阿膠含量定量檢測中DigitalPCR的應用研究

Application of Digital PCR in Quantitative Detection of Ejiao Content

LI Na1.2.3 WANG Yicun1.2.3 GOU Yanping4 GUO Yue5 HOU Guangyue1.2.3 ZHOU Lili1.2.3* [1.Shandong Institute forProduct Quality Inspection;2.National InspectionandTestingCenterforProcessedFood

（Shandong）;3.JinanKeyLaboratoryofFunctionalFoodQualitySafety;4.QingdaoChengyangAdministrationforMarket Regulation; 5.The Offce ofWetland Conservation and Management ofJilin Province]

Abstract：This paperdiscussesthenecessityfeasibilityandtechnicalpathof introducingthedigital polymerasechain reaction（Digital PCR）technologyintothequantitative detectionof ejiao content.Throughacomprehensive evaluationof ejiao samples，combined withDigitalPCR'sadvantagesofhighsensitivityandabsolute quantification，this paperproposes asystematictestingprocess，including thedeterminationof thesamplepopulation，thesetingoftechnical indicators and qualitycharacteristics，sampleextractionandtheevaluationof testresults.The study shows thattheDigital PCR technologycanefectivelyimprovetheaccuracyofquantitativedetectionofejiaocontentandprovidereliablequalitydata for the industry.

Keywords：ejiao content; quantitative detection;Digital PCR

0 引言

代阿膠質(zhì)量控制日益嚴格的要求1。DigitalPCR作為一種先進的核酸定量檢測技術，具有高靈敏度、高準確性以及可實現(xiàn)絕對定量等諸多優(yōu)勢。在阿膠含量定量檢測領域，DigitalPCR技術展現(xiàn)出了巨大的應用潛力，有望為阿膠含量的精確測定提供新的

目前，阿膠含量檢測的方法眾多，但均面臨著不同程度的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的檢測手段在準確性、靈敏度和特異性等方面存在一定的局限性，難以滿足現(xiàn)技術支撐[2]。本研究聚焦于阿膠含量定量檢測中的DigitalPCR應用，以提高阿膠含量檢測的準確性和可靠性為目標，旨在深人探討DigitalPCR技術在阿膠含量定量檢測中的原理、方法、技術優(yōu)勢以及面臨的挑戰(zhàn)等方面內(nèi)容。通過本研究，期望為阿膠質(zhì)量檢測領域提供一種更為有效的含量定量檢測方法，推動阿膠質(zhì)量控制技術的發(fā)展，為保障阿膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供科學依據(jù)。

1阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的必要性

阿膠作為一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，其含量定量檢測結(jié)果對于阿膠產(chǎn)品的質(zhì)量判定、市場監(jiān)管以及消費者權益保護有著至關重要的意義，直接反映了檢測機構在中藥檢測方面的技術水平和質(zhì)量管理能力。不同的檢測機構在阿膠含量定量檢測方面有著不同的技術手段和質(zhì)量把控要求。有的機構依賴傳統(tǒng)檢測方法，只要沒有接到關于阿膠含量檢測結(jié)果的重大質(zhì)疑或投訴，就默認其檢測結(jié)果的準確性；有的實驗室采用常規(guī)的抽檢復查機制，不定期地對已檢測的阿膠樣本進行部分復查，以此來評估檢測的可靠性[3；有的則通過與其他實驗室進行結(jié)果比對的方式，間接判斷自身阿膠含量定量檢測的準確性。在阿膠含量定量檢測過程中，對每一個檢測樣本進行全面且高精度的檢測是非常不現(xiàn)實的。一方面，這會耗費大量的人力、物力和時間成本；另一方面，如果采用全檢方式，容易產(chǎn)生一種錯誤的觀念，即認為阿膠含量檢測的準確性僅僅依靠最后的全檢篩選，仿佛只要檢測人員將不合格的檢測結(jié)果在全檢過程中排除掉就萬事大吉，這在很大程度上把保證阿膠含量定量檢測準確的責任從檢測執(zhí)行人員轉(zhuǎn)移到了最后的全檢環(huán)節(jié)[4]。然而，阿膠含量定量檢測的準確性是由整個檢測過程的各個環(huán)節(jié)所共同決定的，全檢環(huán)節(jié)僅僅是為了獲取檢測結(jié)果和記錄的質(zhì)量信息，它并不能從根本上提升阿膠含量定量檢測的準確性。所以，在阿膠含量定量檢測中引入一種先進、高效的檢測技術，如DigitalPCR（數(shù)字聚合酶鏈反應）是非常必要的。

