脈沖電場(chǎng)技術(shù)通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成和殺滅微生物的研究進(jìn)展

劉思敏，王謙鑫宏，常鈞棋，劉俊楠，趙東凱*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117）（2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117）（3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院肺病科，吉林長(zhǎng)春 130117）

傳統(tǒng)的食品加工技術(shù)會(huì)存在對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食品安全產(chǎn)生不利影響的隱患，可能會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)流失，有害物質(zhì)增加，最終影響人體健康[1,2]。傳統(tǒng)食品加工技術(shù)主要應(yīng)用在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提取，微生物及其孢子的滅活，活性酶的滅活等方面，多數(shù)技術(shù)已經(jīng)形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，比如熱處理技術(shù)[1,3,4]。工業(yè)化生產(chǎn)的代價(jià)就是犧牲食品本身新鮮口感提高食品生產(chǎn)效率[5,6]。此外，許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有熱敏性，在熱處理時(shí)會(huì)因熱降解而失去生物活性，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累[7]。

傳統(tǒng)食品加工技術(shù)給食品帶來的營(yíng)養(yǎng)流失、試劑殘留和化學(xué)添加劑過多等一系列問題開始讓人們對(duì)食品安全產(chǎn)生擔(dān)憂[8]。所以人們迫切尋找一種新興食品加工技術(shù)，這些技術(shù)不僅減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，增加食品安全性，甚至可以通過刺激食品自身的生物合成的代謝途徑來生成人們所需要的一些重要化合物，例如酚類、胡蘿卜素和蛋白等，這些新興技術(shù)通過生物合成途徑來改善食品的質(zhì)量[9-11]。這些技術(shù)中包括高靜壓、脈沖電場(chǎng)、超聲，紫外線等[12-17]。

由于近年來PEF在食品加工應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)越來越明顯，所以關(guān)于PEF 技術(shù)在食品中應(yīng)用的研究越來越多[18]，PEF 相對(duì)于其他技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是能降低對(duì)食品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損害，延長(zhǎng)保存時(shí)間，殺滅食品中有害微生物[19-23]。PEF 是一種脈沖發(fā)射持續(xù)時(shí)間為微秒至毫秒、強(qiáng)度為0.1～80 kV/cm 的強(qiáng)電場(chǎng)短脈沖技術(shù)[23]，現(xiàn)在主要研究方向是在食品的有效物質(zhì)提取、微生物滅活、干燥和解凍等領(lǐng)域[24-26]，但是關(guān)于脈沖電場(chǎng)技術(shù)通過影響生物代謝途徑來誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成的研究較少。

植物受到PEF刺激后會(huì)分泌大量代謝產(chǎn)物來保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷，增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累[27-29]。PEF 處理后的植物組織中蛋白和多酚類等這種初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物含量會(huì)大幅增加。這些植物類食品受到PEF 處理后產(chǎn)生的抗氧化的代謝產(chǎn)物正是保護(hù)人體細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的營(yíng)養(yǎng)成分[30,31]。

植物細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)外界刺激發(fā)生即時(shí)反應(yīng)，釋放出脅迫信號(hào)因子激活信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，繼而參與轉(zhuǎn)錄因子的合成，最終生成代謝產(chǎn)物，這是植物食品在受到PEF 處理后的應(yīng)激生理學(xué)[32-35]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)因此而增加[36]。PEF 增加了細(xì)胞膜的通透性，這一特征觸發(fā)了細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，類似于傷害應(yīng)激[37]，然后分泌大量抗氧化物質(zhì)保護(hù)機(jī)體免受傷害。此外，過量的ROS 積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致微生物死亡，達(dá)到殺菌的目的[38-40]。

本文綜述了PEF通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成提高有效成分提取率。此外還總結(jié)了PEF通過氧化應(yīng)激途徑殺滅微生物的機(jī)制，為PEF 技術(shù)通過氧化應(yīng)激途徑影響食品質(zhì)量的研究方向提供參考。

1 PEF 誘導(dǎo)植物性食品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成

早期研究發(fā)現(xiàn)PEF通過刺激細(xì)胞從而使細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）的產(chǎn)生量大量增加[41]。ROS 的產(chǎn)生與細(xì)胞的健康狀態(tài)緊密相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞遭到外界刺激損傷，植物細(xì)胞的一個(gè)共同的特征應(yīng)激反應(yīng)就是產(chǎn)生ROS。當(dāng)細(xì)胞膜受損破裂后，ATP 從受損的細(xì)胞中釋放出來，與細(xì)胞膜受體結(jié)合后產(chǎn)生ROS[42,43]，此過程還會(huì)產(chǎn)生乙烯與茉莉酸，所有這些次生脅迫信號(hào)分子都會(huì)通過細(xì)胞擴(kuò)散，并啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成[44]，產(chǎn)生出的ROS和乙烯會(huì)誘導(dǎo)酚類化合物的生物合成[45]，而乙烯和茉莉酸會(huì)誘導(dǎo)硫代葡萄糖苷的生物合成[46]。另一方面，ROS 會(huì)誘導(dǎo)類胡蘿卜素類化合物合成[47]。

