腈水解酶反應(yīng)機(jī)制與催化性能調(diào)控研究進(jìn)展

湯曉玲，鄭仁朝，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310014)

腈水解酶屬于腈化合物代謝酶系中的一種，能夠催化有機(jī)腈水解生成羧酸和氨[1]。腈水解酶具有獨(dú)特的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，是制備高附加值羧酸的“綠色”選擇[2]。腈水解酶在醫(yī)藥、環(huán)保、化工、食品和紡織農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[3-8]。浙江工業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)于2003年參加了歐陽(yáng)平凱院士任首席科學(xué)家的國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目“生物催化和生物轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵問(wèn)題的基礎(chǔ)研究(2003CB716000)”中課題五“腈水合反應(yīng)和腈水解反應(yīng)的方法學(xué)及催化機(jī)理”的研究，對(duì)腈水解酶的篩選、改造、表征和催化機(jī)制等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并將其應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)藥等工業(yè)化生產(chǎn)，先后建成(R)-扁桃酸、加巴噴丁、普瑞巴林和2-氯煙酸等醫(yī)藥和農(nóng)藥化學(xué)品的規(guī)?；a(chǎn)裝置，成為國(guó)際上腈水解酶研究開發(fā)成功的單位之一[9]。隨著高端醫(yī)藥、農(nóng)藥和材料對(duì)復(fù)雜(手性)羧酸化合物需求的迅速增長(zhǎng)，腈水解酶在高端精細(xì)化學(xué)品合成中展現(xiàn)出日益巨大的應(yīng)用潛力。所以開展腈水解酶催化機(jī)制解析及催化性能調(diào)控研究，對(duì)提升腈水解酶工業(yè)應(yīng)用屬性，拓寬其應(yīng)用范圍具有重要意義。

1 腈水解酶的來(lái)源與分類

腈水解酶由Thimann等[10]于1964年首次從大麥葉中分離得到，具有水解吲哚乙腈的活性。此外，該酶還對(duì)26種不同的腈化合物具有水解活性。由此這類酶被命名為腈水解酶[11]。Hook等[12]以蓖麻堿為碳源，篩選得到產(chǎn)腈水解酶的微生物(來(lái)源于Pseudomonas)。此后，以腈化合物為唯一碳源或氮源，在細(xì)菌和真菌中均發(fā)現(xiàn)了腈水解酶，包括假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、紅球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、諾卡菌屬等細(xì)菌來(lái)源的腈水解酶[13-14]；赤霉菌、紅球線蟲、鐮刀菌、黑曲霉等真菌來(lái)源的腈水解酶[15-17]；水稻、煙草、玉米、擬南芥等植物來(lái)源的腈水解酶[18-19]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)的腈水解酶來(lái)源近50種[20]。

根據(jù)腈水解酶催化的腈化合物結(jié)構(gòu)，可將其分為三類[21]：①能夠作用于脂肪腈(丙烯腈和戊二睛)的脂肪族腈水解酶(aliphatic nitrilase)；②能夠水解芳香族腈(苯甲腈)的芳香族腈水解酶(aromatic nitrilase)；③能夠水解含?；倌軋F(tuán)腈類化合物(酰基乙腈)的腈水解酶(acyl nitrilase)。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有些腈水解酶表現(xiàn)出比較廣泛的底物適應(yīng)性，如Rhodococcussp.NDB1165來(lái)源的腈水解酶對(duì)芳香族和脂肪族腈類化合物均具有水解活性[22]；Syechocystissp.PCC6803 來(lái)源腈水解酶既對(duì)富馬腈、丁腈等脂肪族腈類具有活性，同時(shí)又對(duì)苯乙腈等芳香族腈以及 2-氰基吡啶和3-氰基吡啶等雜環(huán)類腈具有催化活性[23]。