2 阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的可行性

在阿膠含量定量檢測領域，檢測機構往往會對檢測方法的準確性和可靠性等方面制定相應的質(zhì)量目標。例如某機構在其質(zhì)量目標中規(guī)定，阿膠含量定量檢測的準確率不低于 98% （誤差范圍在±2% 以內(nèi)視為合格）。從現(xiàn)代檢測技術應用的相關準則來看，多種技術可用于中藥材含量檢測，包括傳統(tǒng)的高效液相色譜法（HPLC）、紫外-可見分光光度法等，也包括一些新興技術5。其中，新興技術DigitalPCR（數(shù)字聚合酶鏈反應）具有高靈敏度、高特異性和絕對定量等優(yōu)勢。

從適用范圍考量，一些傳統(tǒng)檢測技術適用于常規(guī)的中藥材成分分析、含量范圍初步判定以及大規(guī)模樣本的初步篩選等情況。而DigitalPCR技術不僅適用于對阿膠含量進行精確的定量檢測，而且在微量成分檢測、復雜基質(zhì)中目標成分檢測方面表現(xiàn)出色。在阿膠含量定量檢測中，檢測機構旨在為行業(yè)提供精準的含量數(shù)據(jù)以保障阿膠產(chǎn)品的質(zhì)量，這一目的與DigitalPCR技術的功能高度契合。而且，通常進行阿膠含量定量檢測的樣本數(shù)量眾多，一般達到一定規(guī)模以便能夠準確反映產(chǎn)品的整體質(zhì)量情況。所以，綜合來看，在阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR技術是可行的、恰當?shù)摹?/p>

3阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的技術路徑

確定檢測樣本總體（包括不同來源、批次的阿膠樣本） $$ 確定阿膠樣本單位產(chǎn)品在含量定量方面的技術指標（如阿膠中特定有效成分的含量范圍等）、質(zhì)量特性（例如成分的穩(wěn)定性、均一性等）及檢測要求（如檢測精度、檢測限等） $$ 確定不合格阿膠樣本的分類（例如根據(jù)含量低于標準下限的程度分為嚴重不合格和輕微不合格等） $$ 規(guī)定可接受的阿膠含量定量檢測的誤差范圍等質(zhì)量水平 $$ 檢索適用于阿膠含量定量檢測的DigitalPCR技術參數(shù)及操作流程（如同類樣本的最佳反應條件、引物設計原則等） $$ 抽取阿膠樣本進行DigitalPCR檢測（按照特定的抽樣規(guī)則選取代表性樣本） $$ 檢驗抽取的阿膠樣本（使用DigitalPCR技術進行精確的含量定量分析） $$ 給出阿膠含量是否合格的判斷結(jié)論（依據(jù)預先設定的質(zhì)量水平判斷樣本是否合格） $$ 復查（必要時，如初次檢測結(jié)果處于臨界值附近或者結(jié)果存在爭議時，再次進行DigitalPCR檢測以確保結(jié)果的準確性）。

4 應用實例及思考

4.1確定檢測樣本總體

阿膠產(chǎn)品在市場上來源廣泛，包括不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)廠家以及不同批次的產(chǎn)品。本實例將收集來自多個知名阿膠生產(chǎn)企業(yè)、不同產(chǎn)地且涵蓋近三年不同批次的阿膠樣本作為檢測樣本總體，旨在全面評估阿膠產(chǎn)品的含量情況，保證檢測結(jié)果能代表市場上阿膠產(chǎn)品的整體質(zhì)量水平。

4.2確定阿膠樣本單位產(chǎn)品在含量定量方面的技術指標、質(zhì)量特性及檢測要求

4.2.1技術指標

阿膠中含有多種有效成分，如膠原蛋白、氨基酸等。以其中的特征性氨基酸-羥脯氨酸為例，根據(jù)相關質(zhì)量標準及行業(yè)研究，其含量應在一定范圍內(nèi)。例如，優(yōu)質(zhì)阿膠中羥脯氨酸的含量應不低于某一特定比例（如 8% ）。

