新型八核銅配合物乳劑對小鼠H22腹水瘤的抑制作用

葛蓓蕾,陳小讓,徐 霞,張麗蓉

(鄭州大學 1.基礎醫(yī)學院,2.實驗動物中心,3.藥學院,河南 鄭州 450052)

惡性腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病之一。隨著對腫瘤形成機制研究的深入,化療在腫瘤的治療中日益重要。由于傳統(tǒng)的抗腫瘤藥價格昂貴,且對機體均有明顯的毒副作用,因此,研究開發(fā)廉價、低毒的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為了當前所面臨的迫切問題[1]。本實驗所用新型八核銅配合物乳劑(Nanoporous Octanuclear Cu(Ⅱ),N-Cu)是由本?；瘜W系無機教研室合成的新型銅配合物的納米材料,具有特殊的雙螺旋結(jié)構(gòu)[2]。它是以抗高血壓藥替米沙坦為配體,和8個銅整合在一起的相對分子質(zhì)量為8 723的大分子化合物。

在進行了急性毒性研究的基礎上,本文用H22模型小鼠對N-Cu的體內(nèi)抗腫瘤作用進行了研究,目的在于探討將其開發(fā)成為廉價、低毒的抗腫瘤藥物的可能性。

1 材 料

SPF級昆明種小鼠 90只,體重(20.0±2.0)g,雌性,河南省實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)合格證號:SCXK(豫)2005-0001。普通環(huán)境條件下進行該試驗,溫度 20～22℃,相對濕度 45%～50%,自由采食和飲水。

順鉑注射液(2mL∶10mg),江蘇豪森藥業(yè)有限公司,批號:20081208;N-Cu,本校無機教研室合成。

CJ-2F型醫(yī)用潔凈工作臺,蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司;BH-2型倒置顯微鏡,日本 Olympus公司。

小鼠 H22腹水瘤,引自中國科學院上海細胞生物研究所,在鄭州大學藥學院傳代保存。

2 方 法

2.1 建立穩(wěn)定的H22小鼠腹水瘤模型

按常規(guī)方法,選擇接種 H22后5～7d的健康小鼠,無菌條件下抽吸腹水,用生理鹽水1∶1稀釋后,顯微鏡下計活細胞數(shù),調(diào)整其濃度至1×107個/mL[3],消毒小鼠的腹部皮膚,用無菌注射器將 H22腹水瘤細胞懸液0.5mL,注入小鼠腹腔。以后每5～7d小鼠體內(nèi)傳代 1次,形成穩(wěn)定的傳代體系。大約傳 3～5代即可進行試驗。

2.2 接種

記錄每只實驗小鼠的體重后,用75%乙醇和碘酒腹部消毒,每只小鼠腹腔注入H22腹水瘤細胞懸液(含腹水瘤細胞5×106個)0.5mL。

2.3 分組及給藥

接種次日,隨機將小鼠分成生理鹽水陰性對照組、空白乳劑對照組、順鉑陽性對照組(1.0mg/kg)、低劑量 N-Cu組(0.2mg/mL)、中劑量 N-Cu組(0.4mg/mL)和高劑量 N-Cu組(0.8mg/mL)。每組15只動物。接種 24 h后開始給藥。尾靜脈注射0.2mL/10 g給藥治療,1次 /d,連續(xù) 7d。

2.4 檢測指標

稱重荷瘤小鼠在第1,3,5,7天的體重及第1,4,7天的平均采食量,測量荷瘤小鼠在第1,4,7天的腹圍。第7天給藥后24 h,每組處死 5只小鼠,抽取全部腹水,測量腹水體積。取心、肝、脾、肺、腎,肉眼觀察并做病理切片。剩余小鼠觀察生存時間,并計算生命延長率。

2.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)以(±s)表示。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況觀察

