川南地區(qū)RHDV2的流行病學(xué)調(diào)查

兔出血癥病毒II型（RHDV2）自2010年在歐洲暴發(fā)后迅速擴散至全球，其高變異的VP60基因?qū)е聜鹘y(tǒng)疫苗保護力下降。我國自2020年四川首次報道RHDV2以來，該病毒已在12個省份流行，但缺乏對養(yǎng)殖密集區(qū)的系統(tǒng)研究。川南地區(qū)家兔年出欄量占全省 40% 以上，近年因RHDV2暴發(fā)遭受重大經(jīng)濟損失。現(xiàn)有研究多聚焦病毒分離鑒定，對流行株分子特征及重組風(fēng)險評估不足。本研究通過分子檢測與基因組分析，旨在闡明川南地區(qū)RHDV2的時空分布規(guī)律、遺傳進化特征及重組動態(tài)，為優(yōu)化區(qū)域防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1研究背景

1.1RHDV2的病原學(xué)特征

兔出血癥病毒I型（Rabbit haemonhagic diseasevirus type2，RHDV2）屬于杯狀病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus），其基因組為單股正鏈RNA，全長7437～7453個核苷酸。病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約 135～40mm ，在氯化銫中的浮密度為 1.33～1.36g/cm³ ?；蚪M包含兩個開放閱讀框ORF1和ORF2，其中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-7和主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60，ORF2編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP10（Lavazzaetal.，2015）。VP60蛋白包含三個主要抗原決定簇（A、B、C區(qū)），其中B區(qū)的變異直接影響病毒與宿主細胞受體的結(jié)合能力（Wangetal.，2015）。

1.2國內(nèi)外流行現(xiàn)狀

RHDV2自2010年在法國首次分離鑒定以來，其全球流行版圖持續(xù)擴張。分子流行病學(xué)監(jiān)測顯示，截至2023年該病毒已形成4個主要基因亞型（GI.2a-d），其中GI.2a型在歐洲占比達 82.6% ，澳大利亞則以GI.2b型為主。我國自2020年四川SC2020毒株（MT586027）首報以來，通過全基因組測序技術(shù)已在12個省份鑒定出RHDV2流行株，其VP60基因與歐洲株GER-NW（LR899189）同源性為 95.46% ，而全基因組同源性降至 87.93%

1.3研究必要性

川南地區(qū)是我國重要的家兔養(yǎng)殖基地，年出欄量占全省 40% 以上。RHDV2的出現(xiàn)對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)兔業(yè)構(gòu)成嚴重威脅。目前，國內(nèi)對RHDV2的研究主要集中在病毒分離鑒定和部分基因特征分析，缺乏系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)。此外，病毒在自然傳播過程中的重組發(fā)生風(fēng)險尚未得到充分評估。因此，開展川南地區(qū)RHDV2流行病學(xué)調(diào)查，明確流行毒株分子特征和遺傳進化關(guān)系，對制定科學(xué)防控策略具有重要意義[。

2研究方法

2.1樣本采集與處理

本研究于2023年1月—2024年6月期間，在川南地區(qū)（含自貢、瀘州、宜賓、內(nèi)江4市）開展系統(tǒng)性樣本采集。采用分層隨機抽樣法，選取32個存欄量 ≥800 只的規(guī)?；脠黾?5個存欄量 ≤80 只的散養(yǎng)戶，覆蓋區(qū)域養(yǎng)殖密度梯度。樣本類型包括。

第一，急性死亡病例肝臟組織：通過無菌解剖采集右肝葉中部組織，單樣本濕重 ≥8g

第二，亞急性病例血清：耳中央動脈采血 4mL 只，使用真空采血管37 C 靜置 40min 后， 3500×_i 離心 20min （Centrifuge 5424R）;

第三，環(huán)境生物樣本：含籠具表面大小為1 5cm×15cm 采樣區(qū)、自動飲水器出水口及飼料傳送帶刮取物，采用植絨拭子（COPAN154C）浸人3mL病毒運輸液[2]。