4.2.2質(zhì)量特性

阿膠樣本的質(zhì)量特性主要體現(xiàn)在成分的穩(wěn)定性和均一性上。穩(wěn)定性方面，阿膠在儲存過程中，其有效成分含量應保持相對穩(wěn)定，不應因環(huán)境因素（如溫度、濕度等）而發(fā)生顯著變化。均一性則要求在同一批次阿膠產(chǎn)品中，不同部位的樣本有效成分含量差異應在合理范圍內(nèi)，以確保產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

4.2.3檢測要求

為了精確測定阿膠中的有效成分含量，檢測精度要求較高。例如，對于羥脯氨酸含量的檢測，檢測限應達到 0.1% ，相對標準偏差（RSD）應控制在5% 以內(nèi)，以確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

4.3確定不合格阿膠樣本的分類

4.3.1嚴重不合格

如果阿膠樣本中羥脯氨酸含量低于標準下限值的 30% 以上，這將嚴重影響阿膠的質(zhì)量和功效，被判定為嚴重不合格?；蛘甙⒛z樣本存在嚴重的成分混雜情況，如摻雜了其他非阿膠成分且比例超過5% ，也視為嚴重不合格。

4.3.2輕微不合格

當阿膠樣本中羥脯氨酸含量低于標準下限值，但差距在 30% 以內(nèi)時，判定為輕微不合格。另外，若樣本在儲存過程中有效成分含量有一定波動，但仍在可接受范圍內(nèi)（如波動范圍在 ±10% 以內(nèi)），同時不影響阿膠的整體質(zhì)量，也可歸為輕微不合格。

4.4規(guī)定可接受的阿膠含量定量檢測的誤差范圍等質(zhì)量水平

根據(jù)行業(yè)標準和實際應用需求，本檢測規(guī)定可接受的阿膠含量定量檢測誤差范圍為 ±5% 。即檢測結(jié)果與真實值之間的偏差在 ±5% 以內(nèi)視為合格。同時，要求檢測的回收率在 90%～110% 之間，以確保檢測方法的準確性。

4.5檢索適用于阿膠含量定量檢測的DigitalPCR技術參數(shù)及操作流程

4.5.1技術參數(shù)

在阿膠含量定量檢測中，針對阿膠樣本的特點，DigitalPCR的反應體系總體積為 20μL ，其中包含特定的引物濃度（如 0.2μM ）、模板DNA量（根

據(jù)樣本濃度調(diào)整）、dNTPs（ （0.2mM ）以及合適的聚合酶（如Taq酶）。退火溫度根據(jù)引物的特性設定為60^°C ，延伸時間為30秒，循環(huán)數(shù)為40個

4.5.2操作流程

首先，對阿膠樣本進行預處理，提取其中的DNA。然后將提取的DNA進行定量，并按照上述反應體系進行DigitalPCR反應體系的配制。將配制好的反應體系加入到DigitalPCR專用芯片中，進行反應。反應結(jié)束后，通過特定的儀器軟件進行數(shù)據(jù)讀取和分析，得到阿膠樣本中目標成分（如羥脯氨酸相關基因片段）的絕對定量結(jié)果。

4.6抽取阿膠樣本進行DigitalPCR檢測

4.6.1抽樣方法

采用分層抽樣與隨機抽樣相結(jié)合的方法。將阿膠樣本按照產(chǎn)地、生產(chǎn)廠家、批次等因素進行分層。例如，按照產(chǎn)地分為山東產(chǎn)區(qū)、河北產(chǎn)區(qū)等；按照生產(chǎn)廠家規(guī)模分為大型、中型、小型企業(yè)生產(chǎn)的阿膠。然后在每個分層中按照一定比例隨機抽取樣本，以確保抽取的樣本具有代表性。

