至81%和68%）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Mubs5s6 具有與宿主腸道特異性結(jié)合的相關(guān)位點(diǎn)，推測(cè)粘液結(jié)合蛋白Mubs5s6 是介導(dǎo)植物乳桿菌抑制EPEC 粘附的關(guān)鍵物質(zhì)。競(jìng)爭(zhēng)粘附是植物乳桿菌保護(hù)宿主腸道的重要機(jī)制，其主要通過代謝活性物質(zhì)等多種機(jī)制在腸道內(nèi)與大腸桿菌競(jìng)爭(zhēng)粘附，從而抑制病原菌粘附于宿主腸道。

1.4 腸道免疫調(diào)節(jié)

腸道免疫是機(jī)體清除E.coli、減少感染損失的重要途徑[52]。STEC 感染可導(dǎo)致機(jī)體的固有免疫功能發(fā)生損傷，其中STX 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)是STEC 致病的關(guān)鍵機(jī)制[53,54]。首先，STEC 進(jìn)入腸道破壞腸道黏膜后定植于腸道，釋放STX 并通過腸道屏障進(jìn)入體循環(huán)[6]。此時(shí)巨噬細(xì)胞則刺激相關(guān)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)：M1巨噬細(xì)胞可促進(jìn)干擾素IFN-γ、腫瘤壞死因子TNF-α和IL-6 等相關(guān)促炎因子表達(dá)，而M2 巨噬細(xì)胞則刺激抗炎因子IL-1α、IL-10 和TGF-β大量表達(dá)，以緩解炎癥反應(yīng)，啟動(dòng)腸道組織修復(fù)[55]。Kakisu 等[56]報(bào)道植物乳桿菌CIDCA 83114 可通過與STX 結(jié)合，緩解細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示植物乳桿菌CIDCA 83114 可降低STEC O157:H7 對(duì)Vero 細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌細(xì)胞表面有STX 毒素結(jié)合位點(diǎn)，使STX與植物乳桿菌結(jié)合從而保護(hù)Vero細(xì)胞免受STX毒性作用。當(dāng)STEC 進(jìn)一步侵染宿主（小鼠），并導(dǎo)致其體重下降、嚴(yán)重腹瀉以及腸道內(nèi)菌群紊亂，Hu 等[57]發(fā)現(xiàn)及時(shí)補(bǔ)充植物乳桿菌NJ56 制劑21 d，小鼠腸道內(nèi)的類桿菌、幽門螺桿菌和志賀氏菌等致病菌的豐度減少，產(chǎn)丁酸細(xì)菌和乳桿菌豐度增加，小鼠體質(zhì)量逐漸增加，腹瀉癥狀減輕。說明植物乳桿菌NJ56 可調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制STEC 生長，緩解小鼠因病原菌誘導(dǎo)的腸道炎癥。

同樣，當(dāng)ETEC 侵染宿主，定植于小腸表面，其產(chǎn)生的腸毒素可促進(jìn)氯離子的分泌，增加腸腔的滲透壓并引起炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腹瀉[58]。腸道中腸毒素不斷釋放并激活NF-κB 信號(hào)通路，而NF-κB 的激活促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增加TNF-α、IL-6 等促炎因子的表達(dá)[58]。植物乳桿菌對(duì)機(jī)體腸道免疫具有促進(jìn)作用，可抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，減少E.coli侵染所致的損傷。Wang 等[59]在ETEC 感染前預(yù)孵育植物乳桿菌ZLP001，發(fā)現(xiàn)可顯著下調(diào)小鼠體內(nèi)促炎因子IL-6、IL-8 和TNF-α表達(dá)水平，減輕小鼠的因感染而引起的炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZLP001 處理還可上調(diào)宿主防御肽（Host Defense Peptides，HDPs）pBD2 和PG1-5的表達(dá)量，表明植物乳桿菌ZLP001 通過抑制炎癥因子和誘導(dǎo)HDPs 表達(dá)，以保護(hù)宿主腸道免受細(xì)菌感染。小鼠腸道內(nèi)菌群失衡可加重因感染ETEC 導(dǎo)致的腹瀉癥狀[60]。Yue 等[58]發(fā)現(xiàn)小鼠受ETEC 侵染后，腸道內(nèi)變形桿菌和假單胞菌豐度增加，雙歧桿菌屬、紫單胞菌科和異桿菌屬豐度則降低。用植物乳桿菌FCQNA30M6處理后可顯著增加雙歧桿菌屬、紫單胞菌科、異桿菌屬和片球菌屬豐度，降低假單胞菌和變形桿菌豐度，使小鼠腸道菌群重新達(dá)到平衡。綜合上述，致病E.coli侵染宿主后可通過釋放毒素激活腸道免疫系統(tǒng)，并使腸道內(nèi)菌群紊亂，導(dǎo)致宿主腹瀉。而植物乳桿菌則可調(diào)節(jié)腸道相關(guān)炎癥因子的表達(dá)量且平衡腸道菌群，緩解炎癥反應(yīng)并減輕腹瀉，保護(hù)宿主腸道。

