6項呼吸道病原體核酸檢測對兒童早期呼吸道感染的臨床意義分析

兒童呼吸道感染主要由細菌、病毒感染所致，早期癥狀不明顯，且兒童語言表達能力不足，難以準確描述病情，待患兒出現(xiàn)流涕、鼻塞、咳痰、咳嗽，伴乏力、全身酸痛、發(fā)熱等癥狀時，感染已發(fā)展至中晚期，嚴重損害患兒身心健康[-2]。病原體檢測是臨床診斷呼吸道感染的重要手段，但檢測步驟復(fù)雜且耗時較長，常難以快速、準確鑒別出致病病原體，易延誤病情，影響疾病治療效果3-4。呼吸道病原體核酸檢測可同時檢測多種病原體，采樣方式簡單易行，特異度和靈敏度高，適用于多種樣本類型，常應(yīng)用于呼吸道病原體診斷中β-。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）熒光探針法屬于分子生物學(xué)技術(shù)，其原理是將特殊的雙標記熒光探針加入PCR擴增過程中，該探針的一端共價結(jié)合熒光染料分子，另一端共價結(jié)合熒光熄滅器分子，探針含有一段與目標DNA序列特異性配對的序列，當探針與目標序列匹配時，酶促反應(yīng)會使其附加的熒光染料分子和熒光熄滅器分子分開，從而釋放熒光，實現(xiàn)對PCR擴增的檢測，具有較強的特異性，被逐漸應(yīng)用于呼吸道感染病原體的檢測[7-8]?；诖?，本研究旨在分析6項呼吸道病原體核酸檢測對兒童早期呼吸道感染的臨床意義，報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2023年6—12月接診的120例早期呼吸道感染患兒作為研究對象，男性63例，女性57例；年齡3＼～12歲，平均（8.33±1.46） 歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準[倫理審批號：2023醫(yī)輪審第（013）號]。

納入標準：患兒家長簽署知情同意書；經(jīng)呼吸道分泌物病原體培養(yǎng)為陽性；病歷資料完整；年齡3＼～12歲。

排除標準：存在免疫系統(tǒng)疾病者；存在血液系統(tǒng)疾病者；伴有先天性代謝障礙性疾病、遺傳代謝病者；有精神病家族史者；入組前接受抗病毒或抗生素治療者；營養(yǎng)不良者；合并其他感染性疾病者；重要臟器功能存在嚴重障礙者。

1.2 方法

先采集標本，離心管內(nèi)加入 3mL 標本保存液，完成后將采集后的棉拭子加入，充分洗脫，棉拭子充分擠干后丟棄。對標本管充分振搖，確?；旌暇鶆?， ^72h 內(nèi)檢測。用相關(guān)鑒定儀器實施培養(yǎng)和鑒定，鑒定6種呼吸道病原體的類型，包括腺病毒（adenovirus，ADV）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）、SP、RSV、肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）、CMV。用實時熒光定量PCR儀檢測，吸取標本 1.0～1.5mL 置于離心管內(nèi)，離心 5min ，轉(zhuǎn)速為 12000r/min ，將血清棄除，取DNA 50μL 提取液加入沉淀物內(nèi)，充分混合均勻，恒溫（ 100°C） ）處理 10min ，離心5min ，轉(zhuǎn)速為 12000r/min ，備用。分別加入等量DNA提取液至弱陽性質(zhì)控管、強陽性質(zhì)控管和陰性質(zhì)控管內(nèi)，充分混合均勻，恒溫（ 100^°C ）處理10min ，離心 5min ，轉(zhuǎn)速為 12000r/min ，備用。取PCR反應(yīng)管數(shù)個，加入 2μL 處理后的樣品上清液，行數(shù)秒離心操作，轉(zhuǎn)速 8000r/min ，完成后置入儀器樣品槽內(nèi)。按對應(yīng)順序設(shè)置陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、未知標本（含弱陽、強陽性質(zhì)控品），先行10個循環(huán)，條件為 93^°C46s ！ 55^°C 60s ，再進行30個循環(huán)，條件為 、 55^°C 45s ，保存檢測數(shù)據(jù)信息，設(shè)置分析條件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、Threshold值、End值設(shè)定閾值，獲取最佳的標準曲線圖，記錄位置標本數(shù)值（ （Qty） 。質(zhì)量控制：（1）陽性質(zhì)控品。全部陽性，強陽性質(zhì)控品檢測值Qty允許范圍為2.5×10⁶～4.0×10⁷ copies/mL，弱陽性質(zhì)控品檢測值Qty允許范圍為 2.5×10⁴～4.0×10⁶ copies/mL。（2）全部陰性為陰性質(zhì)控品。（3）均為陽性且 0.97? |r|?1 ，為陽性定量參考品。實驗需滿足以上所有要求，否則視為無效，重新操作。判樣品的MPDNA總含量低于檢測極限，Ct值 ⁼³⁰ 或增長曲線不呈S形，評定為陰性；增長曲線呈S形，Ct值 lt;30 ，評定為陽性。

