血清MP-DNA載量聯(lián)合NK細(xì)胞計數(shù)評估耐藥性肺炎支原體肺炎患兒的免疫特征研究

[摘要] 目的 探討大環(huán)內(nèi)酯類藥物無反應(yīng)性肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）與大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感MPP（macrolide-susceptible MPP，MSMPP）的免疫特征差異，評估血清肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）-DNA載量及NK細(xì)胞計數(shù)在疾病進(jìn)程中的臨床意義。方法 選取2022年8月至2023年8月在杭州市兒童醫(yī)院住院的120例MPP患兒作為研究對象，根據(jù)使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素72h內(nèi)是否有效分為MSMPP組（n=36）和大環(huán)內(nèi)酯類藥物無反應(yīng)性MPP（macrolide-susceptible MPP，MSMPP）組（n=84），比較兩組患兒入院后6h內(nèi)各項指標(biāo)的差異。使用多因素方差分析獨立危險因素，采用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析診斷效能。結(jié)果 CD4⁺T、NK、lgMP-DNA是可預(yù)測MPP患兒是否為MUMPP的獨立危險因素。CD4⁺T、NK、lgMP-DNA、NK+CD4⁺T、lgMP-DNA+CD4⁺T、lgMP-DNA+NK的ROC曲線下面積分別為0.684、0.753、0.728、0.803、0.779、0.813。結(jié)論 外周血NK細(xì)胞減少及高M(jìn)P-DNA載量是耐藥性支原體肺炎的重要臨床特征，聯(lián)合檢測可為后續(xù)診療提供重要臨床價值。

[關(guān)鍵詞] NK細(xì)胞；MP-DNA；CD4⁺T細(xì)胞；肺炎支原體肺炎

[中圖分類號] R725.6" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A""" [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.17.007

Study of serum MP-DNA load combined with NK cell count to evaluate immune characteristics in children with drug-resistant Mycoplasma pneumoniae pneumonia

ZHANG Kaijing¹， HUANG Xiaohui²， YU Xiaojuan¹， CHEN Junsong³

1.Hematology Department， Hangzhou Children’s Hospital， Hangzhou 310005， Zhejiang， China; 2.Special Care Ward，Hangzhou Children’s Hospital， Hangzhou 310005， Zhejiang， China; 3.Department of Respiratory Medicine， Hangzhou Children’s Hospital， Hangzhou 310005， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate immune characteristics of non-responsive macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MPP） and macrolide-susceptible Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MSMPP）， and the clinical significance of serum Mycoplasma pneumonia DNA load and NK cell count in the course of disease were evaluated. Methods A total of 120 MPP patients hospitalized at Hangzhou Children’s Hospital from August 2022 to August 2023 were selected as subjects， they were divided into MSMPP group （n=36） and macrolide-unresponsive MPP （MUMPP） group （n=84） based on whether they were effective within 72h of using macrolide antibiotics. Compare various indicators levels in the first 6 hours after admission between two groups. Multivariate analysis of variance was used for independent risk factors and receiver operating characteristic （ROC） curve analysis was used for diagnostic performance. Results CD4⁺T， NK， and lgMP-DNA were independent risk factors for predicting whether MPP patients were MUMPP. The area under ROC curve for CD4⁺T， NK， lgMP-DNA， NK+CD4⁺T， lgMP-DNA+CD4⁺T， and lgMP-DNA+NK were 0.684， 0.753， 0.728， 0.803， 0.779， and 0.813， respectively. Conclusion Decreased peripheral blood NK cells and high MP-DNA load are important clinical features of drug-resistant Mycoplasma pneumonia， and combined detection can provide important clinical value for subsequent diagnosis and treatment.

