PPARγ激動劑 15d-PGJ2對甲狀腺刺激抗體作用下人甲狀腺細(xì)胞存活和凋亡的影響

王麗莉,李健榕,黃國良

(福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科,福建 福州 350001)

過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPARγ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,其被激活后通過激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄參與體內(nèi)的多種生理和病理過程,包括細(xì)胞的分化、凋亡、癌癥等[1-2]。Au等[3]發(fā)現(xiàn)PPARγ在正常及不同病理類型的甲狀腺組織中有不同程度的表達(dá),在Graves病(GD,毒性彌漫性甲狀腺腫)患者甲狀腺組織中 PPARγ基因及其蛋白表達(dá)顯著降低。而GD甲狀腺細(xì)胞大量增殖、凋亡受抑制,表現(xiàn)為甲狀腺腫大,其是否與PPARγ低表達(dá)有關(guān),尚未見報道。甲狀腺刺激抗體(TSAb)是GD主要的致病因子,本研究應(yīng)用TSAb刺激體外培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞,探討 PPARγ激動劑 15d-PGJ2對TSAb作用下人甲狀腺細(xì)胞存活和凋亡的影響。

1 對象與方法

1.1 對象

從手術(shù)治療的甲狀腺腺瘤患者的手術(shù)切除組織中,取遠(yuǎn)離腺瘤的正常甲狀腺組織用于細(xì)胞培養(yǎng),所有病例均經(jīng)病理證實。選擇 TSH受體抗體 (TRAb)、TSAb陽性的初發(fā)未治 GD患者 40例,男女各 20例,TSAb活性為(6.12±4.8)(TSAb組),并同時收集 40例性別、年齡與GD組相匹配的本院健康工作人員的血清為對照,其血清 TSAb、TRAb均為陰性(TSAb陰性組),活性為(0.97±0.32),FT3、FT4、sTSH、TPOAb均為正常,且無自身免疫性病等疾病。

PPARγ激動劑 15d-PGJ2、PPARγ拮抗劑GW9662,Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組甲狀腺組織充分剪碎、沖洗后,以Ⅱ型膠原酶和分散酶消化,細(xì)胞懸浮于10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,接種于6孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時消化,分為4組:(1)對照組:無血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)TSAb陰性組:2mg/mL正常人血清粗提 IgG培養(yǎng);(3)TSAb組:2mg/mL TSAb陽性血清粗提 IgG培養(yǎng)。3組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的15d-PGJ2(0,5,10,20,40μmol/L);(4)GW9662組:在TSAb陽性組基礎(chǔ)上加入10μmol/L GW9662,培養(yǎng)3 h后加入20μmol/L 15d-PGJ2,作用24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 TSAb提取、鑒定及活性測定TSAb活性測定采用生物學(xué)法[4],提取、鑒定參考 Kasaki法[5],即TSAb陽性組和TSAb陰性組血清用20%聚乙二醇粗提,醋酸纖維薄膜電泳鑒定所提取的成分主要是γ球蛋白,并再次進(jìn)行 TSAb活性測定,表明所提取的IgG具有高度生物活性,用于實驗。并以同樣方法提取混合后正常人血清 IgG。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞存活率 在96孔培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL,接種密度為2×104/L,不同濃度 15d-PGJ2(0,5,10,20,40μmol/L)作用6,12,24 h后,每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL,37℃孵育 4 h后吸棄上清,每孔加入DMSO(二甲亞砜)150μL終止培養(yǎng),振蕩混勻 10 min,測定在490 nm波長的吸光度(A)值,計算細(xì)胞存活率(R)。R=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%。實驗重復(fù) 3次 。

1.2.4 Hoechst-PI染色熒光鏡觀測 正常細(xì)胞核Hoechst染色呈淡藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被 Hoechst染成濃集的亮藍(lán)色或核呈分葉、碎片狀,邊集,壞死細(xì)胞被碘化丙啶(PI)染成紅色。按 1.2.1項下分組,作用24 h后分別加入Hoechst及PI,置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 按 1.2.1項下分組,作用24 h后,消化收集細(xì)胞,冷 PBS洗滌兩次,行 Annexin-V-FITC、PI染色后上機(jī)檢測,結(jié)果以百分比表示,實驗重復(fù) 3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 15d-PGJ2對甲狀腺細(xì)胞存活的影響

2.1.1 15d-PGJ2作用的量效關(guān)系 15d-PGJ2(0～40μmol/L)作用于甲狀腺細(xì)胞24 h,其作用的量效關(guān)系見表1,在TSAb組可見,5μmol/L 15d-PGJ2即可引起細(xì)胞存活減少,10μmol/L組細(xì)胞存活進(jìn)一步減少,20μmol/L組細(xì)胞存活更少,40μmol/L組細(xì)胞存活沒有繼續(xù)減少,說明 15d-PGJ2在20μmol/L時作用基本達(dá)最大。在TSAb陰性組和對照組,可見隨 15d-PGJ2劑量增大,細(xì)胞存活亦有減少,但在較之 TSAb組細(xì)胞存活減少并不顯著(P＜0.05)。