2 腈水解酶的催化機(jī)制

在對(duì)腈水解酶研究的早期，由于腈水解酶晶體結(jié)構(gòu)少，學(xué)者們只能通過(guò)對(duì)腈水解酶序列的比對(duì)分析，結(jié)合腈水解酶超家族的晶體結(jié)構(gòu)，推測(cè)腈水解酶序列和結(jié)構(gòu)特征關(guān)系。近幾十年來(lái)，Syechocystissp.PCC6803 腈水解酶Nit6803(PDB：3WUY)、Pyrococcus abyssiGE5腈水解酶PaNit(PDB：3IVZ)和擬南芥腈水解酶NIT4(AtNIT4，PDB：6I00)等晶體結(jié)構(gòu)被研究解析：腈水解酶單亞基蛋白是一種αββα三明治結(jié)構(gòu)，一般都含有保守的催化三聯(lián)體Glu-Lys-Cys[24]，在溶液中，腈水解酶亞基圍繞特殊的“A”界面形成αββα-αββα二聚體結(jié)構(gòu)[25]。該界面之間的鹽橋、疏水作用等作用維持了腈水解酶二聚體的穩(wěn)定[26-27]。腈水解酶的二聚體結(jié)構(gòu)是低聚化形成具有活性的多聚體的主要單元[28]。除了Fusarium solani、Arthrobactersp.J1和Rhodococcus rhodochrousPA-34等少數(shù)腈水解酶以單聚體或者二聚體形式存在之外[24,29]，大部分腈水解酶具有催化活性的多聚體單元由4～22個(gè)亞基組成(呈月牙形、八字形、環(huán)形或者C字形)[24-25,30-31]。腈水解酶還包含C界面、D界面和F界面等一些特殊作用界面(圖1)，如果其A界面、C界面的氨基酸被替換后可引起腈水解酶活性、立體選擇性、熱穩(wěn)定性和底物特異性等性能的變化[3,32-33]。

圖1 腈水解酶AtNIT4晶體結(jié)構(gòu)以及A、C等特殊界面[34]Fig.1 Crystal structure of nitrilase AtNIT4 and the interfaces(A,C) of the nitrilase monomers in the supramolecular spirals or helices[34]

目前，腈水解酶的催化機(jī)制尚未完全明確。最早提出、也最被廣泛認(rèn)可的腈水解酶催化機(jī)制認(rèn)為：腈水解酶一般含有保守的催化位點(diǎn)Glu、Lys和Cys，底物進(jìn)入活性中心后，Cys 殘基上的巰基首先攻擊底物氰基上的α碳原子，形成酶-亞胺復(fù)合物，隨后 Glu 殘基提供質(zhì)子轉(zhuǎn)移給酶-亞胺復(fù)合物，氮原子得到質(zhì)子后消除亞胺結(jié)構(gòu)并釋放 NH+4并產(chǎn)生1分子羧酸(圖2，pathway A)[35]。在此過(guò)程中，Glu增強(qiáng)了對(duì)巰基的親核性，并參與質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程，而Lys則起到穩(wěn)定四面體結(jié)構(gòu)的作用[36-37]。一般認(rèn)為，腈水解酶僅會(huì)專一性地催化腈水解生成羧酸和氨，但現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)一些腈水解酶同時(shí)具有腈水合活性(即催化反應(yīng)的產(chǎn)物包括酰胺和羧酸)[38-41]。如，Piotrowski等[42]利用擬南芥腈水解酶催化β-氰基丙氨酸，反應(yīng)產(chǎn)物除天冬氨酸外，天冬酰胺的含量超過(guò)60%。此外，在細(xì)菌和真菌來(lái)源的腈水解酶催化反應(yīng)的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了酰胺的存在。同時(shí)，腈水解酶催化形成酰胺的機(jī)制與腈水合酶不同。根據(jù)推測(cè)的機(jī)制所示(圖2，pathway B)，Glu提供的質(zhì)子與溶劑中的水形成親核試劑攻擊中間體，將質(zhì)子轉(zhuǎn)移給Cys殘基，破壞與氰基α碳原子的硫醇形式而產(chǎn)生1分子酰胺。此外，空間位阻、底物取代基的電負(fù)性及反應(yīng)條件(如溫度和pH)等因素都可能影響反應(yīng)體系中羧酸與酰胺的比例[41,43]。