1.3 觀察指標

分析早期呼吸道感染患兒6項病原體檢測情況及混合感染檢出情況，其中同時檢出病原體 ? 2種即為混合感染

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以 表示，行 χ_t 檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，行 χ² 檢驗。 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

6項呼吸道病原體核酸檢測兒童早期呼吸道感染病原體以RSV最為常見，占比 32.50% ，其次為CMV、SP，分別占比 27.50% 、 20.83% ，混合感染16例，占比 13.33% ，具體情況見表1。

3 討論

因兒童免疫力低、易受外界刺激及呼吸系統(tǒng)的解剖特點等，是呼吸道感染疾病的高發(fā)人群。呼吸道感染疾病可通過氣溶膠或接觸發(fā)生傳播，治愈難度較大且感染人群龐大，若不及時治療，隨著病情加重可能會誘發(fā)全身性膿毒血癥感染，增加死亡風(fēng)險，是全球公共衛(wèi)生難題之一[10-。若能早期明確呼吸道感染疾病的病原體，指導(dǎo)臨床治療，可抑制疾病發(fā)展，對改善患者預(yù)后具有關(guān)鍵作用。臨床診斷呼吸道感染病原體方式多樣，以痰培養(yǎng)為“金標準”，但對技術(shù)要求非常高且培養(yǎng)耗時長，易延誤治療。部分急診醫(yī)生可能根據(jù)經(jīng)驗使用抗生素治療，這可能會造成抗生素濫用，增加細菌耐藥性發(fā)生。血清學(xué)技術(shù)診斷有較高的特異度和靈敏度，但需對急性期與恢復(fù)期的血清進行檢測才有診斷意義[12-13]。

病原體核酸檢測與傳統(tǒng)檢測方式相比具有多種優(yōu)勢：（1）兒童年齡小，咳嗽反射弱，樣本體積小且獲取合格的痰液標本難度大，傳統(tǒng)檢測同時檢測多種病原體難度較大。而病原體核酸檢測試劑盒采用多重逆轉(zhuǎn)錄PCR聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳，對核酸用自動核酸提取儀提取，樣品用量需求少，彌補了常規(guī)檢測的不足，且污染風(fēng)險明顯減小，檢測靈敏度明顯提高。（2）靶區(qū)域取病原體的高度保守序列，用病原體的特異性引物實施擴增，且可檢測樣品內(nèi)人DNA和人RNA，監(jiān)控樣品質(zhì)量及整個檢測過程，保證檢測準確性。（3）能夠同時檢出多個病原體，降低檢測成本，減輕患者經(jīng)濟負擔(dān)[4-15]。PCR最大特點是能大幅增加微量的DNA，可以在試管里將待測的目的基因在很短的時間內(nèi)擴增50萬倍乃至上百萬倍，基因診斷的靈敏度明顯增高，降低了檢測分析的難度[6-17]。

隨著PCR技術(shù)不斷發(fā)展，PCR熒光探針法被逐漸應(yīng)用于臨床，利用特異性熒光探針，實行完全閉管式操作，擴增產(chǎn)物污染的概率大大降低了，還可減少實驗步驟、對試劑的消耗、實驗時間，大大提高檢測的特異度和靈敏度，甚至可精確定量擴增物[8]。本研究中，6項呼吸道病原體核酸檢測兒童早期呼吸道感染病原體以RSV最為常見，占比 32.50% ，其次為CMV、SP，分別占比 27.50% 20.83% ，混合感染16例，占比 13.33% ，提示6項呼吸道病原體核酸檢測可準確鑒定兒童早期呼吸道感染的病原體，可明確感染類型，指導(dǎo)后續(xù)治療。PCR熒光探針法主要是結(jié)合了Taqman探針技術(shù)和雙重PCR技術(shù)，利用探針對不同的熒光發(fā)光基因標記，按照不同熒光通道熒光信號改變情況判斷是否存在病原體。而設(shè)計核苷酸探針與PCR擴增引物固定于芯片上，并經(jīng)與針對性擴增受檢樣本的DNA片段雜交，通過芯片掃描儀掃描雜交后的芯片熒光信號，能夠有效獲取病原體信息。PCR熒光探針法相比于核酸序列測定法，能實現(xiàn)絕對定量，且檢測周期短、操作簡便，對操作人員技術(shù)要求相對低，檢測費用相對低廉，使用儀器設(shè)備簡單，可作為鑒別、診斷兒童早期呼吸道感染病原體的常用手段。

綜上所述，6項呼吸道病原體核酸檢測可準確鑒定兒童早期呼吸道感染的病原體，可明確感染類型。

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