2.2實驗室檢測技術(shù)

第一，血凝試驗（HA）：嚴格參照NY/T572-2023標(biāo)準(zhǔn)，采用 1% 人O型紅細胞懸液進行檢測。紅細胞經(jīng)PBS洗滌4次，最終濃度為 1% 。樣本肝組織勻漿液經(jīng)梯度稀釋1：2至1：2048后與紅細胞懸液等體積混合， 37^°C 靜置1h判讀結(jié)果。效價≥1：16判定為陽性，靈敏度較傳統(tǒng)方法提升3～5倍。

第二，RT-PCR檢測：病毒RNA提取采用TIANampVirusRNAKit，裂解液AVL緩沖液與樣本體積比1：5，結(jié)合硅膠膜吸附純化離心力12 000×g ， 1min 。引物設(shè)計基于RHDVVP60基因保守區(qū)（GenBank：FJ794180），擴增產(chǎn)物長度240bp 。反應(yīng)體系優(yōu)化為： 2×TaqPCR Mix（含 Mg²⁺3mM ）12.5μL ，引物終濃度 0.4μM ，模板RNA3 μL 擴增程序設(shè)置退火溫度 57.6‰ ，確保引物Tm值匹配RHDV-F： 58.3‰ RHDV-R： 57.8 ℃[3]。

2.3基因組分析與生物信息學(xué)

全基因組擴增采用分段擴增策略，基于SC2020/0401參考序列設(shè)計4對特異性引物（表1），引物設(shè)計參數(shù)：Tm值 58±2°C ，GC含量 45%～60% ，產(chǎn)物重疊區(qū) ≥30bp. PCR反應(yīng)體系含 2× BlendTaqMasterMix（東洋紡）、 物各1 μL ，模板cDNA3 μL ，擴增條件為：95℃預(yù)變性5min ；35個循環(huán)；終延伸72 ^c10min_? 。擴增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證后，使用pMD19-T載體（Takara）克隆，每個片段雙向測序3次（IlluminaNovaSeq6000，PE150），測序覆蓋深度 ≥100× ，序列一致性 gt;99.9% 。

表1全基因組擴增引物信息

3結(jié)果與討論

3.1流行病學(xué)特征

第一，時空分布特征。

研究顯示川南地區(qū)RHDV2的流行呈現(xiàn)顯著時空異質(zhì)性。時間維度上，2024年1～6月病毒核酸陽性率 68.2% 較2023年同期 59.1% 增長 15.4% 絕對增幅 9.1% ，表明病毒傳播強度持續(xù)上升。值得注意的是，陽性率在2023年冬季12月至2024年2月達峰值 73.5% ，可能與低溫環(huán)境下病毒穩(wěn)定性增強及兔群免疫力下降有關(guān)?？臻g分布上，宜賓市陽性率高達72.3% （ 95%CI 68.4%～76.1% ），瀘州市為 65.8% （ 95%CI 61.2%～70.1% ），顯著高于自貢 58.4% 和內(nèi)江 $5 3 . 9 ＼% _ { ＼textmd { 0 } _ { ＼textparallel } }$

第二，養(yǎng)殖模式與感染風(fēng)險

不同養(yǎng)殖模式的流行病學(xué)差異顯著 x²=36.52 ， Plt;0.001 。規(guī)?；脠鲫栃月?51.6% 較散養(yǎng)戶 78.9% 降低 34.6% ，驗證了生物安全措施的關(guān)鍵作用。實施全封閉管理空氣過濾系統(tǒng) + 人員單向流動的兔場陽性率僅 39.2% ，而未封閉兔場達67.4% 。散養(yǎng)戶中，飼料儲存區(qū)與養(yǎng)殖區(qū)未物理隔離的農(nóng)戶陽性率高達 85.6% ，而采取分區(qū)管理的農(nóng)戶陽性率降至64.3% 。值得注意的是，使用自動飲水系統(tǒng)的規(guī)模化兔場，其飲水管刮取物陽性率 9.8% 僅為散養(yǎng)戶水槽樣本 34.5% 的28.4% ，表明設(shè)備自動化可顯著減少環(huán)境病毒載量。此外，每月開展 22 次環(huán)境消毒的養(yǎng)殖單元，其籠具表面病毒檢出率較未規(guī)范消毒單元降低 42.7% （ P=0.003 ）。

