支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR及tNGS對菌陰肺結(jié)核的診斷價值

Diagnostic Valueof Bronchial Lavage Fluid Smear，Mycobacterium Tuberculosis Culture，Real-time FluorogenicQuantitativePCRand tNGS in BacteriologicalNegative Pulmonary Tuberculosis/LUOBin，JI Guijuan，HE Meiling.//Medical Innovationof China，2025，22（16）：142-146

[Abstract]Objective： To investigate the diagnostic value of bronchial lavage fluid smear， Mycobacterium tuberculosis culture，real-time fluorogenic quantitative polymerase chain reaction （PCR），and targeted nextgeneration sequencing （tNGS）for bacteriological negative pulmonary tuberculosis.Method： A total of 8O patients diagnosed with bacteriological negative pulmonary tuberculosis admited to Shangrao Municipal Hospital from March 202O to May 2O23 were retrospectively selected and included in the study group，another 8O patients with lung disease admited toour hospital during the same period wereselected and included as the control group.The patients in both groups received bronchoscopy，obtained bronchial lavage fluid samples，and bronchial lavage fluid smear，Mycobacterium tuberculosis culture，real-time fluorogenic quantitative PCR，tNGS were detected. The consistencyand efcacyof the four detection methods in the diagnosis of bacteriological negative pulmonary tuberculosis were compared.Result： Among the 16O patients，78 cases were positive by real-time fluorogenic quantitative PCR，89 cases were positive by tNGS，62 cases were positive by Mycobacterium tuberculosis culture，and 7O cases were positive by bronchial lavage fluid smear.The sensitivities of real-time fluorogenic quantitative PCR，tNGS，Mycobacterium tuberculosis culture and bronchial lavage fluid smear in the diagnosis of bacteriological negative pulmonary tuberculosis were 76.25% ， 100% ，43.75 % and 65.00% ，respectively， the specificity were 78.75 % ，88.75 % ，66.25 % and 77.50% ，respectively，and the accuracy were 77.50% ， 94.38% （20 55.00% ， 71.25% ，respectively. The consistency between tNGS and the gold standard was the highest， with a Kappa value of O.944，and the Kappa value of bronchial lavage fluid smear，Mycobacterium tuberculosis culture and realtimefluorogenic quantitative PCR were 0.425，O.1OO and0.55O，respectively.Thesensitivity，positive predictive value，negative predictive value and accuracyof tNGS weresignificantlyhigherthan those of bronchial lavage fluid smear，Mycobacterium tuberculosis culture and real-time fluorogenic quantitative PCR （ P lt;0.05）. The specificity of tNGS was higher than that of Mycobacterium tuberculosis culture （ P lt;0.05）.Conclusion：Bronchial lavage fluid smear，Mycobacterium tuberculosis culture，real-time fluorogenic quantitative PCRand tNGS detection have certaindiagnosticeffectsonbacteriologicalnegativepulmonary tuberculosis，amongwhichtNGSdetectionhas high sensitivity and specificity.

[KeyWords] Bronchial lavage fluid smearMycobacterium tuberculosis cultureReal-time fluorogenic quantitative polymerase chain reaction Targeted next-generation sequencing Bacteriological negative pulmonary tuberculosis

First-author's address： Department of RespiratoryMedicine，Shangrao Municipal Hospital，Shangrao ， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2025.16.034