1.1 酚類和胡蘿卜素

Galind 等[48]在馬鈴薯組織上施加PEF，使組織產(chǎn)生創(chuàng)傷，繼而誘導(dǎo)一系列代謝發(fā)生。首先大量ROS爆發(fā)式產(chǎn)生[49]，與受體結(jié)合后產(chǎn)生大量的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物。馬鈴薯組織恢復(fù)階段時(shí)，將產(chǎn)生大量綠原酸來提高組織對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)[50]，接下來將合成多肽來增加蛋白質(zhì)的含量應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷。這一研究發(fā)現(xiàn)為我們通過PEF刺激植物組織來提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供研究思路，如圖1 所示。

Leong 等[51]研究了PEF 處理不同種類胡蘿卜，通過體外實(shí)驗(yàn)考察這些提取物對(duì)過氧化氫氧化損傷后的細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.8 kV/cm 條件下得到的Yellow Solar Purée提取物可顯著增加Caco-2細(xì)胞的活力，并抑制乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）泄漏和NO 的產(chǎn)生。PEF 提取的胡蘿卜提取物對(duì)細(xì)胞活力起到很好的保護(hù)作用，能夠使氧化應(yīng)激（含H2O2）細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)和NO 產(chǎn)生百分率恢復(fù)到與非應(yīng)激（無H2O2）細(xì)胞相似的水平。此外還發(fā)現(xiàn)，PEF 提取物對(duì)細(xì)胞保護(hù)能力與總胡蘿卜素含量與總花青素含量呈線性關(guān)系。對(duì)于總胡蘿卜素含量較低的Yellow Solar，PEF 能顯著提高它的胡蘿卜素含量[51,52]。Leong 等[53]發(fā)現(xiàn)PEF 處理后可以縮短對(duì)VitisVinifera 的浸泡時(shí)間并提高對(duì)H2O2氧化脅迫的生物保護(hù)作用。Leong 等[54]又評(píng)價(jià)了脈沖電場(chǎng)對(duì)黑比諾葡萄汁花色苷釋放及保健作用的影響，同樣得到PEF 處理后的黑比諾葡萄能夠生成具有更強(qiáng)抗氧化活性的物質(zhì)，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的能力。

PEF 加工后的番茄含有的葉黃素、胡蘿卜素、反式番茄紅素、順式番茄紅素的濃度都遠(yuǎn)高于熱處理加工的含量，這是因?yàn)榉咽艿絇EF 的傷害后，受損細(xì)胞釋放出ATP，ATP 作為創(chuàng)傷信號(hào)在細(xì)胞空隙間擴(kuò)散，激發(fā)了番茄的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)了番茄的代謝活性并合成大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[55-58]。應(yīng)用PEF 處理可生產(chǎn)出更多的高水平順式異構(gòu)體的營(yíng)養(yǎng)素，順式異構(gòu)體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在人體內(nèi)的生物利用率更高[36]，如圖1 所示。Martínez等[59]采用PEF 技術(shù)輔助提取Dried Rhodotorulaglutinis Yeast 中類胡蘿卜素，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化提高PEF對(duì)類胡蘿卜素的提取率，未使用PEF 處理的提取率為20%，使用PEF 處理后提取率增加到80%。Kokkali等[60]研究發(fā)現(xiàn)PEF 處理后的微藻生物提取物的抗氧化能力顯著增強(qiáng)。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)因素考察發(fā)現(xiàn)提取溶劑類型和提取時(shí)間能顯著影響微藻生物中類胡蘿卜素和酚類化合物的提取效率，這表明溶劑和時(shí)間會(huì)影響PEF 對(duì)植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。PEF 能提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在植物類食品內(nèi)合成的數(shù)量，可以利用這項(xiàng)優(yōu)勢(shì)為含量低的活性物質(zhì)定制專屬提取參數(shù)，利用PEF 技術(shù)合成更多人們所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[51,52]。

