雙孢蘑菇內(nèi)生菌分離鑒定研究

阮俊峰 李祥云 江勝滔 周銀珠

摘要 利用組織分離法、研磨法、印跡法3種分離方法對雙孢蘑菇內(nèi)生菌進(jìn)行分離，共分離出內(nèi)生細(xì)菌7株、內(nèi)生真菌1株;對分離出的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行抑菌試驗。結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌 AB-21菌株對青霉病原菌表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)而對該菌株進(jìn)行分類鑒定，形態(tài)學(xué)觀察顯示，該菌株為革蘭氏陽性菌（G+），桿狀，有芽孢;生理生化特性鑒定結(jié)果與病原庫中芽孢桿菌屬相符，同源率為95%;進(jìn)一步對該菌株進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增、測序，結(jié)果經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫比對，與庫中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度達(dá)100%。初步確定內(nèi)生細(xì)菌AB-21為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

關(guān)鍵詞 雙孢蘑菇;內(nèi)生菌;分離鑒定

中圖分類號 S-646.1+1? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）12-0043-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.013

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Agaricus bisporus

RUAN Jun feng1，2，LI Xiang yun1，JIANG Sheng tao1，2 et al （1.School of Life Sciences，Ningde Normal University，Ningde，F(xiàn)ujian 352100;2.Fujian University Engineering Research Center of Characteristic Biological Resources in Eastern Fujian，Ningde，F(xiàn)ujian 352100）

Abstract The endophytic bacteria of Agaricus bisporus were isolated by tissue separation method，grinding method and western blot method.A total of 7 strains of endophytic bacteria and 1 strain of endophytic fungus were isolated.The isolated strains were purified and tested against bacteria.The results showed that the endophytic bacteria AB 21 showed a strong inhibitory effect on the pathogenic bacteria of Penicillium.Then，the strain was classified and identified.Morphological observation showed that the strain was gram positive （G+），rod shaped，with spore.Physiological and biochemical characteristics were identified，and the results were consistent with the Bacillus genus in the pathogen database，with the homology rate of 95%.The 16S rDNA gene of the strain was amplified and sequenced.The results were compared with the database of National Center for Biotechnology Information （NCBI），and the similarity between the strain and Bacillus amyloliquefaciens in the library was 100%.The endophytic bacterium AB 21 was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens.

Key words Agaricus bisporus;Endogenous bacteria;Separation identification

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），又稱白蘑菇，歐美常稱之為普通栽培蘑菇或紐扣蘑菇。雙孢蘑菇子實體中等大，菌蓋寬5～12 cm，初半球形，后平展，白色、光滑，略干漸變黃色，邊緣初期內(nèi)卷。菌肉白色、厚，傷后略變?yōu)榈t色，具蘑菇所特有的氣味。菌褶初粉紅色，后變褐色至黑褐色，密、窄，離生，不等長。菌柄長4.5～9.0 cm，粗1.5～3.5 cm，白色，光滑，近圓柱形，內(nèi)部松軟或中實。菌環(huán)白色單層，膜質(zhì)，生菌柄中部，容易脫落，生長于公園、森林地、田野、草地、道路旁等處，分布極廣泛，我國普遍栽培。

內(nèi)生菌（Endophytic）是指在其生活史中某段時期生活在活的植物組織內(nèi)，不引起植物組織產(chǎn)生明顯病害癥狀的真菌和細(xì)菌[1-3]。內(nèi)生菌與宿主間具有重要的生態(tài)關(guān)系，目前已研究出固氮作用、促進(jìn)植物生長、能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)[4]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，將植物內(nèi)生菌無土混合制劑進(jìn)行拌種或制成菌劑而加以實踐具有重要意義。如陰溝腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌對種子發(fā)芽、宿主植物生長和防御植物抗病性等方面都表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用[5]。

