弼猴桃軟腐鏈格孢菌（Alternariaalternata）的鑒定與防治

關(guān)鍵詞鏈格孢菌；軟腐；獼猴桃；防治中圖分類號S436.634.1文獻標(biāo)識碼A文章編號 0517-6611（2025）13-0135-05doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.13.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Identification and Control of Kiwifruit Decay Caused by Alternaria alternata

LI Yu-jing12， PANG Min² ，DU Xiao-tian2 et al（1. College of Biologyand Food Engineering， Chongqing Three Gorges University， Chongqing4040;2.ColgeofSartAgriculture，ChongingUniversityofArtsamp;ciences/IstituteofSpecialPlants，Congig46） AbstractObectie]Tidentifytepathogensofpostharvestdecaofiwifruitandsreeneectivefungicides.Metod]Tepuriication， morphologyadidentificatiotexteardut，ndocaotst，lateondtroestesueul] AfungalstrainasolatedfrotespotedeisofiwifruitnddentifedaAltarialtee.Teioulatioeperintsowdtat the fungus was a cause agent of kiwifruit. Plate inhibition test showed that the EC₅₀ values of 43% Lunason （ 21.5% fluopyramide ⁺²¹ 5% 0xime ester），Cuibei （ 50% ether ester）， 80% Ethylicin（allicin homolog），Chlorothalonil（ 75% tetrachloro-isophenonitrile）was 0.000 177 0 ， 0.005 534 0，0.006 3460，0.031 7856 μg/mL，respectively. 43% Lunason had an obviously significant antibacterial effect，followed by Cuibei and 80% Ethylicin. The results of fruit control test showed that the relative control effects of 43% Lunason and 80% Ethylicin was 88.89% and 85.17% ，respectively.[ Conclusion]The results ofthis studyshowed that the four fungicides have inhibitory efects onA.alternate from kiwifruit，and suggested that 43% Lunason and 80% Ethylicin should be used to control pathogen from flowering stage to early stage of kiwifruit development，so as to reduce postharvest disease and fungal infection in kiwifruit development.

KeyWordsAlternaria alternata;Decay;Kiwifruit;Control

弼猴桃營養(yǎng)價值豐富， v_c 含量遠高于一般的水果，具有“水果之王”\" v_c 之王\"等稱號[1]。弼猴桃原產(chǎn)于中國，屬于獼猴桃科弼猴桃屬，其果實不僅可以直接食用，還能加工成果汁、果脯、果干等食品[2]，其功效多種，如抗氧化能力強、延緩衰老、增強免疫力等。然而隨著弼猴桃栽培面積的逐漸擴大，采后病害的危害度也越來越強[3]

弼猴桃采后病害易造成大量果實腐爛，給弼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。弼猴桃軟腐主要癥狀是在果皮上形成褐色圓形或橢圓形的病斑，隨著病程的加劇，病斑邊緣呈水漬狀，病斑內(nèi)部的果肉乳化、軟腐，弼猴桃軟腐病病原菌主要包括葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）鏈格孢菌（Alterna-riaalternate）可可毛色二孢菌（Lasiodiplodiatheobromae）等病原[4]。此外，細極鏈格孢（A.tenuissima）為獼猴桃褐斑的病原菌，出尖頭炭疽菌（Colletotrichumacutatum）和圍小叢殼（Glomerella cingulata）被證實為獼猴桃炭疽病的病原菌[5] C

鏈格孢菌除作為弼猴桃軟腐病的病原菌外，還會引起弼猴桃黑斑病[6]、橄欖黑斑病[7]新疆的棗果黑斑病[8]、‘滁菊'黑斑病等[9]。研究表明化學(xué)農(nóng)藥異菌脲和己唑醇對鏈格孢菌引起的黑斑病具有較好的防效效果；苯甲嘧菌酯對引發(fā)細綠萍黑腐病的細極鏈格孢菌絲抑制性較強[10]

已發(fā)現(xiàn)露娜森對忙果采后炭疽病[]、黃瓜靶斑病[12]等多種病害有突出的防治效果；翠貝常用來防治葡萄白粉病等[13];乙蒜素能有效抑制玉米葉斑病、水稻稻瘟病、棉花立枯病等[14]；百菌清殺菌性廣泛，能用來防治多種植物病害[15] 。

弼猴桃采后貯藏過程中，因果實表面共生微生物，特別是病斑弼猴桃易發(fā)生軟腐。筆者對采后病斑弼猴桃進行病原的分離、鑒定，并使用4種常見農(nóng)藥露娜森、翠貝、乙蒜素、百菌清進行平板抑制、果實防效試驗，旨在篩選出對弼猴桃采后病害防治效果較好的低毒農(nóng)藥。

1材料與方法

1.1試驗材料供試植物：成熟弼猴桃海沃德于2022 年采集于重慶市永川區(qū)教奎弼猴桃公園。

供試培養(yǎng)基：配制PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基，100g 馬鈴薯濾液，葡萄糖 10g ，瓊脂粉 12g，pH7.0～7.2 ，121^°C 高壓蒸汽滅菌 20min ，備用。

供試殺菌劑： 43% 的露娜森（ 21.5% 氟吡菌酰胺 +21.5% 肟菌酯）（SC）（PD20152429），翠貝（ 50% 的醚菌酯）（SC）（PD20142114）， 80% 的乙蒜素（大蒜素同基物）（EC）（PD20101285），百菌清（ 75% 的四氯間苯二晴）（WP）（PD20090352）。