圖1 植物乳桿菌對(duì)致病大腸桿菌拮抗作用機(jī)制Fig.1 The mechanism of Lb. plantarum inhibiting pathogenic E. coli

2 高效拮抗性植物乳桿菌的應(yīng)用

2.1 養(yǎng)殖業(yè)

在養(yǎng)殖業(yè)中，植物乳桿菌常以補(bǔ)充劑的形式加入飼料中，用于禽類、畜類和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中可改善飼料的轉(zhuǎn)化率，提高經(jīng)濟(jì)效益。ETEC K88 是引起畜禽類感染的主要致病E.coli，可導(dǎo)致牲畜腹瀉、生長緩慢，甚至死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[61]。Wang 等[62]將植物乳桿菌B1 添加到飼料中，喂養(yǎng)感染ETEC K88的肉雞28 d，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌處理可以顯著減少宿主腸道中的ETEC K88 數(shù)量，緩解肉雞的感染癥狀、促進(jìn)肉雞的體重增長，表明植物乳桿菌B1 可減輕由ETEC K88 感染引起的生長抑制。類似研究中，Wang等[63]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加植物乳桿菌BG0001 可使仔豬的平均日增重升高，腸道內(nèi)E.coli減少，糞便中的乳桿菌豐度增加，在替抗養(yǎng)殖過程中具有較好應(yīng)用潛力。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水產(chǎn)密度高、換水頻率低不利于魚類代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)排放，導(dǎo)致魚類生長速率降低和飼料轉(zhuǎn)化效率低[64]。Mohammadi 等[65]在羅非魚的飼養(yǎng)過程中添加植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低養(yǎng)殖水中的總氨氮、NO2、NH3濃度，減少羅非魚體內(nèi)的病原菌數(shù)量，降低體內(nèi)毒素水平，增強(qiáng)體內(nèi)的消化酶活性、細(xì)胞因子和呼吸強(qiáng)度。添加植物乳桿菌可降低養(yǎng)殖水中有害物質(zhì)的堆積，改善水質(zhì)并提高羅非魚的存活率。

2.2 食品加工制造

植物乳桿菌在食品中應(yīng)用主要為三種方式，即純化的活性代謝產(chǎn)物、無菌發(fā)酵液或以菌體為發(fā)酵劑。Tenea等[66]用植物乳桿菌UTNGt2中分離純化的細(xì)菌素溶液浸泡新鮮番茄，細(xì)菌素Gt2 穿透番茄表面并在其表面形成保護(hù)膜，將番茄的保存期從7 d 延長至17 d。Zhang 等[67]應(yīng)用植物乳桿菌STCC0007 制備的發(fā)酵液對(duì)蓮藕實(shí)現(xiàn)保鮮效果。以乳酸和真空為保存條件可以減緩蓮藕的氧化反應(yīng)，有利于保持其顏色和硬度并有效抑制病原菌生長，顯著降低E.coliO157:H7 的存活率。另外，以植物乳桿菌為發(fā)酵劑還可減少食品處理過程有害物質(zhì)的堆積。Feng 等[68]將植物乳桿菌X23 涂抹于新鮮的馬鮫魚表面后進(jìn)行曬干，與未處理組相比，涂抹后的馬鮫魚肉中游離氨基含量更高，魚肉的酸值和有害物質(zhì)組胺均降低，可作為曬干馬鮫魚的生物保鮮劑。本作者以植物乳桿菌為發(fā)酵劑應(yīng)用于干式熟成牛肉中，發(fā)現(xiàn)熟成過程中可抑制STEC O157:H7 生長，還可促進(jìn)乳酸菌生長（暫未發(fā)表）。