6組小鼠在給藥期間及觀察期內(nèi)未見毛色發(fā)暗、脫毛等;未見驚厥,抽搐。呼吸平穩(wěn),無異常鼻腔分泌物。便質(zhì)中,量中,無嘔吐。尿色、尿量正常[4]。給藥 48 h后,N-Cu高、中劑量組出現(xiàn)自主活動減少、靜臥不動,被毛紊亂。順鉑組給藥后出現(xiàn)興奮,消瘦等癥狀。順鉑組第4天死亡 1只,第6天死亡 2只,N-Cu中、低劑量組第6天各死亡 1只,第8天每組處死 5只動物并解剖,肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器,N-Cu高、中劑量組發(fā)現(xiàn)有腫脹等異常改變,與空白對照組比較差異顯著。

3.2 N-Cu對荷瘤小鼠體重的影響

結(jié)果見表1。第4天開始生理鹽水組小鼠出現(xiàn)食欲不振的現(xiàn)象,體重下降明顯;N-Cu高、中、劑量組小鼠飲食正常,體重變化平緩;順鉑組小鼠體重下降較為明顯。從體重來看,N-Cu各劑量組對小鼠的生長均無明顯的抑制作用。

3.3 N-Cu對荷瘤小鼠腹圍及腹水量的影響

結(jié)果見表2。給藥后第4天,生理鹽水對照組、空白乳劑對照組、順鉑組與N-Cu高、中、低劑量組相比出現(xiàn)腹圍增加;給藥后第7天,生理鹽水對照組、空白乳劑對照組與N-Cu高、中、低組相比,腹圍明顯增加,且小鼠出現(xiàn)反應遲鈍,行動遲緩。順鉑組與N-Cu高、中、低組比較腹圍沒有明顯差異,但小鼠被毛紊亂,精神狀態(tài)相比較差。停藥次日立即解剖收集腹水定量。N-Cu中、低劑量組與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義,N-Cu高劑量組與其它 3組比較均有明顯差異(P＜0.05)。

3.4 N-Cu對荷瘤小鼠平均采食量的影響

分別測定6組動物的平均采食量,稱重各組給藥后第1,4,7天的飼料量。結(jié)果見表3。

3.5 N-Cu對荷瘤小鼠生存期的影響

停藥次日即第8天將每組的15只小鼠隨機取出 9只正常飼養(yǎng)觀察并記錄小鼠的死亡時間,計算存活天數(shù)(存活超過 30 d的按 30 d計算)及生命延長率。生命延續(xù)率試驗重復 3份。

表1 N-Cu對荷瘤小鼠體重的影響(n=15,±s)Tab.1 N-Cu of the body weight of tumor-bearing mice(n=15,±s)

表1 N-Cu對荷瘤小鼠體重的影響(n=15,±s)Tab.1 N-Cu of the body weight of tumor-bearing mice(n=15,±s)

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表2 N-Cu對荷瘤小鼠腹圍和腹水量的影響(n=15, ±s)Tab.2 N-Cu of the abdomen and the amount of ascites of tumor-bearingmice(n=15, ±s)

表2 N-Cu對荷瘤小鼠腹圍和腹水量的影響(n=15, ±s)Tab.2 N-Cu of the abdomen and the amount of ascites of tumor-bearingmice(n=15, ±s)

與生理鹽水組比較:1P＜0.05Compared with the saline group:1P＜0.05

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表3 N-Cu對荷瘤小鼠平均采食量的影響(n=15)Tab.3 N-Cu of the average intake of tumor-bearing mice(n=15)

生命延長率(%)=(治療組的平均存活天數(shù)/對照組的平均存活天數(shù) -1)×100%。

結(jié)果見表4。各用藥組較對照組生存時間明顯延長(P＜0.05),生命延長率在12%～62%之間。對照組接種后第11天開始出現(xiàn)死亡,至20 d時,對照組全部死亡,低劑量組有 0只生存(12.1%),中劑量有 2只生存(36.3%),高劑量組有 2只生存(61.5%)。

3.6 病理組織學觀察

停藥次日即第8天將每組小鼠隨機取出 5只,解剖取出小鼠的心、肝、脾、肺、腎,稱重,HE染色。用中性福爾馬林液固定,乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋、切片,顯微鏡下觀察組織切片。心、脾、肺、腎未見明顯病理變化。肝臟病理切片結(jié)果見圖1。