1.2 皂苷類

皂苷類成分對(duì)身人類身體健康有很大的益處，如促進(jìn)抗體的產(chǎn)生和保護(hù)神經(jīng)、抗抑郁、提高免疫力、抗焦慮、保護(hù)心臟、抗炎、抗細(xì)菌、抗哮喘和止瀉作用等[61-65]。

Liu 等[66]研究了脈沖電場(chǎng)提取的人參皂苷對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的HEK-293 細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEF提取物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于溶劑冷浸法提取物。加入PEF 提取物后顯著降低了HEK-293細(xì)胞活性氧的積累，使HEK-293 細(xì)胞保持了更健康的細(xì)胞狀態(tài)。說明PEF 提取的人參總皂苷具有更強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化能力。

Hou 等[67]對(duì)脈沖電場(chǎng)的電場(chǎng)強(qiáng)度和頻率進(jìn)行優(yōu)化，在電場(chǎng)強(qiáng)度為20 kV/cm、頻率為6 000 Hz、φ=70%乙醇-水溶液、速度為150 L/h 的條件下，人參皂苷得率最高，為12.69 mg/g。與微波輔助提取法、熱回流提取法、超聲波輔助提取法、溶劑提取法和超高壓提取法等方法進(jìn)行比較，PEF 的人參皂苷提取率明顯增高，而且時(shí)間縮短。Lu 等[68]為了增加人參皂苷的產(chǎn)率，采用了PEF 結(jié)合β-葡萄糖苷酶法提取人參總皂苷。在單極脈沖模式下，PEF 對(duì)β-葡萄糖苷酶的活性沒有影響[69]。根據(jù)響應(yīng)面法得出電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm，脈沖次數(shù)10 次，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的最優(yōu)條件，在該條件下人參總皂苷的提取率為38.15 mg/g，明顯加快了提取時(shí)間，增大了提取效率。脈沖電場(chǎng)技術(shù)提取皂苷類成分，不僅加大了提取效率，更是使皂苷類的生物活性能力顯著提高，這為我們以后提取具有更高生物活性類的皂苷類成分提供了新的研究方向。

1.3 硫代葡萄糖苷

硫代葡萄糖苷由于具有抗菌、保護(hù)神經(jīng)和抗癌等作用，所以在制藥和食品工業(yè)中具有特殊的地位[70-75]，但是具有水溶性和熱敏性的特征，所以它們?cè)诩訜徇^程中會(huì)有很大的損失，提取這類成分時(shí)候盡量避免熱處理[74,75]。硫代葡萄糖苷在植物組織的亞細(xì)胞間隔中保持穩(wěn)定化學(xué)性能和生物活性，當(dāng)細(xì)胞破裂后黑芥子酶會(huì)與硫代葡萄糖苷接觸，將硫代葡萄糖苷水解，所以硫代葡萄糖苷的損失與黑芥子酶的是否滅活緊密相關(guān)，PEF 能否通過對(duì)黑芥子酶滅活來達(dá)到保留硫代葡萄糖苷的目的也成為新的研究對(duì)象[76-78]。

西蘭花中的黑芥子酶催化硫代葡萄糖苷酸使其發(fā)生酶解反應(yīng)，生成其他生物活性產(chǎn)物，這些產(chǎn)物的含量被認(rèn)為是影響西蘭花產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素。Frandsen 等[79]發(fā)現(xiàn)35 kV/cm 的PEF 處理會(huì)使黑芥子酶失去活性，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)硫代葡萄糖苷在PEF處理之前已被降解，如果保證PEF 能成功提取硫代葡萄糖苷需要通過高壓處理使黑芥子酶失活。

Ingrid 等[80]采用脈沖電場(chǎng)技術(shù)對(duì)西蘭花花莖中硫代葡萄糖苷進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEF 預(yù)處理后的西蘭花花莖中葡糖豆素、硫蘿卜素、芥菜素和新芥菜素增加了大約兩倍，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)黑芥子酶仍然保持活性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEF 可以在酶沒有失活的條件下，加大硫代葡萄糖苷類化合物的提取效率，這可能成為新的研究方向。

表1 PEF 通過氧化應(yīng)激途徑對(duì)生物活性物質(zhì)合成的影響Table 1 Effect of PEF on the synthesis of bioactive substances through the oxidative stress pathway

Naima等[81]對(duì)完整的黑墨西哥甜玉米細(xì)胞施加了脈沖電場(chǎng)，發(fā)生的電滲透誘導(dǎo)了一代氧物種（氧化跳躍），這種氧化跳躍與電滲透呈線性關(guān)系，但是與細(xì)胞活性喪失沒有相關(guān)性，這樣的結(jié)果與哺乳動(dòng)物細(xì)胞觀察到的結(jié)果不同，表明即使在對(duì)哺乳動(dòng)物或完整的植物細(xì)胞進(jìn)行脈沖處理時(shí)觀察到相同的現(xiàn)象，相關(guān)的代謝反應(yīng)也不同。