肺結(jié)核是指因結(jié)核分枝桿菌感染所致的一類呼吸系統(tǒng)疾病，主要發(fā)生在肺組織、支氣管、胸膜等部位，具有較強傳染性，屬于我國乙類傳染病。有資料統(tǒng)計，我國肺結(jié)核發(fā)病具有季節(jié)性和循環(huán)周期性，一般春季發(fā)病率高，且高密度地區(qū)和人群流動性較大的地區(qū)分布廣{]。其起病緩慢，早期癥狀不明顯，部分患者屬于非活動期肺結(jié)核或潛伏感染者，不易診斷，若未得到及時診斷治療，不僅增強傳染性，加大結(jié)核防控難度，嚴重者還會導(dǎo)致死亡[2。因此，提高臨床診斷準(zhǔn)確性對制訂治療方案及傳染病防控工作十分重要。菌陰肺結(jié)核是指至少3次痰涂片及1次痰培養(yǎng)為陰性，但患者臨床表現(xiàn)及其他檢查均符合肺結(jié)核癥狀的活動性肺結(jié)核。菌陰肺結(jié)核常見于肺結(jié)核發(fā)病早期階段，相較于菌陽肺結(jié)核，其結(jié)核分枝桿菌的檢出率較低或完全沒有，雖然傳染性較小，但潛在風(fēng)險大，后期陰轉(zhuǎn)陽則會表現(xiàn)出發(fā)熱、咳嗽、咯血等癥狀，延誤病情，對患者預(yù)后造成不良影響[3]。因此加強對菌陰肺結(jié)核的特異性診斷十分必要。目前臨床對菌陰肺結(jié)核的檢測方式較多，如支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）、靶向基因測序（targeted next-generation sequencing，tNGS）等[4-5]，但對不同檢測方式的診斷效果比較尚缺乏充分的高質(zhì)量文獻或資料佐證。為進一步探討不同檢測方式對菌陰肺結(jié)核的診斷價值，本研究進行回顧性分析，以上饒市立醫(yī)院80例菌陰肺結(jié)核患者為研究對象，探討并比較支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR及tNGS對菌陰肺結(jié)核的診斷價值，具體報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

回顧性選取2020年3月—2023年5月上饒市立醫(yī)院收治的80例確診菌陰肺結(jié)核的患者，將其納入研究組，另選取本院同期收治的80例肺疾病患者，將其納入對照組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)： ① 年齡滿18歲，研究組患者符合菌陰肺結(jié)核診斷，兩組均存在呼吸道和/或感染癥狀（咳嗽、發(fā)熱、咳痰等），但無咯血、消瘦、乏力表現(xiàn)； ② 認知水平及精神正常； ③ 無其他嚴重合并癥，且耐受支氣管沖洗過程；④ 病史與住院資料齊全。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)： ① 既往接受肺部手術(shù)，或服用抗結(jié)核藥物； ② 無法控制的劇烈咳嗽，難以配合活檢取樣； ③ 合并肺動脈高壓、凝血功能障礙，以及心、肝等重要器官功能不全；④ 胸腔積液包裹，形成胸膜纖維板。本研究經(jīng)上饒市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有患者首先完成支氣管鏡檢查，具體為：患者檢查需禁食 6h 以上，用 2% 利多卡因?qū)Ρ乔?、咽喉進行局部麻醉，患者取平臥位，使用可視軟性喉鏡（浙江優(yōu)億醫(yī)療器械有限公司）經(jīng)鼻腔插入目標(biāo)段支氣管，觀察可視范圍內(nèi)肺部、目標(biāo)段支氣管黏膜情況，通過活檢口灌入約 10mL 生理鹽水對整體肺部和目標(biāo)段支氣管進行灌洗，使用吸引器吸出沖洗液，并收集入標(biāo)本瓶中，同法灌洗2、3次。將標(biāo)本瓶中灌洗液依次進行支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS檢測。1.2.1支氣管灌洗液涂片具體操作參考文獻[7]，使用膠頭滴管吸取適量支氣管灌洗液樣本，將其均勻涂抹于載玻片上，通過萎爾－尼爾遜染色抗酸染色法檢測抗酸桿菌[8，抗酸染色液來自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。陽性標(biāo)準(zhǔn)：每100個油鏡視野中檢出 ?2 條抗酸桿菌。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)所用儀器為全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），先進行標(biāo)本培養(yǎng)，吸取 0.5mL 支氣管灌洗液樣本置于MGIT管中完成接種，然后放置在微生物恒溫培養(yǎng)箱（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）中進行孵育，避光，溫度 35°C ，每周觀察1次，持續(xù)6周，采用抗酸染色法和免疫層析法進行菌種鑒定。陽性標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)菌種鑒定確認為結(jié)核分枝桿菌。

