TLR4基因多態(tài)性與T2DM病人并發(fā)缺血性心腦血管病的關(guān)系探討

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.14.019

The Relationship between TLR4 Gene Polymorphismand lschemic Cardiovascular Diseases in Patients withT2DM

CorrespondingAuthorWU ，E-mail：lvhnh3@163.com

Keywordstype2diabetes melius;ischemiccardiovasculardisease;Tol-like receptor 4; gene polymorphism

2型糖尿?。╰ype2diabetesmellitus，T2DM）是以高血糖為特征的代謝性疾病，其發(fā)病率、病死率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，預(yù)計到2030年將達到5.4億人[1]。缺血性心腦血管?。╥schemiccardiovasculardisease，ICVD）是T2DM病人常見的并發(fā)癥，是由于動脈粥樣硬化、血栓形成或動脈痙攣等原因?qū)е滦呐K或腦部供血不足，是T2DM病人死亡的主要原因之一[2]。有研究顯示，T2DM病人患ICVD的風險是非T2DM病人的2～4 倍，且受個體遺傳易感性的影響[3]。Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）位于人類第9號染色體上，其編碼區(qū)存在多種多態(tài)性位點，已有研究表明，TLR4基因多態(tài)性與T2DM及微血管并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)[4]。有學(xué)者認為TLR4信號通路與缺血性腦卒中、心力衰竭及冠狀動脈性疾病等ICVD的發(fā)生、器官損傷及預(yù)后相關(guān)[57]。目前，關(guān)于TLR4基因多態(tài)性是否與T2DM并發(fā)ICVD關(guān)系的研究較少。本研究旨在探討TLR4基因多態(tài)性與T2DM病人并發(fā)ICVD的關(guān)系，以期為預(yù)防和治療T2DM病人ICVD提供新的思路和靶點?，F(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1 研究對象

樣本量估算：經(jīng)預(yù)試驗，100例T2DM病人ICVD發(fā)生率為 23.00%（23/100） ，預(yù)估年齡、高血壓、T2DM病程、高密度脂蛋白膽固醇（high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C）、TLR4基因rs11536889位點GG基因型共5個影響因素，由于發(fā)生ICVD例數(shù) ≥10 倍影響因素個數(shù)，因此T2DM病人并發(fā)ICVD樣本量 ?50 例，按照失訪率 10% ，總樣本量 =243 例。選取2019年6月—2022年6月于我院就診的T2DM病人243例，其中男142例，女101例；年齡 48～78（60.35±9.18） 歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過（編號：201908），所有病人或家屬均簽署研究知情同意書。

1.2納入、排除及脫落標準

納入標準：符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》8中T2DM診斷標準，空腹血糖（fasting blood glucose，P -BG）=6.1mmon ，或餐后2h血糖（postprandialtwo-hourblood glucose，2hPBG） ? 11.1mmol/L;年齡 gt;18 歲；病人溝通、理解能力正常。

排除標準：1型糖尿病、妊娠糖尿病、胰腺炎或胰腺切除術(shù)后引起的糖尿??；出血性心腦血管病史，包括出血性心肌梗死、出血性腦卒中或蛛網(wǎng)膜下腔出血等；合并嚴重肝、腎、呼吸、消化或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。缓喜⑾忍煨孕呐K病、風濕性心臟病、主動脈夾層、心包積液、心力衰竭、重度高血壓及重度貧血等其他影響心腦血管系統(tǒng)的嚴重疾??；合并免疫系統(tǒng)異常或使用免疫抑制劑的病人；孕婦或哺乳期婦女。

脫落標準：隨訪期間失聯(lián)；研究期間主動退出；研究期間非ICVD因素死亡。

1.3方法

1.3.1 收集病人一般資料

通過查詢病歷、詢問病人及家屬等方式收集，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒、合并癥（高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、慢性腎病、肝功能異常、甲狀腺功能異常）、T2DM病程、收縮壓、舒張壓、心率、FPG、2hPBG、糖化血紅蛋白（glycatedhemoglobin，HbA1c）、總膽固醇（triglycerides，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）、HDL-C、血尿酸（blooduricacid，BUA）、血尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartatetransaminase，AST）、肌酸激酶同工酶（creatinekinaseisoenzyme，CK-MB）、血小板計數(shù)（platelet，PLT）、C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、白細胞計數(shù)（whitebloodcell，WBC）、清蛋白（albumin，AIb）、血鈉、血鈣、血磷、血糖控制方式（口服藥物、注射胰島素）。