研究表明，植物與細(xì)菌聯(lián)合能促進(jìn)根際部位污染物的降解[6]。研究者在土壤中發(fā)現(xiàn)可分解重金屬的細(xì)菌，后來在植物體內(nèi)分離出相應(yīng)的內(nèi)生菌株[7]。筆者利用組織分離法、研磨法、印跡法3種分離方法對雙孢蘑內(nèi)生菌進(jìn)行分離，對分離出的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行抑菌試驗。

1 材料與方法

1.1 材料 雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），采購自福建寧德市萬達(dá)超市。

1.2 試劑

NB培養(yǎng)基、 PDA培養(yǎng)基; 革蘭氏染液、孔雀綠染液;75%乙醇、3%次氯酸鈉，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

BCL細(xì)菌鑒定試劑卡、Taq 聚合酶、dNTP、DL 2000 DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、瓊脂糖。

核酸染料4S Green：50 mL 凝膠液體、5 μL Green。

細(xì)菌16S rDNA基因通用引物1492R（5′—3′）：TACGGCTACCTTGTTACGACTT和27F（5′—3′）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

1.3 儀器

VITEK2 Compact32全自動微生物分析系統(tǒng)，BSA124S離心機(jī)，BIO-RAD PCR儀，LEICA-DM750視教系統(tǒng)顯微鏡等。

1.4 方法

1.4.1 內(nèi)生菌株分離。

取新鮮洗凈的雙孢蘑菇，無菌水沖洗2次，75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗3次;3%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌水沖洗3次。

對新鮮的雙孢蘑菇進(jìn)行消毒后，分別采用組織分離法、研磨法和印跡法3種分離方法對內(nèi)生菌株進(jìn)行分離。具體步驟：①組織分離法。用無菌解剖刀去掉雙孢蘑菇子實體的表皮，將雙孢蘑菇內(nèi)部的組織切割成0.5 cm 左右的小塊，分別接于NB和PDA平板培養(yǎng)基，對照組為最末一次沖洗液，分別培養(yǎng)在37和28 ℃恒溫箱[8]。②研磨法。用無菌解剖刀去掉雙孢蘑菇子實體的表皮，將雙孢蘑菇內(nèi)部的組織切入研缽內(nèi)，加少量無菌水和無菌玻璃珠研磨，靜置2 min，吸取上清液分別于NB和PDA平板培養(yǎng)基上涂布，對照組為最末一次沖洗液，分別培養(yǎng)在37和28 ℃恒溫箱[9-10]。③印跡法。用無菌解剖刀去掉雙孢蘑菇子實體的表皮，將雙孢蘑菇內(nèi)部的組織切割成0.5 cm左右的小塊，分別接于NB和PDA平板培養(yǎng)基，用鑷子輕壓一下，再將組織塊取出，對照組為最末一次沖洗液，分別培養(yǎng)在37和28 ℃恒溫箱。

1.4.2 內(nèi)生菌的純化。

采用平板劃線法，觀察所分離菌株的菌落形態(tài)特征，挑取單菌落，若存在不同形態(tài)的單菌落，則分別挑取到平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，確保分離出純菌。將分離純化好的純菌轉(zhuǎn)接至試管培養(yǎng)，長滿后移至4 ℃醫(yī)用冷藏箱中保藏。

1.4.3 抑菌試驗。

平板點種法：菌種活化，用無菌水稀釋，按 3%的比例加入冷卻至55 ℃的培養(yǎng)基中，混勻，倒入培養(yǎng)皿中，待平板冷凝后，挑取內(nèi)生菌點在平板中央，將平板放入32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察抑菌圈情況并計算其直徑[11]。

1.4.4 內(nèi)生菌株的鑒定。

（1）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察。

菌落特征：將純化好的內(nèi)生細(xì)菌接種于NB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落的生長狀況和形態(tài)特征，挑取單個菌落鏡檢。

