HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方甘草酸苷片中甘氨酸和蛋氨酸的含量

吳小曼,徐 滟,石蓓佳

(1.江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所,江蘇 南京 210008;2.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210046)

復(fù)方甘草酸苷片是由甘草酸苷、甘氨酸和蛋氨酸組成的復(fù)方制劑,為一安全、有效的保肝護(hù)肝制劑,具有保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。本品按進(jìn)口藥品復(fù)核標(biāo)準(zhǔn)[1]檢驗(yàn),其中苷氨酸采用薄層掃描法測(cè)定,蛋氨酸采用回滴定法測(cè)定,操作步驟較為繁瑣。有文獻(xiàn)報(bào)道采用2,4-二硝基氟苯衍生化[2-3]或氯甲酸 9-芴基甲酯衍生化[4-5]HPLC法同時(shí)測(cè)定兩者含量,但衍生化法影響因素較多。采用HPLC法直接測(cè)定本品中兩種氨基酸含量的方法尚未見(jiàn)報(bào)道,本文參照有關(guān)文獻(xiàn)[6]建立了HPLC法直接測(cè)定復(fù)方甘草酸苷片中甘氨酸和蛋氨酸的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器)。

甘氨酸對(duì)照品(批號(hào):140689-200401)、蛋氨酸對(duì)照品(批號(hào):140684-200401),中國(guó)藥品生物制品檢定所;復(fù)方甘草酸苷片,江蘇某藥業(yè)有限公司,批號(hào) :08086A、08086B、08086C;乙腈為色譜醇;水為純化水;其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent HC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈 -0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液(50%磷酸調(diào)節(jié) p H值至2.5)(5∶95)為流動(dòng)相;流速:0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):200 nm;柱溫:30℃,進(jìn)樣量:10μL。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液:精密稱取甘氨酸與蛋氨酸對(duì)照品適量,加水溶解并稀釋制成每1mL約含甘氨酸與蛋氨酸各 0.5mg的溶液,搖勻,即得。

供試品溶液:取本品 20片,精密稱定,研細(xì),精密稱取適量(約相當(dāng)于甘氨酸和蛋氨酸各 25mg),置50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。另按處方比例配制不含甘氨酸與蛋氨酸的陰性樣品,再按供試品溶液的制備方法制備得陰性對(duì)照溶液,進(jìn)樣,記錄色譜圖(圖1);另取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于甘氨酸和蛋氨酸各 25mg),置50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液進(jìn)樣,利用DAD檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰純度檢查,記錄色譜圖,甘氨酸峰的純度因子為997.349,蛋氨酸峰的純度因子為997.788。結(jié)果均表明,處方中的輔料及甘草酸苷對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 對(duì)照品(A)、供試品的(B)及陰性對(duì)照(C)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A),sample(B)and blank sample(C)

2.4 線性關(guān)系

取甘氨酸與蛋氨酸對(duì)照品各約40mg,精密稱定,置20mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密量取0.5,1.0,2.0,4.0,5.0mL,分別置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取10μL,分別注入色譜儀,記錄色譜圖,以峰面積(A)對(duì)濃度(C)作線性回歸,得回歸方程為:甘氨酸 A=667.21 C-6.072 9,r=1.000 0;蛋氨酸 A=9 255.1 C+122.9,r=0.999 9。

結(jié)果表明,在0.10～1.0mg/mL范圍內(nèi),甘氨酸與蛋氨酸溶液濃度均與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 回收率試驗(yàn)

取已知含量的本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于甘氨酸和蛋氨酸各 12.5mg),分別置9個(gè) 50mL量瓶中,再分別精密稱取甘氨酸與蛋氨酸對(duì)照品各 10,12.5和15mg,各 3份,置上述量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,取續(xù)濾液作為供試品溶液,測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。甘氨酸和蛋氨酸的平均回收率分別為100.29%和99.58%,RSD(n=9)分別為0.97%和0.75%。

2.6 溶液的穩(wěn)定性

取供試品溶液自配制后分別在0,2,4,6,8 h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,甘氨酸與蛋氨酸的RSD分為0.54%與0.34%,表明該溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

表1 甘氨酸與蛋氨酸的加樣回收率試驗(yàn)(n=9)Tab.1 Recovery rate of glycine and methionine(n=9)

取同一批樣品(080806A),同法配制 6份供試品溶液,分別測(cè)定含量。甘氨酸和蛋氨酸的平均含量分別為100.4%和100.0%,RSD分別為0.53%和0.76%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 含量測(cè)定

本品 3批,分別按 2.2項(xiàng)下的方法制備對(duì)照品溶液及供試品溶液,按 2.1項(xiàng)下的色譜條件,進(jìn)樣10μL,記錄色譜圖,按外標(biāo)法分別以峰面積計(jì)算含量,同時(shí)與文獻(xiàn)方法[1]測(cè)定結(jié)果比較,見(jiàn)表2,甘氨酸的測(cè)定結(jié)果有較大差異,這可能與薄層掃描法精密度與準(zhǔn)確度都不高有關(guān),兩種方法蛋氨酸的測(cè)定結(jié)果基本一致。

表2 不同方法測(cè)定甘氨酸與蛋氨酸含量的比較Tab.2 Determination results of glycine and methionine by different methods

3 討 論

流動(dòng)相的pH對(duì)分離度、峰形及保留時(shí)間有影響,pH為4.5時(shí)甘氨酸與相鄰峰分離不好,蛋氨酸峰變形;pH為3.5時(shí)甘氨酸與相鄰峰分離度好,但蛋氨酸峰分叉;pH為2.5時(shí)甘氨酸與蛋氨酸峰形均很好,理論板數(shù)均在10 000以上,甘氨酸與相鄰峰的分離度大于2.0。流動(dòng)相的pH對(duì)甘氨酸的保留時(shí)間基本無(wú)影響,隨著 pH值減小,蛋氨酸的保留時(shí)間延長(zhǎng)。

我們對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇。甘氨酸和蛋氨酸均在200～220 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收,屬末端吸收,且吸光度隨波長(zhǎng)增大而減小;同時(shí)在200,203,205 nm進(jìn)行檢測(cè),基線噪音基本相同,甘氨酸響應(yīng)值減少明顯,故選擇 200 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

分別采用水和流動(dòng)相為溶劑,色譜行為基本相同,故選用前者。由于檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm,對(duì)照品與供試品圖譜中,甘氨酸峰后有一小峰。分別配制甘氨酸與蛋氨酸的對(duì)照品溶液,相應(yīng)圖譜中均有此峰;采用流動(dòng)相配制,此峰亦存在;可能為水中少量的氯離子峰,向水中加入少量的鹽酸溶液,進(jìn)樣,氯離子峰與上述小峰不完全對(duì)應(yīng);由于此小峰與甘氨酸分離度大于2.0,故不影響含量測(cè)定。另外,本品處方中還有甘草酸苷,由于本色譜系統(tǒng)中流動(dòng)相洗脫能力較弱,甘草酸苷不出峰,故對(duì)本法無(wú)干擾。

本法與薄層掃描法、衍生化HPLC法比較,具有簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

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