1.2.3實時熒光定量PCR 吸取支氣管灌洗液樣本，采用離心機進行離心操作，設(shè)置轉(zhuǎn)速 3000r/min ，時間 10min ，分離上層清液，反復(fù)沉淀后混合適量無菌生理鹽水，使用PCR儀（杭州朗基，型號T20）進行定量PCR擴增，之后采用實時熒光定量 PCR^[9] 進行檢測，采用全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（西安天隆科技有限公司），所用試劑盒來源于西安天隆科技有限公司。陽性標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)核分枝桿菌DNA數(shù)gt;1×10³ 拷貝 /mL

1.2.4tNGS吸取支氣管灌洗液樣本，放入攪拌玻璃珠搖勻混合，采用磁珠核酸提取法，選擇核酸分離試劑盒（南京諾唯贊生物），嚴格按照說明書操作，完成DNA提取后，使用PCR儀進行靶向病原擴增富集后，構(gòu)建DNA文庫，采用二代測序儀（illumina，型號：Miseq）進行基因測序，測序試劑盒（illumina，貨號：MS-103-1002），質(zhì)控測序結(jié)果，去除人源序列，與美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進行比對，確定病原菌種類與豐度。

1.3觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）記錄支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS4種檢測方式的陽性（菌陰肺結(jié)核）例數(shù)與陰性（非菌陰肺結(jié)核）例數(shù)。（2）4種檢測方式診斷價值比較：以文獻[6]《肺結(jié)核診斷和治療指南》中菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，即至少三次痰涂片與一次痰培養(yǎng)為陰性，經(jīng)支氣管或肺部組織病理檢查確診為菌陰肺結(jié)核（陽性）。將支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS4種檢測方式的診斷結(jié)果與實際確診結(jié)果進行對比。采用配對四格表 χ² 檢驗分析支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS4種檢測方式對菌陰肺結(jié)核的診斷效果，計算敏感度、特異度、準(zhǔn)確度等相關(guān)參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS24.0軟件處理。計數(shù)數(shù)據(jù)采用率（ % ）表示，行 χ² 檢驗；計量數(shù)據(jù)采用（ ）表示，行Ψ_t 檢驗；臨床診斷行Kappa一致性分析，Kappa值大于0.75為一致性高，0.40＼～0.75為一致性中等，小于0.40為一致性低。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組基線資料比較

研究組男45例，女35例；年齡22＼～38歲，平均 （ 29.53±4.70 ）歲；病程4周 ～5 個月，平均（ 2.08±0.55 ）個月。對照組男46例，女34例；年齡23＼～39歲，平均（ 30.85±4.62 ）歲；疾病類型：細菌性肺炎41例、肺膿腫25例、肺癌6例、支氣管擴張癥8例。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（ Pgt;0.05 ），具有可比性。

2.24種檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)診斷的一致性

支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS與金標(biāo)準(zhǔn)診斷的一致性Kappa值分別為0.425、0.100、0.550、0.944，其中tNGS診斷的一致性最高。支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS診斷菌陰肺結(jié)核的敏感度分別為 65.00% ： 43.75% 、 76.25% 、100% ，特異度分別為 77.50% 、 66.25% 、 78.75% 、88.75% ，準(zhǔn)確度分別為 71.25% 、 55.00% 、 77.50% ！94.38% 。4種檢測方式敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05 ）。tNGS敏感度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度均顯著高于支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR（ Plt;0.05 。tNGS特異度高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（ Plt;0.05 ）。見表1、表2、表3、表4、表5。

3討論

肺結(jié)核是一種因結(jié)核分枝桿菌感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病，具有較強傳染性，能夠通過飛沫傳播，有研究顯示，肺結(jié)核在老年人、幼兒等易感人群中傳播速度較快[10-]。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，截至 2019 年，全球約有1000萬新發(fā)肺結(jié)核患者，我國新發(fā)及復(fù)發(fā)肺結(jié)核約83.3萬例，每年新發(fā)病例雖得到控制，但整體感染病例仍居高不下[12]。菌陰肺結(jié)核在臨床并不少見，因部分患者無法得到細菌學(xué)證實，痰涂片及支氣管灌洗液涂片顯示為陰性，造成延誤治療，導(dǎo)致病情加重，形成傳染源，影響自身和他人，為社會帶來不良影響，因此提高早期診斷的準(zhǔn)確性，做到早發(fā)現(xiàn)早治療對結(jié)核病有效防治十分重要。