1.3.2 TLR4基因多態(tài)性檢測

采用酚-氯仿法提取血液中脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）。病人人組后采集空腹肘靜脈血 5mL ，加入紅細胞裂解液，去除紅細胞，以3500r/min離心 20min 后（離心半徑 10cm 棄去上清，留下白細胞沉淀；在白細胞沉淀中加入細胞裂解液和 25μL 蛋白酶K，混勻， 55^°C 水浴或溫育 20min ，使DNA從核蛋白中釋放出來；將消化好的液體加入等體積的飽和酚或酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻、離心后取上層水相，重復(fù)此步驟直到水相清澈無蛋白污染；在水相中加入雙倍體積的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇，在低溫或室溫下沉淀DNA，3500r/min離心 20min 后（離心半徑 10cm ）棄上清，留下白色DNA沉淀；將DNA沉淀用 70% 乙醇洗滌，去除鹽類和有機溶劑殘留，晾干后用蒸餾水溶解，洗滌和干燥沉淀，得到純化后的DNA，保存于一 20°C 備用。經(jīng)AgilentCary60紫外分光光度計（美國安捷倫科技公司）鑒定DNA濃度，保證各DNA樣本濃度基本一致。

單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism， SNP）位點選取。查詢NCBl網(wǎng)（http：//www.ncbi.nlm nih.gov）獲取TLR4基因的全序列或全外顯子組，進行 高通量測序和生物信息學(xué)分析。TLR4基因位于人類 第9號染色體 上，其由4個外顯子和3個內(nèi)含 子組成，篩選出rs10759930、rs10983755、rs11536889、 rs7873784共4個SNP位點。

聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法（polymerase chainreaction-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP）檢測TLR4基因SNP位點的多態(tài)性。經(jīng)GeneBank獲取TLR4的基因資料，由上海博尚生物技術(shù)有限公司據(jù)此設(shè)計引物。采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增試劑盒（美國ThermoFisherScientific公司）及LightCycler96實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（瑞士Roche公司）擴增自的片段進行，設(shè)置反應(yīng)體系： 10× TaqMan Universal PCRMasterMix5μL ， 20× TaqMan SNP Genotyping Assay 0.25μL ，模板DNA 20ng ，dd H₂O4.75μL ，總體積為 10μL 。PCR反應(yīng)條件： 95^°C 預(yù)變性 10min ， 95°C 變性 15s ，60^°C 延伸 1min ，共40個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物、DAN標志物各 8μL ，分別與凝膠染色緩沖液 2μL 混合，GelDoc-ItXR + 凝膠成像系統(tǒng)（美國UVPLLC公司）拍照分析，檢測DNA片段大小，并對其進行回收純化。經(jīng)Agilent2100BioanalyzerDNA自動測試儀（美國AgilentTechnologies公司）檢測PCR產(chǎn)物核苷酸序列，通過Chromas軟件鑒定基因型。由2名研究員單獨判讀，重新檢測結(jié)果不一致的樣本，基因分型成功率為 100% 。TLR4基因SNP位點的引物序列見表1。