表4 N-Cu對荷瘤小鼠生命延長率的影響(n=9,±s)Tab.4 N-Cu of the life span of tumor-bearingmice(n=9,±s)

表4 N-Cu對荷瘤小鼠生命延長率的影響(n=9,±s)Tab.4 N-Cu of the life span of tumor-bearingmice(n=9,±s)

與生理鹽水組相比:1P＜0.05Compared with the saline group:1 P＜0.05

組別 平均存活時間/d 生命延長率/%生理鹽水組 15.2±4.4 -乳劑對照組 15.6±4.0 -低劑量組 17.0±3.01 12.1中劑量組 20.7±4.71 36.3高劑量組 24.5±4.41 61.5

圖1 H22小鼠的肝病理切片(×400)Fig.1 Slice of liver in H22 mice(×400)

生理鹽水對照組肝組織切片中可見結(jié)節(jié)性病變的部位,其肝細胞疏松,腫脹,肝竇擴張,見癌細胞浸潤,癌細胞異型性明顯,細胞核大深染,核仁明顯。用藥后,高、中劑量組可見肝細胞腫脹,核仁明顯,染色質(zhì)豐富,未見明顯異型細胞。

4 討 論

在對腹水瘤 H22小鼠體重的影響上,各劑量組與溶劑對照組相比小鼠體重變化無明顯差異;與生理鹽水組相比,順鉑對照組小鼠體重下降明顯?？梢?N-Cu各劑量組對小鼠的生長無明顯的抑制作用,也不因劑量的增加出現(xiàn)體重抑制現(xiàn)象。

在對腹水瘤 H22小鼠腹圍的影響上,第4天開始生理鹽水對照組、空白乳劑對照組、順鉑組與NCu高、中、低劑量組相比出現(xiàn)腹圍增加;第7天生理鹽水對照組、空白乳劑對照組與N-Cu高、中、低組相比,腹圍明顯增加,且小鼠出現(xiàn)反應遲鈍,行動遲緩。順鉑組與N-Cu高、中、低劑量組比較腹圍沒有明顯差異,但小鼠被毛紊亂,精神狀態(tài)相比較差。

由腹水體積得知,高、中、低劑量組腹水體積與生理鹽水組相比都具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),說明該 N-Cu對腹水的生成具有抑制作用。

從生命延長率來看,30 d后對照組全部死亡,高、中、低劑量組生命延長率分別為61.5%,36.3%,12.1%。各用藥組與生理鹽水組相比生命延長率均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。高劑量的N-Cu能明顯延長生存時間,但生命延長率較順鉑略小。

病理組織切片形態(tài)觀察比較可見,用藥后,高、中劑量組可見肝細胞腫脹,核仁明顯,染色質(zhì)豐富,未見明顯異型細胞。

本實驗結(jié)果表明,N-Cu具有抗腫瘤作用,明顯改善肝臟環(huán)境,生命延長率有明顯的延長,但高劑量對肝臟和心臟有較明顯的抑制作用,低劑量的N-Cu也具有明顯的毒性作用。綜上可知,該新型八核銅配合物乳劑具有抗腫瘤活性,但有一定的毒性。目前我們正做進一步研究,以增強 N-Cu作用的靶向性,減小其對肝臟和心臟的毒副作用。該藥物仍處于前期的研究階段,有必要擴大樣本數(shù)及增加荷瘤鼠的種類進一步研究其抑瘤作用。此外,關于N-Cu毒副作用及抗腫瘤作用機制仍有待進一步研究。

[1]張壽春.新型含鉑、銅絡合物抗腫瘤活性與DNA切割活性研究[D].南京:南京大學博士學位論文,2004.

[2]齊曉宇.新型金屬銅絡合物的抗腫瘤作用及機制研究[D].鄭州:鄭州大學碩士學位論文,2009.

[3]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1761-1762.

[4]王國平,雷群芳.雙核銅(Ⅱ)-氟喹諾酮-鄰菲咯啉混配絡合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性[J].無機化學學報,2003,19(9):1001-1004.