本研究中，160例菌陰肺結(jié)核患者實時熒光定量PCR檢測陽性78例，tNGS檢測陽性89例，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測陽性62例，支氣管灌洗液涂片檢測陽性70例，經(jīng)Kappa一致性分析，tNGS診斷的一致性最高，且tNGS的敏感度、準(zhǔn)確度相較其他3種檢測方式均更高，提示tNGS對菌陰肺結(jié)核診斷較為敏感，能較為準(zhǔn)確鑒別菌陰肺結(jié)核患者，與前人結(jié)果基本一致[13]。結(jié)核分枝桿菌通常由呼吸道進入機體，感染肺部形成肺結(jié)核，原因主要在于肺泡中氧氣含量豐富，為結(jié)核分枝桿菌提供了適宜的生長條件，因此在肺部更易繁殖[14]。tNGS可靶向檢測樣本病原體，通過對病原體核酸含量進行高通量測序，能準(zhǔn)確判斷其種類及表達情況，尤其對于常規(guī)培養(yǎng)與免疫學(xué)手段檢出敏感度低的病原體，其診斷效能高[15]。不同于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，tNGS無需進行傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)過程，檢測過程相對簡化，同時具備靶向性與高敏感性，通過基因庫數(shù)據(jù)對比，能直觀區(qū)分微生物種類，提升檢測準(zhǔn)確度，此法檢測敏感度較高，在臨床應(yīng)用較廣[16-17]。本研究中實時熒光定量PCR為僅次于tNGS的敏感度高的檢測方式，實時熒光定量PCR基于PCR技術(shù)，通過使用熒光染料標(biāo)記的探針，對結(jié)核分枝桿菌PCR反應(yīng)過程中特定的核昔酸序列進行擴增，再通過體外擴增技術(shù)實現(xiàn)定量分析，熒光強度與PCR產(chǎn)物數(shù)量成正比，因此可根據(jù)熒光信號進行結(jié)核分枝桿菌的檢測，實時熒光定量PCR的敏感度、特異性均較高，在臨床胃黏膜檢測、病毒檢測中得到廣泛應(yīng)用[18-19]。但弊端在于對操作人員技術(shù)、專業(yè)知識和經(jīng)驗有一定要求，且檢測設(shè)備較為昂貴，基層醫(yī)院不易推廣。支氣管灌洗液涂片其檢測原理則利用結(jié)核分枝桿菌的抗酸特性，即在堿性復(fù)紅染料染色后能夠抵抗抗酸性脫色劑的脫色效果，故通常稱其為抗酸桿菌。其抗酸原理在于細胞壁含有大量脂質(zhì)體，一般不易著色，但其產(chǎn)生的酸性物質(zhì)與染料結(jié)合后難以被脫色劑脫色，因而可與其他病菌區(qū)分開[20]。此檢測方法相較結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)更簡單快速， 2～4h 內(nèi)即可出結(jié)果，在臨床常用于活動性肺結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷[21]。本研究中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的敏感度、準(zhǔn)確度等較低，可能與存在樣本誤差、活性菌數(shù)目過少、噬菌體濃度及環(huán)境等因素有關(guān)。

綜上，支氣管灌洗液涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、tNGS均對菌陰肺結(jié)核具有一定診斷價值，但tNGS診斷菌陰肺結(jié)核的敏感度、特異度明顯高。

參考文獻

[1]楊勝雄，潘春柳，李軍，等.2010-2019年貴陽市肺結(jié)核患者流行病學(xué)特征分析及趨勢預(yù)測[J].疾病監(jiān)測，2022，37（6）：750-754.

[2]章敏.外周血IFN- γ 、IL-10水平及紅細胞免疫功能對重癥肺結(jié)核患者死亡預(yù)后的預(yù)測價值[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2020，27（7）：1161-1165.