革蘭氏染色：用接種環(huán)挑取單菌落，在載玻片上涂成直徑約1 cm的均勻薄層，微火固定，滴加1～2滴草酸結(jié)晶紫，染色1 min，水洗。用95%乙醇脫色至不顯紫色。再滴加1～2滴蕃紅染液，復(fù)染1 min，水洗。用吸水紙吸干100倍油鏡鏡檢。用標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌作為對照。

芽孢染色：挑取培養(yǎng)24 h菌株，涂片，干燥并固定。滴加孔雀綠染色液，用試管夾夾住載玻片，于酒精燈上加熱至染料冒蒸汽時計時，染色10 min。待玻片冷卻后，用水沖洗至褪下綠色為止。然后在玻片上滴加1～2滴蕃紅染液，室溫下染色3～5 min，水洗、完全干燥，在油鏡下觀察，菌體呈紅色，芽孢呈綠色。

（2）生理生化特性測定。

采用法國-梅里埃（ BioMerieux） 公司生產(chǎn)的微量多項鑒定系統(tǒng)按說明方法對純培養(yǎng)18～24 h的新鮮菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)測定。操作步驟是挑取培養(yǎng)18 h的新鮮菌，配制細(xì)菌濁度為1.8～2.2 McF的菌懸液，將卡片按順序放到載物卡架上，輸樣管插入到菌液管中，將載卡架放入儀器的填充倉，填充完畢后轉(zhuǎn)移到裝載倉，儀器鐘自動孵育倉內(nèi)所有卡片，并將數(shù)據(jù)傳入工作電腦，電腦分析所有數(shù)據(jù)并給予結(jié)果，檢索《API鑒定對照系統(tǒng)》對鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

（3）分子生物學(xué)鑒定。

采用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，退火溫度55 ℃;1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT，退火溫度55 ℃）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首先配制25 μL反應(yīng)體系（

10×Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，上游引物（F）（10 μmol/L）1 μL，下游引物（R）（10 μmol/L）

1 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 18.2 μL，總體積25 μL），反應(yīng)體系混勻，離心。再設(shè)定PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 10 min;變性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 90 s，然后再次回到變性溫度循環(huán)30次; 保溫72 ℃ 10 min。然后待反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1 μL的6×Loading Buffer混勻上樣，以DL 2000 DNA Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過2%的瓊脂糖凝膠在150 V恒壓下電泳檢測，電泳結(jié)束后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，判定PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物電泳檢測后，觀察是否有明亮的條帶出現(xiàn)。最后將有條帶的序號所對應(yīng)的菌落參照天根公司試劑盒TIANprep? mini Plasmid Kit的說明書按步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取，取5 μL進(jìn)行瓊脂電泳150 V下跑膠，送至福州博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分離方法對雙孢蘑菇內(nèi)生菌分離效果的比較

3種分離方法對雙孢蘑菇內(nèi)生菌的數(shù)量有明顯影響，不同分離方法對雙孢蘑菇內(nèi)生菌的分離效果也不同，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，通過組織分離法從雙孢蘑菇中分離出3株內(nèi)生細(xì)菌，沒有分離到內(nèi)生真菌;通過研磨法從雙孢蘑菇中分離出3株內(nèi)生細(xì)菌、1株內(nèi)生真菌;通過印跡法從雙孢蘑菇中分離出1株內(nèi)生細(xì)菌，沒有分離到內(nèi)生真菌。

2.2 抑菌試驗結(jié)果

對所有分離到的內(nèi)生菌進(jìn)行編號：雙孢蘑菇細(xì)菌AB、雙孢蘑菇真菌AF。以大腸桿菌、青霉2種常見的病原菌作為指示菌，經(jīng)活菌抑菌試驗篩選，所分離到的雙孢蘑菇內(nèi)生菌抑菌效果見表2。

雙孢蘑菇內(nèi)生菌株AB-21對青霉表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌效果，對青霉抑菌圈均達(dá)15 mm以上，故內(nèi)生菌株AB-21具有一定的研究和應(yīng)用前景。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌 AB-21的分類鑒定