2 PEF 通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)微生物凋亡

PEF 是一種常溫條件下使食品中微生物滅活的新技術(shù)。PEF 在食品滅菌中的應(yīng)用不僅不會(huì)改變食品的新鮮度和口感，而且能保證滅菌的質(zhì)量。PEF 對(duì)微生物的滅活的原理是由于微生物的細(xì)胞膜在PEF的的作用下發(fā)生不可逆穿孔孔并使半滲透屏障遭到破壞[82]。除此以外，PEF 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)改變細(xì)菌的代謝，從而誘導(dǎo)微生物的凋亡。微生物的滅活意味著能保留更多食品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和降低口感的損失[82,83]。

孟媛媛等[84]從ROS 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激角度探討PEF 對(duì)金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制。經(jīng)PEF 處理后，金黃色葡萄球菌內(nèi)的ROS 水平升高，過量的ROS 誘導(dǎo)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA 氧化和細(xì)胞膜脂肪酸損傷、蛋白質(zhì)和DNA 的結(jié)構(gòu)損傷以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著異常，最終導(dǎo)致ROS 介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞凋亡[84]，如圖2 所示。

圖2 PEF 通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡Fig.2 PEF induces bacterial apoptosis via oxidative damage pathway

Liu 等[85]以質(zhì)譜為基礎(chǔ)比較了PEF 處理前后大腸桿菌蛋白表達(dá)變化。已有文獻(xiàn)表明活性氧（ROS）的過度積累可以顯著降低超氧化物歧化酶缺乏的腸沙門氏菌中AcnB 的蛋白水平[86]。另一種上調(diào)的酶是雙功能脯氨酸利用酶A（PutA；A0A0G3K113），PutA 在大腸桿菌中的缺失已被證明會(huì)增加細(xì)胞對(duì)氧化損傷的敏感性[87]。對(duì)大腸桿菌施加PEF 后膜透性增加，這不僅增加有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，還會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生滲透失衡[88]。足夠強(qiáng)的電場(chǎng)能夠在細(xì)胞膜上造成不可修復(fù)的穿孔，導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷、破壞，并最終死亡[89]，如圖2 所示。一般認(rèn)為當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到5～15 kV/cm時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生不可逆損傷。這與觀察結(jié)果一致，即15 kV/cm以上強(qiáng)度的脈沖電場(chǎng)對(duì)膜擊穿是必要的[90,91]。為了保證微生物的滅活率，所以要保證場(chǎng)強(qiáng)為25 kV/cm或以上的電場(chǎng)電場(chǎng)來確保食品加工中病原體的滅活[92]。

3 結(jié)論

PEF 作為一種非熱處理的食品加工技術(shù)，通過氧化應(yīng)激途徑來增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和殺滅微生物是一個(gè)新的研究方向。在食品加工領(lǐng)域中能將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成并累積到最大量正是食品加工工藝?yán)镒钕∪钡?。PEF 通過對(duì)植物細(xì)胞造成損傷，來刺激植物機(jī)體分泌代謝產(chǎn)物從而達(dá)到增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。PEF 技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的提取技術(shù)有具有更強(qiáng)的提取效率，這樣使PEF 對(duì)植物類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提取量達(dá)到最大化。PEF 提取出來的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)人體的保健作用更加明顯。通過PEF 刺激后生成的順式異構(gòu)體代謝物能夠更好的被人體吸收，PEF 的提取物能顯著提高細(xì)胞活力。我們可以通過這一理論為那些保健作用效果強(qiáng)但是含量較低的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)定制提取方法。

除了能加大生物活性物質(zhì)積累，PEF 刺激后產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷同樣能達(dá)到殺滅微生物作用。膜損傷是微生物失活的主要原因，此外PEF 還會(huì)通過氧化應(yīng)激途徑影響微生物的代謝，通過影響微生物的蛋白表達(dá)、損傷遺傳物質(zhì)來達(dá)到殺滅微生物的目的。在殺滅微生物的過程中沒有熱效應(yīng)，不會(huì)影響食品的口感，甚至還會(huì)增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。

通過PEF 處理導(dǎo)致食品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增高，微生物含量低，食品質(zhì)量參數(shù)如口感、顏色等沒有不良反應(yīng)，這樣生產(chǎn)出來的食品可以在市場(chǎng)上作為商品或者食品加工原料。