第三，病毒載量與病理關(guān)聯(lián)。

急性死亡病例肝臟組織病毒載量達 10?7.3±0.4 4拷貝 ∣μL 范圍： 10～6.8～10～8.1 ，較亞急性病例 10?5.2±0.^? 拷貝 μ L提升2個數(shù)量級t=18.36， Plt;0.001 。載量水平與病理損傷評分0～5分制呈強正相關(guān) ∵0.832 ， Plt;0.001 ：載量≥10^7拷貝 μL 的病例中， 87.5% 出現(xiàn)肝細胞廣泛壞死評分≥4，而載量 拷貝 /μI 者僅 12.9% 表現(xiàn)中度損傷評分-2。進一步回歸分析顯示，病毒載量每增加1個log值，肝臟出血面積擴大23.6%

3.2分子特征分析

獲得12株RHDV2完整基因組序列，與國內(nèi)外毒株比較顯示。

第一，VP60基因同源性：與國內(nèi)SC2020/0401毒株同源性 98.91% ，與歐洲代表株GER-NW同源性 95.46% 。

第二，非結(jié)構(gòu)蛋白基因同源性：與SC2020/0401同源性僅 84.46% ，出現(xiàn)顯著差異。

表2代表性毒株基因組同源性比較 （%）

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，川南分離株在RHDV1和RHDV2進化樹中形成獨立分支。重組分析確認一例重組事件，斷點位于5266bp（ORF1區(qū)），主要親本為RHDV1/Triptis，次要親本為RHDV2/SC2020/0401（MT586027）。該重組毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白基因主要來源于RHDV1，而結(jié)構(gòu)蛋白基因保持RHDV2特征4。

3.3防控啟示

本研究揭示川南地區(qū)RHDV2流行特征顯示，規(guī)?；脠鲫栃月?51.6% 顯著低于散養(yǎng)戶 78.9% ，提示加強生物安全措施如封閉管理、定期消毒可有效阻斷病毒傳播。病毒載量與病理損傷呈強正相關(guān)，建議養(yǎng)殖場對急性病例肝臟樣本開展早期分子檢測以實現(xiàn)精準(zhǔn)剔除。重組毒株的出現(xiàn)表明需警惕RHDV1與RHDV2的基因重組風(fēng)險，應(yīng)建立全基因組監(jiān)測體系，針對性優(yōu)化疫苗設(shè)計。

結(jié)語

本研究系統(tǒng)揭示了川南地區(qū)RHDV2的流行病學(xué)特征與分子進化規(guī)律，證實該病毒流行強度呈上升趨勢，且存在RHDV1-RHDV2重組事件。重組毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白基因溯源提示歷史毒株可能參與新發(fā)變異，凸顯長期監(jiān)測的重要性。研究結(jié)果為精準(zhǔn)防控提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持：需針對VP60B區(qū)抗原變異設(shè)計疫苗，強化規(guī)?；B(yǎng)殖場生物安全管理，并建立環(huán)境病毒消控技術(shù)體系。未來應(yīng)深入探究重組機制對病毒適應(yīng)性的影響，評估跨物種傳播風(fēng)險，同時結(jié)合人工智能模型預(yù)測流行趨勢，為家兔產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)建多重防控屏障。

參考文獻：

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收稿日期：2025-04-28

作者簡介：劉杰（1997—），男，漢族，碩士研究生，助理工程師。研究方向：流行病學(xué)。