圖2 推測(cè)的腈水解酶催化機(jī)制[44]Fig.2 The proposed mechanism of nitrilase with hydrolysis and hydration activity[44]

Jiang等[40]通過(guò)改造Syechocystissp.PCC6803 腈水解酶Nit6803的反應(yīng)專一性，并對(duì)底物-腈水解酶中間四面體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，對(duì)腈水解酶pathway A和pathway B競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果提出了新的機(jī)制：在腈水解酶催化腈化合物生成中間體后，底物氮原子到催化位點(diǎn)Glu的氧原子的距離和催化位點(diǎn)Glu氧原子到Cys的硫原子的距離會(huì)影響羧酸和酰胺的生成比例。Yu 等[5]理性設(shè)計(jì)Synechocystissp.腈水解酶，使其立體選擇性發(fā)生反轉(zhuǎn)，并采用這一機(jī)制對(duì)其突變體酰胺含量的變化進(jìn)行了分析。

此外，腈水解酶超家族其余分支晶體結(jié)構(gòu)的解析也對(duì)腈水解酶催化機(jī)制提供了有益的參考。如，通過(guò)對(duì)Geobacillus pallidusRAPc8的脂肪族酰胺酶(PDB：2PLQ)的晶體結(jié)構(gòu)的研究，Kimani等[45]提出,除了保守的催化位點(diǎn)Glu、Lys和Cys之外，Lys附近保守序列中1個(gè)額外的Glu對(duì)?；?酶中間體的水解具有重要作用。同時(shí)，這一觀點(diǎn)也激發(fā)其他研究者的興趣，如Weber等[46]將來(lái)源于Geobacillus pallidusRAPc8腈水解酶的142位Glu替換為L(zhǎng)eu或Asp等氨基酸后發(fā)現(xiàn)，突變酶對(duì)所有底物都失去活性。這是因?yàn)樯鲜?個(gè)位點(diǎn)皆處于腈水解酶超家族的保守序列，該觀點(diǎn)也被一些腈水解酶的相關(guān)研究者認(rèn)可并采納，如Woodward 等[32]在對(duì)腈水解酶底物特異性進(jìn)行改造后發(fā)現(xiàn)，腈水解酶催化位點(diǎn)為E61-K148-E155-C182四聯(lián)體(圖3)。

催化四聯(lián)體為E61、K148、E155和C182圖3 植物腈水解酶NIT1結(jié)構(gòu)模型[32]Fig.3 Structural model of a plant NIT1-group nitrilase[32]