表1 15d-PGJ2作用24 h后甲狀腺細(xì)胞存活率(n=3,±s)Tab.1 Cell viability rate of thyrocytes after exposure of 15d-PGJ2 for 24h(n=3,±s)

表1 15d-PGJ2作用24 h后甲狀腺細(xì)胞存活率(n=3,±s)Tab.1 Cell viability rate of thyrocytes after exposure of 15d-PGJ2 for 24h(n=3,±s)

與0μmol/L比較:1P＜0.05;與對照組相比:2P＜0.05Compared with 0μmol/L:1P＜0.05;Compared with control group:2P＜0.05

組別存活率/%0μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 40μmol/L對照組TSAb組TSAb陰性組100 100 100 92.62±2.581 67.97±6.451,2 91.00±1.181 84.37±3.361 56.58±5.41,2 82.20±4.191 73.92±3.461 41.46±2.61,2 72.10±3.541 63.83±3.341 38.84±1.461,2 61.40±3.141

2.1.2 15d-PGJ2作用的時效關(guān)系 20μmol/L 15d-PGJ2作用于甲狀腺細(xì)胞0～48 h,其作用的時效關(guān)系見表2,在TSAb組可見 15d-PGJ2作用12 h即可引起細(xì)胞存活減少,24 h組細(xì)胞存活進(jìn)一步減少,48 h組細(xì)胞存活沒有繼續(xù)減少,說明 20μmol/L 15d-PGJ2作用24 h基本達(dá)最大。在TSAb陰性組和對照組,可見隨作用時間延長,細(xì)胞存活亦有減少,但較之 TSAb組細(xì)胞存活減少并不顯著。

表2 20μmol/L 15d-PGJ2作用后甲狀腺細(xì)胞生存率(n=3,±s)Tab.2 Cell viability rate of thyrocytes after exposure of 20μmol/L 15d-PGJ2(n=3,±s)

表2 20μmol/L 15d-PGJ2作用后甲狀腺細(xì)胞生存率(n=3,±s)Tab.2 Cell viability rate of thyrocytes after exposure of 20μmol/L 15d-PGJ2(n=3,±s)

與0 h比較:1 P＜0.05;與對照組比較:2P＜0.05Compared with 0 h:1P＜0.05;Compared with control group:2P＜0.05

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2.2 15d-PGJ2對甲狀腺細(xì)胞的凋亡效應(yīng)

Hoechst-PI染色結(jié)果典型照片見圖1。TSAb組,5μmol/L 15d-PGJ2即可引起細(xì)胞凋亡;10,20 μmol/L組細(xì)胞凋亡更明顯;40μmol/L組顯示細(xì)胞壞死增多。另外,在20μmol/L 15d-PGJ2組加入拮抗劑 GW9662后細(xì)胞凋亡明顯減少。TSAb陰性組和對照組,10μmol/L 15d-PGJ2可引起細(xì)胞凋亡,隨15d-PGJ2作用濃度增大,細(xì)胞凋亡亦有增加,但較之 TSAb組細(xì)胞凋亡并不顯著。

15d-PGJ2作用于甲狀腺細(xì)胞24 h后,Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀定量定性分析(圖2,表3),證實以上結(jié)果。TSAb組,隨 15d-PGJ2劑量增大,細(xì)胞凋亡亦增多,在20μmol/L 15d-PGJ2組凋亡率達(dá) 53.96%,加入拮抗劑 GW9662后細(xì)胞凋亡率下降了65.62%,較未加拮抗劑時有顯著差異(P＜0.05);TSAb陰性組和對照組,10μmol/L 15d-PGJ2可引起細(xì)胞凋亡,隨 15d-PGJ2濃度增大,細(xì)胞凋亡亦有增加,但在同一濃度下較之 TSAb組細(xì)胞凋亡并不顯著(P＜0.05)。表明 15d-PGJ2可引起 TSAb作用下甲狀腺細(xì)胞凋亡,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系;這一效應(yīng)可能主要通過 PPARγ途徑起作用。

3 討 論

PPARγ是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,屬于核激素受體超家族的成員。其被活化后可以通過激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞分化、凋亡、增殖等多種生理、病理過程[1-2]。GD的發(fā)生與甲狀腺細(xì)胞大量增殖和凋亡受抑制等密切相關(guān),增殖與凋亡在正常情況下二者維持動態(tài)平衡,但當(dāng)這種平衡失調(diào)時 GD就可能發(fā)生。其發(fā)生是否與PPARγ低表達(dá)導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞凋亡減少和增殖增多有關(guān),目前尚不清楚。

圖1 15d-PGJ2作用甲狀腺細(xì)胞24 h后Hoechst-PI染色(×200)Fig.1 Hoechst-PI staining of thyrocytes after exposure of 15d-PGJ2 for 24 h(×200)