表1TLR4基因SNP位點的引物序列

1.3.3 隨訪ICVD發(fā)生情況

病人出院后通過門診、電話等方式隨訪，以發(fā)生ICVD或截至隨訪時間（2023年6月）為隨訪終點，隨訪時間 8～51 個月，中位隨訪時間29個月。將發(fā)生ICVD的病人納入發(fā)生組，未發(fā)生ICVD的病人納入未發(fā)生組。根據(jù)《心腦血管疾病康復(fù)指南》9相關(guān)標準對ICVD進行診斷，ICVD包括冠狀動脈性疾病、左心室肥厚、充血性心力衰竭、腦血管疾病及大血管動脈粥樣硬化等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SHEsis軟件行發(fā)生組和未發(fā)生組TLR4位點的多態(tài)性分布頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，定性資料以例數(shù)、百分比 （% 表示，采用 χ² 檢驗；符合正態(tài)分布和方差齊性的定量資料以均數(shù) ± 標準差 $（ ＼boldsymbol { ＼overbar { x } } ＼pm ＼boldsymbol { s } ）$ 表示，采用獨立樣本t檢驗。采用Cox回歸模型分析T2DM病人并發(fā)ICVD的影響因素。由于基因型是無序多分類資料，在多因素分析中將rs11536889位點CC基因型設(shè)置為啞變量，擬合回歸模型。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1發(fā)生組和未發(fā)生組臨床資料比較

截止隨訪終點，243例T2DM病人失訪19例，224例中發(fā)生ICVD病人52例（ 23.21% ），其中冠狀動脈性疾病18例，左心室肥厚13例，充血性心力衰竭11例，腦血管疾病4例，大血管動脈粥樣硬化6例。發(fā)生組年齡大于未發(fā)生組（ Plt;0.05 ，高血壓構(gòu)成比、收縮壓、HbA1c、BUN水平高于未發(fā)生組（ Plt;0.05） ，T2DM病程長于未發(fā)生組（ Plt;0.05） ，HDL-C水平低于未發(fā)生組（ Plt;0.05， 。詳見表2。

表2兩組臨床資料比較

（續(xù)表）

2.2發(fā)生組和未發(fā)生組TLR4基因多態(tài)性的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

發(fā)生組和未發(fā)生組TLR4基因rs10759930、rs10983755、rs11536889、rs7873784位點的實際基因與Hardy-Weinberg遺傳平衡定律預(yù)測的基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（ Pgt;0.05 。提示兩組病人均與Hardy-Weinberg平衡定律相符，不受遺傳傳變的影響，且無突變，遷移或自然選擇，具有群體代表性。詳見表3、表4。

表3兩組TLR4基因多態(tài)性SNP位點rs10759930、rs10983755的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 單位：例 （%）

表4兩組TLR4基因多態(tài)性的SNP位點rs11536889、rs7873784Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.3發(fā)生組和未發(fā)生組TLR4基因rs10759930、 rs10983755、rs11536889、rs7873784位點的基因多態(tài) 性比較發(fā)生組TLR4基因rs11536889位點GG基因型頻率、G等位基因頻率均高于未發(fā)生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ ?Plt;0.05 ）。詳見表5。

表5兩組TLR4基因SNP位點的基因多態(tài)性比較 單位：例（%）

2.4T2DM病人并發(fā)ICVD影響因素的Cox分析

將自變量年齡（實際值）、高血壓（否 =0 ，是 =1 ）、收縮壓（實際值）、HbA1c（實際值）、BUN（實際值）、T2DM病程（實際值）、HDL-C（實際值）及TLR4基因rs11536889位點基因型進行賦值，rs11536889位點基因型：以CC基因型作為參考， ∨（1）=1 代表CG基因型， V（Ω₁）=0 代表非CG基因型。以ICVD（否 =0 ，是

1）、時間為因變量行Cox回歸模型分析。以方差膨脹因子（varianceinflationfactor，ViF）值 gt;10 為排除共線性變量的依據(jù)。收縮壓與高血壓呈共線性，排除收縮壓，保留高血壓。結(jié)果顯示，年齡、高血壓、T2DM病程、HDL-C及TLR4基因rs11536889位點GG基因型是T2DM病人并發(fā)ICVD的影響因素（ ?Plt;0.05 。詳見表6。