3 腈水解酶催化性能調(diào)控及應(yīng)用

由于天然腈水解酶催化非天然底物時(shí)活性低、選擇性低，且適應(yīng)工業(yè)環(huán)境能力弱等原因，限制了其廣泛應(yīng)用，對(duì)酶進(jìn)行調(diào)控以提高其應(yīng)用屬性具有重要意義。近二十年來(lái)，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)在系統(tǒng)闡明腈水解酶來(lái)源、結(jié)構(gòu)功能關(guān)系及作用機(jī)制的基礎(chǔ)上[11,47]，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該類酶多重催化屬性的調(diào)控。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者們對(duì)腈水解酶催化性能的設(shè)計(jì)改造取得顯著進(jìn)展。浙江工業(yè)大學(xué)鄭院士團(tuán)隊(duì)以鄰氯扁桃腈為底物，篩選獲得了系列具有重要應(yīng)用潛力的腈水解酶，并通過(guò)蛋白質(zhì)工程提升了來(lái)源于Pyrococcus horikoshii腈水解酶的立體選擇性，其雙突變體T132A/F189T的E值由17.3提升至大于200，且對(duì)鄰氯扁桃腈的催化活性提升至野生型的4.37倍[4]；創(chuàng)制了Acidovorax facilisZJB09122腈水解酶，可催化1-氰基環(huán)己基乙腈合成1-氰基環(huán)己基乙酸(加巴噴丁中間體)，且具有良好的活性、熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物耐受性，實(shí)現(xiàn)了加巴噴丁的高效酶法合成[48]；以來(lái)源于Arabis alpina具有較高立體選擇性腈水解酶AaNIT和來(lái)源于Brassica rapa具有較高活性的腈水解酶BrNIT為親本，構(gòu)建了逐段替換式嵌合酶構(gòu)建技術(shù)，獲得了活性和立體選擇性同步提升的最優(yōu)嵌合酶BaNIT。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)半理性設(shè)計(jì)策略確定5個(gè)“熱點(diǎn)”氨基酸殘基并構(gòu)建飽和突變文庫(kù)，篩選獲得的突變體BaNIT/L223Q/H263D/Q279E的酶活提升5.4倍，E值提高至500以上[49]。此外，國(guó)內(nèi)外其他團(tuán)隊(duì)也為腈水解酶催化性能的設(shè)計(jì)改造，并取得了相當(dāng)好的結(jié)果。如，Wu等[50-51]對(duì)A.facilis72W腈水解酶進(jìn)行改造，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體T201A和雙突變體F168V/L201N對(duì)羥基乙腈的催化活性比野生酶分別提升了6倍和14倍。Yu等[52]對(duì)Syechocystissp.PCC6803 腈水解酶Nit6803進(jìn)行改造，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三突變體P149A/I201A/F202V的催化活性是野生型的20.8倍。Gong等[53]利用半理性設(shè)計(jì)策略提升腈水解酶合成煙酸的催化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三突變體N40G/F50W/Q207E的催化活性是野生型的2倍。Kobayashi等[54]以吲哚-3-乙腈、噻吩-2-乙腈等為底物時(shí)，A.faecalisJM3來(lái)源腈水解酶突變體C162N比野生型展現(xiàn)了更高的催化活性。Xie等[55]利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)腈水解酶AtNIT1進(jìn)行改造，獲得催化活性提高3倍的突變體C236S。DeSantis等[56]對(duì)腈水解酶全基因序列進(jìn)行飽和突變改造，獲得了能夠在3 mol/L底物濃度下高效催化3-羥基戊二腈的突變體，其產(chǎn)物(R)-4-氰基-3-羥基丁酸是阿托伐他汀的關(guān)鍵手性中間體。