圖2 15d-PGJ2對甲狀腺細(xì)胞作用24h后流式細(xì)胞儀檢測Fig.2 FACSof thyrocytes after exposure of 15d-PGJ2 for 24 h

表3 15d-PGJ2作用24 h后流式細(xì)胞儀檢測甲狀腺細(xì)胞凋亡率(n=3,±s)Tab.3 Apoptosis of thyrocytes after exposure of 15d-PGJ2 for 24h in FACS(n=3,±s)

表3 15d-PGJ2作用24 h后流式細(xì)胞儀檢測甲狀腺細(xì)胞凋亡率(n=3,±s)Tab.3 Apoptosis of thyrocytes after exposure of 15d-PGJ2 for 24h in FACS(n=3,±s)

與0μmol/L比較:1 P＜0.05;與對照組比較:2 P＜0.05Compared with 0μmol/L:1P＜0.05;Compared with control group:2 P＜0.05

組別凋亡率/%0μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 40μmol/L+10μmol/L GW9662對照組TSAb組TSAb陰性組10.81±0.04 10.66±0.03 10.86±0.06 10.85±0.01 23.70±0.031,2 10.87±0.01 15.71±0.061 41.31±0.051,2 15.96±0.041 20.15±0.011 53.96±0.061,2 20.18±0.011 27.18±0.011 61.78±0.011,2 27.45±0.101 18.55±0.011

15d-PGJ2是前列腺素D2的代謝產(chǎn)物,是PPARγ的天然強(qiáng)激動劑。本研究顯示,15d-PGJ2可以抑制TSAb作用下的甲狀腺細(xì)胞存活,并且呈時間和劑量依賴關(guān)系,提示 PPARγ可能對TSAb作用下的甲狀腺細(xì)胞生長、分化和凋亡具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn) PPARγ激動劑噻唑烷二酮類在一些PPARγ低表達(dá)或異常表達(dá)的甲狀腺腫瘤細(xì)胞中,能夠抑制腫瘤生長,給 PPARγ陰性的甲狀腺腫瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)染正常的PPARγ基因后,亦可顯著抑制該細(xì)胞的生長[6]。另外,在活體試驗中,Ying等[7]報道促甲狀腺素受體突變小鼠的甲狀腺很快經(jīng)歷過度增生、囊性增生、失分化等一系列的病理過程而發(fā)展為乳頭狀癌,這其中的機(jī)制可能是通過對PPARγ表達(dá)的抑制而起作用。

本研究亦顯示,15d-PGJ2可誘導(dǎo) TSAb作用下的甲狀腺細(xì)胞凋亡,這可能是其抑制甲狀腺細(xì)胞存活的機(jī)制之一。目前 PPARγ激動劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生及調(diào)控的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。本實驗中加入足量 PPARγ拮抗劑 GW9662后,能在很大程度上拮抗 15d-PGJ2對細(xì)胞的促凋亡作用,但這種阻滯作用并不完全,提示 15d-PGJ2對TSAb作用下甲狀腺細(xì)胞的促凋亡作用可能主要通過 PPARγ途徑發(fā)揮,但同時也存在非 PPARγ依賴途徑。Nagamine等[8]發(fā)現(xiàn) PPARγ拮抗劑 BADGE可以顯著降低PPARγ激動劑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株 MKN-28、MKN-45和MKN-74的凋亡作用。而Sasaki等[9]亦證實 NF-κB等核激素受體及轉(zhuǎn)錄共激活因子可參與非 PPARγ依賴途徑作用。另外,在對膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn),PPARγ激動劑可上調(diào)促凋亡蛋白BAX和BAD的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生[10]。本實驗在對照組和TSAb陰性組中,15d-PGJ2對甲狀腺細(xì)胞抑制存活和促進(jìn)凋亡作用并不明顯,其機(jī)理目前尚不清楚,可能與15d-PGJ2對PPARγ正常表達(dá)的甲狀腺細(xì)胞作用不明顯有關(guān)。

本研究顯示 PPARγ激動劑 15d-PGJ2在一定濃度和作用時間下能夠引起 TSAb作用下甲狀腺細(xì)胞凋亡,這一效應(yīng)可能主要通過 PPARγ途徑起作用。推測 TSAb可能是通過抑制PPARγ表達(dá)而使 GD患者甲狀腺細(xì)胞大量增殖、凋亡受抑制。PPARγ及其相關(guān)配體與GD關(guān)系密切但其機(jī)制還未完全闡明,并且PPARγ作用范圍廣泛,作用機(jī)制復(fù)雜,影響PPARγ發(fā)揮作用的因素多,另外,受 PPARγ調(diào)控的靶基因多且復(fù)雜,相互之間亦存在交互作用,因此尚需進(jìn)一步研究。但隨著對GD細(xì)胞凋亡與PPARγ關(guān)系的進(jìn)一步闡明以及細(xì)胞凋亡機(jī)制研究的不斷深入,PPARγ可能會成為GD藥物治療的新靶點,PPARγ及其激動劑在GD的實驗和治療中將發(fā)揮重要作用。

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