2.3 臨床治療

植物乳桿菌常以活菌制劑的方式用于緩解E.coli感染引起的炎癥或治療腸道菌群失衡引起的慢性腹瀉。Chingwaru 等[69]從食品中分離了3 株植物乳桿菌CLP1、CLP2 和CLP3，均可顯著抑制多株引起兒童腸胃炎的E.coli，顯示具有治療兒童腹瀉的潛質(zhì)。健康者腸道內(nèi)的主要菌群為厚壁菌門（占比最高）、擬桿菌、放線菌和變形桿菌，而慢性腹瀉患者腸道中變形桿菌的相對(duì)豐度高于健康者[70,71]。Yang 等[71]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可干預(yù)因ETEC 感染導(dǎo)致的腸道菌群失衡和慢性腹瀉，受試者服用植物乳桿菌CCFM1143 的4 周內(nèi)腸道內(nèi)擬桿菌豐度顯著降低。分析發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM1143主要通過增加厚壁菌的豐度以恢復(fù)腸道微生物群，同時(shí)降低血清中促炎因子TNF-α、IL-6 和增加體內(nèi)SCFAs含量，共同作用調(diào)節(jié)受試者腸道免疫，進(jìn)而減少排便次數(shù)，緩解腹瀉癥狀。同樣，Liu 等[72]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌還可緩解腸易激綜合征的臨床癥狀，給患者服用12 周植物乳桿菌CCFM8610 后患者腸道內(nèi)微生物多樣性顯著增加并趨于正常人水平，并促進(jìn)受試者的腸道蠕動(dòng)、增加排便，進(jìn)而緩解腹脹癥狀。

圖2 植物乳桿菌的應(yīng)用Fig.2 The Application of Lb. plantarum

3 結(jié)論

植物乳桿菌由于其天然、安全、高效的特性，在食品和臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。然而由于研究技術(shù)和應(yīng)用模式的局限，植物乳桿菌在實(shí)際應(yīng)用中還面臨一些問題。首先，在植物乳桿菌產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面，純化的代謝產(chǎn)物（活性肽、EPS等）活性高，但存在純化成本高、步驟繁瑣、回收率低等缺點(diǎn)，不利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。其次，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床效果存在差異，植物乳桿菌菌株差異疊加宿主個(gè)體差異會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室中的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際效果具有一定偏差，其有效性受到質(zhì)疑。再次，現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)大部分基于植物乳桿菌體外效果評(píng)估，而體內(nèi)效果僅限于動(dòng)物模型預(yù)測(cè)，目前缺乏感染者實(shí)際應(yīng)用效果的長期跟蹤數(shù)據(jù)?？紤]到人體腸道微生態(tài)的復(fù)雜性，植物乳桿菌在抑制病原菌和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)方面的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入探究。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，基于微生物基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組等的新技術(shù)為植物乳桿菌的抑菌研究提供了更好的平臺(tái)。在未來的研究中，研究者可應(yīng)用宏基因組聯(lián)合代謝組學(xué)手段精準(zhǔn)設(shè)計(jì)微生物篩選培養(yǎng)基，高效挖掘更多本土優(yōu)質(zhì)菌種資源，探索微生物源抗菌物質(zhì)的最優(yōu)純化條件或體外表達(dá)條件，為規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支撐。同時(shí)，研究者可應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)解析植物乳桿菌作用的基礎(chǔ)物質(zhì)及其作用靶點(diǎn)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過代謝通路阻斷實(shí)現(xiàn)致病菌靶向抑制。此外，近年發(fā)展的器官芯片（如腸道芯片）技術(shù)給人體病原菌感染治療提供了新的評(píng)估手段，通過器官芯片建立評(píng)估模型，應(yīng)用體外仿真模擬植物乳桿菌在抑菌和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的作用效果，同時(shí)結(jié)合動(dòng)物模型的進(jìn)一步驗(yàn)證，研究者們有望實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌抑菌機(jī)制研究的新突破。而在臨床應(yīng)用方面，研究者可持續(xù)跟蹤感染人群治療后腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，通過組學(xué)技術(shù)多層面探究植物乳桿菌與腸道菌群的互作方式，進(jìn)而獲得治療效果的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。因此，基于組學(xué)大數(shù)據(jù)庫、新型篩選模型及多層次、多模式的益生菌功能挖掘，將是益生菌在致病菌防控和疾病輔助治療研究的未來新方向。

綜上所述，植物乳桿菌是一種具有高效拮抗致病大腸桿菌功能的益生菌，在養(yǎng)殖業(yè)、食品加工制造業(yè)和臨床治療中具有良好的應(yīng)用前景。在未來的研究應(yīng)基于體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，聯(lián)合多組學(xué)技術(shù)繼續(xù)開發(fā)植物乳桿菌更廣泛的應(yīng)用模式。