腈水解酶兼具腈水解與腈水合活性，即催化混亂性(catalytic promiscuity)[41-42]，使其在生物有機(jī)合成中既面臨挑戰(zhàn)，又蘊(yùn)含著巨大的潛力。筆者所在的研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了影響腈水解酶反應(yīng)專一性的關(guān)鍵因素，提出了酶進(jìn)攻底物特征距離對(duì)反應(yīng)選擇性的影響機(jī)制，建立了基于特征距離調(diào)控實(shí)現(xiàn)反應(yīng)選擇性雙向調(diào)控新方法，獲得了催化系列底物嚴(yán)格產(chǎn)生羧酸或酰胺的正、反向調(diào)控突變體，并將此調(diào)控策略成功應(yīng)用于多個(gè)腈水解酶。野生型Rhodococcus zopfii腈水解酶RZNIT催化2-氯煙腈時(shí)，酰胺含量高達(dá)88%，基于特征距離調(diào)控的改造策略，僅通過(guò)一個(gè)位點(diǎn)突變(W167G)，突變體的水解活性提升至野生型的20倍，催化2-氯煙腈時(shí)僅生成2-氯煙酸[37]。同樣，Tang等[57]通過(guò)錨定Paraburkholderia graminis腈水解酶的關(guān)鍵殘基，構(gòu)建突變文庫(kù)，篩選獲得對(duì)2-氯煙腈水合活性消除且水解活性顯著提高的優(yōu)勢(shì)突變體，成功用于2-氯煙酸的生物合成；利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)嵌合體腈水解酶BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(BaNITM0)進(jìn)行反應(yīng)專一性改造，在催化異丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中間體的應(yīng)用時(shí)，突變體M127I/C237S副產(chǎn)物酰胺的含量由15.8%降至2.1%，且其催化活性提升至BaNITM0的3.9倍。江南大學(xué)的Gong等[38]對(duì)真菌來(lái)源的腈水解酶進(jìn)行反應(yīng)專一性改造，得到的雙突變體I128L/N168Q催化反應(yīng)后，使酰胺的含量由2.8%降低至0.9%，且I128L/N168Q的催化活性是野生型的2倍[58]。此外，Jiang等[40]改造Syechocystissp.PCC6803 腈水解酶Nit6803，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與野生酶相比，突變體F193N、F193A、F193D和F193Q等的腈水合活性提升20倍以上；以2-氰基吡啶為底物，突變體F193N催化產(chǎn)物中酰胺的比例達(dá)73%。Kiziak等[59]對(duì)來(lái)源于P.fluorescensEBC191的腈水解酶進(jìn)行改造后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)刪除其C端后，腈水解酶的酰胺合成能力明顯提升，但立體選擇性和催化活性顯著下降。

在腈水解酶立體選擇性調(diào)控方面，國(guó)內(nèi)外團(tuán)隊(duì)也取得了極大的進(jìn)展。Lu等[58]聚焦腈水解酶獨(dú)特的C界面結(jié)構(gòu)，通過(guò)定點(diǎn)飽和突變構(gòu)建突變文庫(kù)，篩選到的V82L突變體立體過(guò)量值明顯提升，并與雙突變體M127I/C237S進(jìn)行疊加，可高效、高立體選擇性催化異丁基丁二腈；三突變體V82L/M127I/C237S對(duì)異丁基丁二腈的E值仍然大于500，催化150 g/L 異丁基丁二腈水解合成普瑞巴林手性中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸,產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值(e.e.值)大于99%。Sun等[3]篩選到對(duì)腈水解酶PpL19立體選擇性具有重要作用的4個(gè)“熱點(diǎn)”(M113、R128、A136和 I168)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生型對(duì)外消旋扁桃腈呈現(xiàn)S型選擇性，產(chǎn)物的e.e.值為52.7%；在對(duì)上述4個(gè)熱點(diǎn)進(jìn)行飽和突變后發(fā)現(xiàn)，部分突變體的S型選擇性選擇性增強(qiáng)，而部分突變體呈現(xiàn)出相反的R型選擇性，經(jīng)過(guò)合理組合后，獲得的突變體M113L/R128H對(duì)S-扁桃腈立體選擇性明顯增強(qiáng)，產(chǎn)物的e.e.值提升至91.1%；突變體 M113G/A136Y/I168Y則可催化R-扁桃腈，產(chǎn)物的e.e.值為90.9%。Yu 等[5]理性設(shè)計(jì)Synechocystissp.腈水解酶，使其立體選擇性發(fā)生反轉(zhuǎn)，并用于光學(xué)純(R)-3-異丁基-4-氰基丁酸的生物合成。Wang等[60]利用易錯(cuò)PCR改造B.cenocepaciaJ2315腈水解酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙突變體I133M/Y199G的立體選擇性明顯提升，產(chǎn)物光學(xué)純度由89.2%提升至99.1%。Chen等[61]發(fā)現(xiàn)，Bradyrhizobium japonicum腈水解酶bll6402NIT的突變體W57F/V134M、W57Y/V134M對(duì)異丁基丁二腈具有高立體選擇性，產(chǎn)物 (S)-3-氰基-5-甲基乙酸e.e.值大于99%。