4.6.2樣本數(shù)量

考慮到檢測的準確性和成本效益，根據(jù)樣本總體的規(guī)模確定抽取樣本數(shù)量。本實例中，樣本總體數(shù)量為500個，按照統(tǒng)計學原理，抽取樣本數(shù)量為50個，其中每個分層中的樣本數(shù)量根據(jù)該分層在總體中的比例進行分配。

4.7檢驗抽取的阿膠樣本

使用DigitalPCR技術對抽取的50個阿膠樣本進行精確的含量定量分析。按照預先設定的技術參數(shù)和操作流程進行反應，每個樣本進行三次重復實驗，以減少實驗誤差。將得到的三次結(jié)果取平均值作為該樣本的最終檢測結(jié)果。

4.8給出阿膠含量是否合格的判斷結(jié)論

將每個阿膠樣本的檢測結(jié)果與預先設定的質(zhì)量水平（如羥脯氨酸含量標準范圍及可接受的誤差范圍）進行比較。如果樣本的檢測結(jié)果在可接受范圍內(nèi)，則判定該樣本阿膠含量合格；若檢測結(jié)果超出范圍，則判定為不合格。統(tǒng)計合格樣本和不合格樣本的數(shù)量，并計算合格率。例如，若有45個樣本的檢測結(jié)果在可接受范圍內(nèi)，則合格率為45÷50×100%=90%

4.9復查

在檢測過程中，如果某個阿膠樣本的檢測結(jié)果處于臨界值附近（如羥脯氨酸含量接近標準下限且在誤差范圍邊緣），或者不同次檢測結(jié)果存在較大差異（如三次重復實驗結(jié)果的RSD超過 10% ），則需要對該樣本進行復查。復查時，重新按照DigitalPCR的操作流程進行檢測，若復查結(jié)果仍存在疑問，則考慮采用其他檢測方法（如HPLC-MS）進行驗證，以確保結(jié)果的準確性。

4.10阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的思考 4.10.1技術優(yōu)勢

DigitalPCR技術在阿膠含量定量檢測中具有明顯的優(yōu)勢。首先，其高靈敏度能夠檢測到極低含量的目標成分，對于阿膠中微量有效成分的檢測非常關鍵。其次，絕對定量的特性避免了傳統(tǒng)相對定量方法中由于標準曲線制作等因素帶來的誤差，提高了檢測結(jié)果的準確性。此外，DigitalPCR對復雜基質(zhì)（如阿膠這種成分復雜的中藥材）具有較好的適應性，能夠在復雜的成分背景下準確檢測目標成分含量。

4.10.2技術局限性

然而，DigitalPCR技術也存在一些局限性。例如，設備成本較高，需要專業(yè)的操作人員進行操作和維護，這在一定程度上限制了其在一些小型檢測機構或企業(yè)中的普及應用。同時，DigitalPCR檢測過程相對復雜，檢測時間較長，對于大規(guī)模樣本的快速檢測存在一定挑戰(zhàn)。

4.10.3改進方向

為了更好地發(fā)揮DigitalPCR在阿膠含量定量檢測中的作用，從以下幾個方面進行改進。一是降低設備成本，通過技術創(chuàng)新或大規(guī)模生產(chǎn)降低DigitalPCR儀器的價格，提高其市場競爭力；二是優(yōu)化操作流程，簡化檢測步驟，縮短檢測時間，提高檢測效率；三是加強技術培訓，提高操作人員的技術水平，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。此外，還進一步研究DigitalPCR技術與其他檢測技術的聯(lián)用，充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢，為阿膠含量定量檢測提供更完善的解決方案。

5結(jié)語

DigitalPCR在阿膠含量定量檢測中的應用展現(xiàn)了其顯著的技術優(yōu)勢，能夠為確保阿膠產(chǎn)品質(zhì)量提供更為精準的檢測數(shù)據(jù)。隨著對中藥材檢測技術要求的不斷提高，采用先進的檢測手段已成為行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。盡管DigitalPCR技術在應用中面臨一些挑戰(zhàn)，但通過技術創(chuàng)新和流程優(yōu)化，未來有望在阿膠及其他中藥材的檢測中得到更廣泛的應用。為了更好地保障消費者權益和提升市場監(jiān)管能力，促進DigitalPCR技術的普及與應用將是今后研究的

重要方向。

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（責任編輯：袁文靜）