[Key words] NK cells; MP-DNA; CD4⁺T cells; Mycoplasma pneumoniae pneumonia

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體之一。MP引起的肺炎通常是一種自限性疾病，主要使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療。隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物的廣泛使用，近幾年臨床上一些MP肺炎（MP pneumonia，MPP）對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性逐漸升高，研究發(fā)現(xiàn)這些對大環(huán)內(nèi)酯類藥物無反應(yīng)性MP（macrolide- unresponsive MPP，MUMPP）與23SrRNA突變高度相關(guān)^[1-2]；MUMPP"" 患者常因耐藥性伴隨更嚴(yán)重的免疫紊亂。有研究報道使用二線藥物如激素、四環(huán)素、氟喹諾酮類等治療MUMPP患者^[3]。雖然MUMPP主要由MP基因突變引起，但其對宿主免疫的影響與臨床預(yù)后相關(guān)^[1]。因此，探究MUMPP的免疫特征對優(yōu)化臨床治療方案（如免疫調(diào)節(jié)劑或二線抗生素的早期聯(lián)用）具有重要意義。淋巴細(xì)胞亞群是檢測人體免疫功能的重要指標(biāo)，其中T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量的減少可能與肺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)，而NK細(xì)胞水平與炎癥感染程度呈負(fù)相關(guān)^[4-5]。T淋巴細(xì)胞可分化為CD4⁺T淋巴細(xì)胞和CD8⁺T淋巴細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)難治性MP肺炎（refractory MPP，RMPP）患者使用激素治療與未使用激素相比臨床癥狀恢復(fù)時間和病程明顯縮短，治療后較治療前的CD4⁺T值升高，CD8⁺T值降低，CD4⁺T/CD8⁺T值升高^[6]。MP感染可引起T淋巴細(xì)胞的過度活化，由此導(dǎo)致的衰竭可能對RMPP的產(chǎn)生起重要作用，表明淋巴細(xì)胞亞群動態(tài)變化與MPP疾病進(jìn)展及預(yù)后具有相關(guān)性^[7-8]。本研究探討治療早期MUMPP與大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感MPP（macrolide-susceptible MPP，MSMPP）的免疫相關(guān)指標(biāo)的區(qū)別，以期對患兒使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物是否敏感進(jìn)行預(yù)測。

1 "對象與方法

1.1" 研究對象

選取2022年8月至2023年8月在杭州市兒童醫(yī)院住院的120例MPP患兒作為研究對象，根據(jù)使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素72h內(nèi)是否有效分為MSMPP組（n=36）和MUMPP組（n=84）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒MP-DNA檢測為陽性；②1歲≤患兒年齡≤11歲； ③符合肺炎X線征象；④咽拭子中甲型、乙型、腺病毒、呼吸道合胞病毒核酸陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他基礎(chǔ)疾病如腫瘤、白血病、唐氏綜合征等；②嚴(yán)重肝腎功能不全者；③2周內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素治療者；④診斷為重癥肺炎者。本研究所有患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。本研究經(jīng)杭州市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)【倫理審批號：（2020）年倫審（臨研）第（17）號】。

1.2" 研究方法

患兒入院后6h內(nèi)抽取靜脈血進(jìn)行檢測。實驗室檢測：使用流式細(xì)胞儀抗阻法測定血清中白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞計數(shù)（neutrophils，N）、淋巴細(xì)胞計數(shù)（lymphocyte，L）、單核細(xì)胞計數(shù)（monocyte，M）、血小板計數(shù)（platelet，PLT）；使用AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）測定血清乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase；LDH）水平；使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）水平，試劑盒（美國貝克曼庫爾特有限公司）；ABI 7500型實時熒光定量PCR基因擴增儀（美國ABI公司）使用熒光探針法檢測MP-DNA水平，試劑盒（中國廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；使用流式細(xì)胞儀檢測患兒血清T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、CD4⁺T淋巴細(xì)胞、CD8⁺T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞水平。

1.3 "統(tǒng)計學(xué)方法

將MP-DNA進(jìn)行對數(shù)化處理為lgMP-DNA，采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q₁，Q₃）]表示，組間比較采用秩和檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ²檢驗。采用Logistic回歸分析影響因素，采用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析診斷價值。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 "兩組患兒的臨床資料比較

MSMPP組患兒的L、PLT、T、CD4⁺T、CD8⁺T、NK細(xì)胞水平高于MUMPP組，lgMP-DNA水平低于MUMPP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2" 多因素Logistic分析

單因素分析結(jié)果表明WBC、L、M、PLT、T、CD4⁺T、CD8⁺T、NK細(xì)胞、lgMP-DNA的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多因素Logistic分析結(jié)果表明CD4⁺T、NK細(xì)胞、lgMP-DNA為獨立危險因素（Plt;0.05）；CD4⁺T、NK細(xì)胞水平越低，MUMPP出現(xiàn)的可能性越高；lgMP-DNA載量越高，MUMPP出現(xiàn)的可能性越高，見表2。

2.3" ROC曲線分析

NK細(xì)胞聯(lián)合CD4?T的ROC曲線下面積為0.803，lgMP-DNA聯(lián)合NK細(xì)胞的ROC曲線下面積為0.813診斷效能顯著提升，見圖1。