除了嗜熱菌來(lái)源的少數(shù)腈水解酶外，大部分腈水解酶都需要面對(duì)穩(wěn)定性一般的困境。Xu等[62]針對(duì)腈水解酶典型的多聚體結(jié)構(gòu)，深入探究了多聚體形成過(guò)程中兩個(gè)亞基間“A”界面和多個(gè)亞基間“C”界面作用力對(duì)酶穩(wěn)定性的影響機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過(guò)加強(qiáng)界面鹽橋、氫鍵、二硫鍵以及減小亞基對(duì)稱螺旋之間的距離可顯著提升腈水解酶的穩(wěn)定性；利用穩(wěn)固腈水解酶界面的氨基酸殘基優(yōu)化策略，在前期腈水解酶BaNIT突變體基礎(chǔ)上，在30 ℃下酶的半衰期提高了10.8倍；獲得Acidovorax facilis來(lái)源腈水解酶的最佳突變體T201F/Q339K/Q343K,在45 ℃下的半衰期比野生型的提高了14倍。此外，還有一些研究對(duì)腈水解酶進(jìn)行固定化，提升腈水解酶的穩(wěn)定性和使用效率，以降低生產(chǎn)成本。Ni等[63]通過(guò)領(lǐng)苯二酚-殼聚糖包埋的方法對(duì)腈水解酶進(jìn)行固定化，所得固定化細(xì)胞可連續(xù)進(jìn)行R-(-)-扁桃酸的生產(chǎn)，反應(yīng)16個(gè)批次后酶活還保留80%。Zhang等[64]用戊二醛直接交聯(lián)腈水解酶大腸桿菌靜息細(xì)胞，在100 mmol/L 底物濃度下生產(chǎn)R-(-)-扁桃酸，反應(yīng)15 批后活性無(wú)明顯損失。Bauer 等[65]采用聚乙烯醇(PVA)包埋腈水解酶細(xì)胞制備丙酸，在細(xì)胞和PVA 用量分別為1 g/mL和200 g/L時(shí)，酶活回收率高達(dá)100%，而且在100 mmol/L 底物濃度下可在填充床上連續(xù)反應(yīng)100 min。

底物特異性的改造也是腈水解酶常見應(yīng)用需求之一。Zhang 等[66]對(duì)Syechocystissp.PCC6803 腈水解酶晶體結(jié)構(gòu)的分析后發(fā)現(xiàn)，W146位點(diǎn)對(duì)于底物偏好性和底物結(jié)合口袋的穩(wěn)定性有著重要的作用，如果將W146進(jìn)行氨基酸的替換會(huì)改變腈水解酶的底物偏好性。Woodward 等[32]對(duì)來(lái)源于Capsella rubella的2個(gè)高同源性腈水解酶(CrNIT1和CrNIT2)進(jìn)行改造后發(fā)現(xiàn)，腈水解酶C界面上的2個(gè)對(duì)稱螺旋會(huì)影響腈水解酶的底物特異性，將82位點(diǎn)由Phe突變成His(或者His突變成Phe)后，CrNIT1和CrNIT2的突變體對(duì)3-丁烯腈和6-庚腈的活性發(fā)生明顯的改變，底物特異性也發(fā)生轉(zhuǎn)變。