[3]蔣駿，張曉龍，王斐嫻，等.蘇州市初治菌陰肺結(jié)核患者就診延遲現(xiàn)況及臨床特征[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2020，20（5）：439-442.

[4]歐維正，劉海蘭，雷毅娜，等.支氣管肺泡灌洗液涂片抗酸染色、L-J培養(yǎng)、TB-LAMP、XpertMTB/RIF檢測在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用比較[J]山東醫(yī)藥，2020，60（23）：57-60.

[5]蔡珠明，黨光輝，臧鑫鑫，等.結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、副結(jié)核分枝桿菌和禽分枝桿菌禽亞種多重 TaqMan 熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2023，45（1）： 51-59.

[6]中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會.肺結(jié)核診斷和治療指南[J].中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志，2013，20（2）：7-11.

[7]吳龍章，鐘炳棠，劉燕文，等.對《結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程》的一點看法[J].中國防癆雜志，2012，34（3）：192-193.

[8]李虹澤，項杰.熒光鏡檢法和萎－尼氏抗酸染色法檢測1000例結(jié)核患者痰樣本的結(jié)果分析[J].臨床肺科雜志，2010，15（1）： 126.

[9]徐德順，吳曉芳，程平慶.實時熒光定量PCR 法與常規(guī) PCR法及細菌培養(yǎng)法檢測單增李斯特菌的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（5）：861-863.

[10]常玥，章亞夫，許圓圓，等.浙江臺州肺結(jié)核流行特征分析（2011—2021年）[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2023，50（5） ： 353-356.

[11]康萬里，端木宏謹，鄭素華.出生隊列研究在中國結(jié)核病分布中的應(yīng)用[J].中國防癆雜志，2011，33（9）：531-534.

[12]陳薪宇，張怡，王信，等.結(jié)核病流行現(xiàn)況及遺傳易感性研究進展[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2022，47（12）：1441-1446.

[13]唐小莉，戴廣川，高衛(wèi)衛(wèi)，等.宏基因組二代測序在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用[J]. 臨床肺科雜志，2023，28（10）：1541-1545.

[14] BEHAR S M，CARPENTER SM，BOOTY MG，et al.Orchestration of pulmonary T cell immunity duringMycobacterium tuberculosis infection ： immunity interruptus[J].SeminImmunol，2014，26（6）：559-577.

[15]趙素娥，高欣，劉勝崗，等.肺泡灌洗液宏基因組二代測序?qū)σ伤品谓Y(jié)核的診斷價值[J].臨床肺科雜志，2022，27（5）：722-725.

[16]范鵬超，劉賀，巴婧，等.宏基因組二代測序在耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染暴發(fā)中的應(yīng)用[J].中國感染控制雜志，2024，23（2）：182-188.

[17]梁瑤，吳祥林，王曉川，等.宏基因組二代測序輔助診斷Q熱立克次體肺炎1例[J].中國感染與化療雜志，2022，22（1）：91-94.

[18]張睿祺，張哲，陳東，等.熒光定量PCR法與免疫組織化學(xué)法檢測胃黏膜活檢標(biāo)本中幽門螺桿菌感染的比較[J].中華病理學(xué)雜志，2020，49（9）：934-937.

[19]張繽月.酶聯(lián)免疫吸附法和實時熒光定量PCR 法檢驗 EB 病毒的效果比較[J].中國實驗診斷學(xué)，2022，26（7）：1078-1081.

[20] ALTAF BACHH A，GUPTA R，HAQ I，et al.Diagnosingsputum/smear-negative pulmonary tuberculosis ： does fibre-opticbronchoscopy play a significant role？[J].Lung India，2O10，27（2）：58-62.

[21]虞忻，吳海燕，趙靜，等.支氣管肺泡灌洗液 GeneXpert-MTB/RIF檢測在活動性肺結(jié)核診斷中的效能[J].臨床肺科雜志，2021，26（6）：820-824.

（收稿日期：2024-09-24）（本文編輯：陳韻）