2.3.1 內(nèi)生細(xì)菌 AB-21 的微生物形態(tài)學(xué)觀察。

通過革蘭氏染色、芽孢染色和形態(tài)觀察可知，AB-21 菌株的革蘭氏染色為陽性，有芽孢。AB-21 菌株菌落顏色呈乳白色，半透明狀，光滑濕潤，桿狀，菌體很小，直或彎，呈八字排列的桿菌。

2.3.2 內(nèi)生細(xì)菌 AB-21 的生理生化特性。

將培養(yǎng)18～24 h的內(nèi)生細(xì)菌AB-21（新鮮菌）進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果出現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）3個菌，初步推測該菌屬芽孢桿菌屬。內(nèi)生細(xì)菌AB-21與芽孢桿菌屬的同源率為95.0%，需進(jìn)一步驗證該菌的菌種（表3）。

2.3.3 內(nèi)生細(xì)菌AB-21的分子生物鑒定。

采用27F和1492R特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1 500 bp，片段單一清晰，符合預(yù)期大?。▓D1）。

按照TIANprep? mini PlAsmid KiT操作說明書提取菌株質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示提取的重組質(zhì)粒完整，大小與預(yù)期相符。將提取的重組質(zhì)粒送至福州博尚生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果顯示，目的片段大小共1 423 bp，具體序列信息見圖2。

采用NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站在線工具BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nig.gov/Blast.cgi），選擇Nucleotide Blast比對模塊，輸入測序序列，比對結(jié)果顯示與庫中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度達(dá)100%（圖3）。

3 結(jié)論與討論

該研究采用組織分離法、研磨法、印跡法3種分離方法對雙孢蘑菇內(nèi)生菌進(jìn)行分離，共分離出內(nèi)生細(xì)菌7株、內(nèi)生真菌1株;對分離出的菌株進(jìn)行純化，并進(jìn)行抑菌試驗。結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌AB-21菌株對青霉病原菌表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)而對該菌株進(jìn)行分類鑒定、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明該菌株為革蘭氏陽性菌（G+），桿狀，有芽孢;生理生化特性鑒定結(jié)果與病原庫中芽孢桿菌相符，同源率為95%;進(jìn)一步對該菌株進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增、測序，結(jié)果經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫比對，與庫中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度達(dá)100%。初步確定內(nèi)生細(xì)菌AB-21為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

在對內(nèi)生細(xì)菌AB-21（新鮮菌）進(jìn)行生理生化鑒定時，結(jié)果出現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）3個菌，初步推測該菌屬芽孢桿菌屬。內(nèi)生細(xì)菌AB-21與芽孢桿菌屬的同源率為95.0%，需進(jìn)一步驗證該菌的菌種。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）3個菌同屬于芽孢桿菌屬，這3個菌種極其相似，在V2C菌庫中被歸為同一類。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是枯草芽孢

桿菌屬、枯草芽孢桿菌種、解淀粉枯草芽孢桿菌亞種。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）屬于subtilis種，是一種多功能的微生物，其在飼料中應(yīng)用較多，在污水處理及生物肥發(fā)酵或發(fā)酵床制作中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）舊稱枯草芽孢桿菌黑色變種，是芽孢桿菌屬的一個重要種。1989年，Nakamura[12]采用DNA雜交、電泳技術(shù)和色素生成方法對一些產(chǎn)色素的枯草芽孢桿菌重新鑒定分類，首次提出將產(chǎn)棕色色素的枯草芽孢桿菌黑色變種更名為萎縮芽孢桿菌。

該研究結(jié)合分離菌株的培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA基因的比對分析，初步確定內(nèi)生細(xì)菌AB-21為解淀粉芽孢桿菌，研究結(jié)果將為雙孢蘑菇內(nèi)生菌資源和其生物活性物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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