建立工作量合理、高效且快速的突變體篩選方法對(duì)于腈水解酶的改造是至關(guān)重要的。目前已有的腈水解酶高通量方法可大致分為pH指示劑法、NH3分析法、羧酸分析法和同位素標(biāo)記分析法等[67]。腈水解酶催化腈類化合物水解成相應(yīng)羧酸和NH3，產(chǎn)生的羧酸會(huì)使反應(yīng)環(huán)境pH下降?；诖耍珺anerjee 等[68]建立了一種快速比色法，因?yàn)橹甘緞╊伾兓c腈水解酶催化產(chǎn)酸的量成正比。NH3分析法則是對(duì)腈水解酶反應(yīng)生成的NH3濃度進(jìn)行檢測(cè)，如NH3與次氯酸鹽-苯酚在堿性條件下反應(yīng)可生成深藍(lán)色靛酚，在612 nm下可定量測(cè)定[69],但該方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且只能檢測(cè)濃度為20～200 μmol/L的NH3。Banerjee等[70]開發(fā)NH3分析法，基本原理是NH3可與巰基乙醇、鄰苯二甲醛反應(yīng)生成異吲哚衍生物，在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為412和467 nm的情況下，通過(guò)熒光強(qiáng)度的大小定量分析NH3的濃度，該方法具有反應(yīng)時(shí)間較短、靈敏度高及檢測(cè)范圍廣(2.5～1 000 μmol/L)，已被廣泛采用(圖4)。如，Lu等[58]基于此方法，向高通量篩選反應(yīng)中加入來(lái)源于Pantoeasp.YR343的酰胺酶Pa-Ami，使其可高速檢測(cè)腈水解酶的總活性和水解活性，從而間接測(cè)量腈水解酶的水合活性，篩選反應(yīng)專一性提升的腈水解酶。羧酸法分析法主要是對(duì)腈水解酶反應(yīng)生成的羧酸進(jìn)行檢測(cè)，常用的方法包括將鄰羥基苯甲腈及其衍生物作為熒光探針檢測(cè)腈水解酶活性[71]、根據(jù)羥肟酸鐵反應(yīng)檢測(cè)腈水解酶活性[72]以及紫外分光光度法檢測(cè)法[73]等。DeSantis等[56]以15N標(biāo)記的假前手性3-羥基戊二腈為底物篩選對(duì)映選擇性更好的腈水解酶，因?yàn)?5N標(biāo)記的R-3-羥基戊二腈會(huì)在R型選擇性腈水解酶的作用下生成沒有標(biāo)記的對(duì)映體單酸，而在S型選擇性腈水解酶會(huì)生成帶有15N標(biāo)記的S型對(duì)映體單酸，通過(guò)質(zhì)譜可對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。

圖4 基于NH3濃度的腈水解酶反應(yīng)專一性高通量篩選方法[58]Fig.4 High-throughput screening assay for nitrilase with improved reaction specificity[58]

4 結(jié)論與展望

歐陽(yáng)平凱院士領(lǐng)導(dǎo)的“973計(jì)劃”項(xiàng)目“生物催化和生物轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵問(wèn)題的基礎(chǔ)研究(2003CB716000)”為腈水解酶生物催化研究提供了強(qiáng)有力的平臺(tái)，經(jīng)過(guò)20多年的持續(xù)努力，我國(guó)腈水解酶生物催化研究取得系列重要進(jìn)展，形成了基礎(chǔ)研究、技術(shù)開發(fā)、工程創(chuàng)新與工業(yè)應(yīng)用緊密結(jié)合的鮮明特色，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)、產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注，引領(lǐng)了該領(lǐng)域國(guó)際發(fā)展方向。

近年來(lái)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等技術(shù)快速發(fā)展，為腈水解酶的設(shè)計(jì)和改造提供了有效手段。如何高效、快速獲得具有高催化活力、穩(wěn)定性和選擇性等性能的腈水解酶仍是其工業(yè)應(yīng)用亟待解決的關(guān)鍵共性問(wèn)題。因此，關(guān)于腈水解酶催化機(jī)制和催化性能調(diào)控的研究將仍是未來(lái)研究的主要內(nèi)容。我們要大力弘揚(yáng)歐陽(yáng)平凱院士“忠誠(chéng)精實(shí)”的科學(xué)家精神，致力創(chuàng)新，服務(wù)產(chǎn)業(yè)，為我國(guó)高水平科技自立自強(qiáng)做出新的貢獻(xiàn)。