表6T2DM病人并發(fā)ICVD影響因素的Cox回歸分析

3討論

T2DM引起的高血糖和胰島素抵抗導(dǎo)致內(nèi)皮細胞受損，釋放促炎因子和凝血因子，刺激平滑肌細胞增殖和遷移，形成動脈粥樣硬化斑塊，進而引發(fā)動脈管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致局部組織缺血、缺氧和代謝紊亂，誘導(dǎo)細胞死亡和組織損傷，且缺血性組織損傷可誘發(fā)全身或局部的炎癥反應(yīng)和凝血異常，形成惡性循環(huán)，最終發(fā)生ICVD[10-11]。T2DM病人并發(fā) ICVD是多因素綜合作用的結(jié)果，與T2DM及相關(guān)危險因素（如年齡、高血壓及高脂血癥等）有關(guān)，并非所有T2DM病人均發(fā)生ICVD，表明一些遺傳或環(huán)境因素可影響T2DM病人ICVD發(fā)生[12]。因此，從基因角度揭示T2DM并發(fā)ICVD的機制，尋找有效的干預(yù)靶點，對防治該并發(fā)癥具有重要的臨床意義。

本研究T2DM病人ICVD發(fā)生率為 23.21% ，與顧霖等[13報道的 22.79% 及王環(huán)君等[14報道的 22.73% 相近，但高于Tai等[15報道的 11.82% ，分析可能與樣本地域來源、生活環(huán)境存在差異有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，發(fā)生組TLR4基因rs11536889位點GG基因型頻率、G等位基因頻率均高于未發(fā)生組，且經(jīng)Cox回歸模型分析顯示，rs11536889位點GG基因型是T2DM病人并發(fā)ICVD的影響因素。TLR4是一種模式識別受體家族的跨膜蛋白，主要表達在單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等免疫相關(guān)細胞，通過識別多種內(nèi)源性和外源性的配體激活相關(guān)炎癥信號通路，誘導(dǎo)炎性因子和趨化因子的表達和釋放，引發(fā)適應(yīng)性免疫-炎癥反應(yīng)[16-17]。TLR4可誘導(dǎo)缺血組織的炎癥反應(yīng)，加劇缺血損傷，并影響缺血后神經(jīng)元再生和修復(fù)，在ICVD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[18]。TLR4基因多態(tài)性是指TLR4基因序列存在的遺傳變異，可影響TLR4蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而改變個體對外源或內(nèi)源刺激物的反應(yīng)。TLR4基因rs11536889位點是一個功能性多態(tài)性，AIkudmani等[19通過對比沙特T2DM病人與健康受試者的TLR4基因rs11536889位點基因型頻率發(fā)現(xiàn)，沙特T2DM病人rs11536889位點GG基因型頻率高于健康受試者，且與該病發(fā)生密切相關(guān) S_R=4.25 ，95%CI（1.36，13.59）， P=0.007? ]。周國琴等2研究指出，TLR4基因rs11536889位點與機體炎癥反應(yīng)程度相關(guān)，其可能通過調(diào)節(jié)外周血血清炎性因子水平參與疾病進展。TLR4基因rs11536889位點可能通過影響TLR4的表達和功能，調(diào)節(jié)T2DM病人的免疫和炎癥反應(yīng)，從而增加ICVD的發(fā)生風險。但具體的機制仍需進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，年齡、高血壓、T2DM病程、HDL-C也是T2DM病人并發(fā)ICVD的影響因素。隨著年齡的增長，動脈壁發(fā)生硬化、增厚和鈣化，導(dǎo)致血管彈性降低和阻力增加，從而增加ICVD風險；高血壓通過損傷血管內(nèi)皮、增加心臟負荷、激活炎癥反應(yīng)及影響神經(jīng)系統(tǒng)功能等機制引發(fā)ICVD；T2DM病人隨著病程的延長逐漸發(fā)生內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凝血功能異常、微循環(huán)障礙等，從而損傷心腦血管系統(tǒng)；HDL-C可清除動脈壁上的LDL-C，并具有抗氧化、抗炎癥、抗凝血和促進內(nèi)皮修復(fù)等多種保護作用，其水平升高可預(yù)防心腦血管事件。

綜上所述，TLR4基因rs11536889位點GG基因型、年齡、高血壓、T2DM病程、HDL-C是T2DM病人并發(fā)ICVD的影響因素。由于T2DM在不同種族、區(qū)域群體中有遺傳異質(zhì)性，且受到多種基因的調(diào)控、積累，單個基因的影響有限，今后仍需收集更多的樣本量，并擴大SNP位點數(shù)量進行深入研究。

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（收稿日期.2024-01-11）

（本文編輯 薛妮）