3 "討論

Chu等^[9]研究表明與健康對照者相比，MPP患兒的N計數(shù)、CRP、LDH、NK細(xì)胞水平均顯著升高。MUMPP組患兒的T淋巴細(xì)胞、CD4⁺T淋巴細(xì)胞、CD8⁺T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、PLT計數(shù)低于MSMPP組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。血小板主要由巨核細(xì)胞分化成熟產(chǎn)生，巨核細(xì)胞分化成熟過程可刺激T淋巴細(xì)胞活化，血小板計數(shù)降低說明MUMPP可能與CD4⁺T淋巴細(xì)胞、CD8⁺T淋巴細(xì)胞受抑制有關(guān)^[10]。本研究CD8⁺T細(xì)胞無法作為判斷MUMPP的獨立危險因素，有可能因為MUMPP對CD8⁺T的抑制作用不是十分明顯所致。

本研究多因素Logistic分析結(jié)果表明NK細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞和lgMP-DNA可作為判斷MUMPP的獨立危險因素。NK細(xì)胞是天然非特異性免疫淋巴細(xì)胞，對病毒、腫瘤細(xì)胞等均有一定的清除作用^[11]。研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的減少也與乙型流感病毒和新冠病毒相關(guān)肺炎的進(jìn)展呈正相關(guān)^[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對細(xì)菌感染引起的上呼吸道和下呼吸道感染均有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，說明其具有廣譜免疫保護(hù)因子的潛在價值，對MP感染引起的肺部炎癥也有一定的免疫調(diào)節(jié)作用^[14-15]。早期的動物研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞耗竭小鼠感染MP的耐藥性也在增加^[16]；這可能與NK細(xì)胞通過調(diào)控先天免疫反應(yīng)影響MP感染的宿主防御有關(guān)，但這一機制缺乏臨床證據(jù)支持。本研究中NK細(xì)胞減少可能通過削弱免疫清除能力，加劇耐藥菌株的免疫逃逸。

MP感染可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化^[7]，而在動物研究中發(fā)現(xiàn)CD4⁺T細(xì)胞可減輕MP感染引起的炎癥反應(yīng)^[17]。本研究結(jié)果表明隨著CD4⁺T細(xì)胞的減少，MPP患者進(jìn)展為MUMPP患者的概率也在增加。NK細(xì)胞和CD4⁺T細(xì)胞水平均為MSMPP進(jìn)展為MUMPP的獨立危險因素，可能是因為MUMPP患者對自身NK細(xì)胞和CD4⁺T細(xì)胞的消耗更加迅速，這也說明使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療后MUMPP與MSMPP患者體內(nèi)的免疫指標(biāo)具有一定差異性。

研究表明下呼吸道灌洗液中的MP-DNA載量與MPP嚴(yán)重程度呈正相關(guān)^[18]。Fang等^[19]的研究發(fā)現(xiàn)MPP肺泡灌洗液的MP-DNA載量高于咽拭子，但兩者的倍數(shù)具有正相關(guān)性。Lin等^[20]對6例RMPP的研究發(fā)現(xiàn)咽拭子的MP-DNA載量與臨床癥狀和療效呈正相關(guān)，說明上呼吸道咽拭子的MP-DNA效價可能與MPP感染的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，lgMP-DNA可作為MPP是否進(jìn)展為重型MPP的獨立危險因素^[21]。

研究表明使用糖皮質(zhì)激素對RMPP發(fā)熱時間和住院時間的縮短具有積極正面影響^[1]。研究表明使用糖皮質(zhì)激素+大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療的MUMPP患者住院平均天數(shù)、持續(xù)高熱比例均低于單純使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物患兒^[3]；MUMPP和RMPP患者及早使用二線藥物有積極正面效應(yīng)。Li等^[22]的研究發(fā)現(xiàn)RMPP患兒的T淋巴細(xì)胞、CD4⁺T、B細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)值低于普通MPP且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明RMPP對整個淋巴免疫細(xì)胞均有明顯的抑制作用，這與本研究結(jié)果類似。

本研究CD4⁺T、NK、lgMP-DNA、lgMP-DNA+ CD4⁺T的ROC曲線下面積均低于0.8，診斷價值并不高。NK+CD4⁺T、lgMP-DNA+NK的ROC曲線下面積為0.803、0.813，但lgMP-DNA+ NK的ROC曲線的特異性和敏感度的綜合水平高于NK+CD4⁺T。本研究中MSMPP患兒數(shù)量低于MUMPP，這可能與近幾年大環(huán)內(nèi)酯類抗生素使用頻繁導(dǎo)致耐藥性有關(guān)，但也不能排除部分輕癥或MSMPP患者在門診使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物后病情好轉(zhuǎn)并未住院治療。

本研究存在一定局限性。本研究未納入RMPP患者。綜上，MP感染后使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物是否敏感可能與NK淋巴細(xì)胞水平和MP-DNA效價有關(guān)。因此lgMP-DNA+NK的聯(lián)合診斷對判斷MPP是否進(jìn)展為MUMPP具有較高的診斷價值。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1]"" LENG M， YANG J， ZHOU J. The molecular characteristics， diagnosis， and treatment of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae in children[J]. Front Pediatr， 2023， 11： 1115009.

[2]"" WANG N， XU X， XIAO L， et al. Novel mechanisms of macrolide resistance revealed by in vitro selection and genome analysis in Mycoplasma pneumoniae[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2023， 13： 1186017.

[3]"" HAN H Y， PARK K C， YANG E A， et al. Macrolide-resistant and macrolide-sensitive Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children treated using early corticosteroids[J]. J Clin Med， 2021， 10（6）： 1309.

[4]"" BIAN L Q， BI Y， ZHOU S W， et al. T cell responses in senior patients with community-acquired pneumonia related to disease severity[J]. Exp Cell Res， 2017， 361（1）： 56–62.

[5]"" HEINONEN S， RODRIGUEZ-FERNANDEZ R， DIAZ A， et al. Infant immune response to respiratory viral infections[J]. Immunol Allergy Clin North Am， 2019， 39（3）： 361–376.

[6]"" LV J， FAN F. Efficacy of methylprednisolone plus azithromycin in the treatment of RMPP and its effect on the changes of T lymphocyte subsets[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2022 ， 2022： 1833195.

[7]"" GUO L， LIU F， LU M P， et al. Increased T cell activation in BALF from children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J]. Pediatr Pulmonol， 2015， 50（8）： 814–819.

[8]"" CHEN X， LIU F， ZHENG B， et al. Exhausted and apoptotic BALF T cells in proinflammatory airway milieu at acute phase of severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children[J]. Front Immunol， 2021， 12： 760488.

[9]"" CHU C， LEI X， LI Y， et al. High expression of miR-222-3p in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J]. Ital J Pediatr， 2019， 45（1）： 163.

[10] DUNLOCK V E， ARP A B， SINGH S P， et al. Tetraspanin CD53 controls T cell immunity through regulation of CD45RO stability， mobility， and function[J]. Cell Rep， 2022， 39（13）： 111006.

[11] LIN S J， YAN D C， LEE W I， et al. Effect of azithromycin on natural killer cell function[J]. Int Immunopharmacol， 2012， 13（1）： 8–14.

[12] JIANG Y， WEI X， GUAN J， et al. COVID-19 pneumonia： CD8+T and NK cells are decreased in number but compensatory increased in cytotoxic potential[J]. Clin Immunol， 2020， 218： 108516.

[13] MA L， YAN J， SONG W， et al. Early peripheral blood lymphocyte subsets and cytokines in predicting the severity of influenza B virus pneumonia in children[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2023， 13： 1173362.

[14] ZWIRNER N W， DOMAICA C I， FUERTES M B. Regulatory functions of NK cells during infections and cancer[J]. J Leukocyte Biol， 2021， 109（1）： 185–194.

[15] THERESINE M， PATIL N D， ZIMMER J. Airway natural killer cells and bacteria in health and disease[J]. Front Immunol， 2020， 11： 585048.

[16] BODHANKAR S， WOOLARD M D， SUN X， et al. NK cells interfere with the generation of resistance against Mycoplasma respiratory infection following nasal-pulmonary immunization[J]. J Immunol， 2009， 183（4）： 2622–2631.

[17] ODEH A N， SIMECKA J W. Regulatory CD4+TCD25+ T cells dampen inflammatory disease in murine Mycoplasma pneumonia and promote IL-17 and IFN-γ responses[J]. PLoS One， 2016， 11（5）： e0155648.

[18] LIU J， ZHAN F， LU J， et al. High Mycoplasma pneumoniae loads and persistent long-term Mycoplasma pneumoniae DNA in lower airway associated with severity of pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J]. BMC Infect Dis， 2019， 19（1）： 1045.