1.2 試驗方法

1.2.1致病菌的分離與鑒定。將采摘的病斑弼猴桃果實清洗、晾干，用無菌水清洗 2min ，重復(fù)3次， 2% 的次氯酸鈉溶液浸泡 2min ，無菌水清洗3次，每次清洗 3min ，最后置于濾紙上晾干，用清潔鑷子夾取病癥組織接種于PDA培養(yǎng)基，置于25^°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，每天觀察其菌落的形態(tài)、顏色，后根據(jù)其菌落的形態(tài)將其進行分離純化連續(xù)3代，貼好標(biāo)簽及編號后放人 -80^°C 冰箱內(nèi)保存。

運用CTAB法提取真菌基因組，以ITSI（ 5^′ -TCCGTAGG-TAACCTGCGG- 3^′ ）、ITS4（ 5^′ -TCCTCCGCTTAT- TGATATGC -3^′ ）分別為上下游引物，利用PCR擴增技術(shù)擴增病原菌ITS核酸片段，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。擴增引物送往北京擎科生物科技股份有限公司進行基因測序，將測得的序列信息與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)分離物序列通過Blast進行進一步對比分析，相似性大于 99% 的序列下載并用ClustalW進行比對[16]，用MEGA5.0軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹[17]

1.2.2鏈格孢菌的致病性檢驗。鑒定的鏈格孢經(jīng)PDA25^°C 培養(yǎng)5d后，加入 2mL 無菌水，用藥匙刮取菌絲，無菌紗布過濾掉，濾液經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)，梯度稀釋法將孢子濃度稀釋到 10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ spores/mL，待用。弼猴桃果實采摘后，選取重量約 70g 果實，經(jīng) 75% 乙醇消毒 2min.2% 的次氯酸鈉溶液浸泡 2min ，再用無菌水清洗3次，每次清洗3min ，自然晾干。在每個獼猴桃橫徑周圍的適當(dāng)位置均勻戳3個直徑 2～3mm 、深度 4～5mm 的圓形小孔，待小孔內(nèi)的液體基本干燥后用移液槍分別吸取 10μL 上述準(zhǔn)備的孢子接種到小孔中，無菌蒸餾水作為對照，每個處理10個弼猴桃，重復(fù)3次，將準(zhǔn)備好的弼猴桃在 25^°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15d，每天觀察小孔中菌落的生長情況，并觀察弼猴桃病癥。1.2.3鏈格孢菌的平板抑制試驗。4種常用化學(xué)農(nóng)藥為有效成分 43% 露娜森（ 21.5% 氟吡菌酰胺 +21.5% 肟菌酯）翠貝（ 50% 醚菌酯） 80% 乙蒜素（大蒜素同基物）、百菌清（ 75% 四氯間苯二腈）4 種農(nóng)藥。 43% 露娜森的5種濃度為0.191、0.383、0.765、1.530、3.06μg/mL;50% 翠貝的5種濃度為 0.063，0.125，0.250，0.500，1.000μg/mL; 80% 乙蒜素的5種濃度為 百菌清的5種濃度為 0.4，0.8，1.6，3.2，6.4，μg/mL_c 。分別將其各濃度農(nóng)藥與滅菌后的PDA培養(yǎng)基混合均勻，制備PDA固體培養(yǎng)基，待完全冷卻后，用真菌打孔器（ 10mm ）打孔，然后接種 100μL 孢子濃度為 10⁶ spores/mL的鏈格孢菌孢子懸浮液到培養(yǎng)基上，連續(xù)觀察5d，十字交叉法測量菌落直徑并計算抑制率。

菌絲生長抑制率 Σ=Σ （對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對 照菌落直徑-菌餅直徑） ×100%

運用NORMSINV函數(shù)將抑制率轉(zhuǎn)變?yōu)楦怕手?，將各農(nóng)藥濃度梯度轉(zhuǎn)換成的對數(shù)值與概率值分別作為橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)，得到獨立回歸方程 ，進而計算出各農(nóng)藥的EC₅₀ 值。

1.2.4鏈格孢菌防效試驗。弼猴桃采摘后將其分為5組，每組12個弼猴桃，編號空白對照組、酵母對照組、孢子侵染組（侵染濃度為 10⁷ spores/mL）露娜森防效組、乙蒜素防效組。各組弼猴桃經(jīng)清水清洗，乙醇、次氯酸鈉消毒后自然晾干。然后在其橫徑用 10μL 槍頭打孔，為直徑 2～3mm 深度4～5mm 的圓形小孔，防效組弼猴桃，分別用露娜森0.25μg/mL 乙蒜素 0.2μg/mL 浸泡 2min 后晾干待用；酵母（ 10⁷ spores/mL）無菌水作為對照組，空白對照組，各組弼猴桃分別用移液槍吸取 10μL10⁷ spores/mL孢子懸浮液，分別注射到各組弼猴桃的小孔中，待稍干燥后置于 25^°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d，觀察各濃度、各小孔的菌落生長情況，并做好記錄，通過計算其病情指數(shù)和防治效果來判斷露娜森和乙蒜素對鏈格孢的防效。

發(fā)病率 Σ=Σ 發(fā)病個數(shù)/總數(shù) ?×100% 病情指數(shù) （感病株數(shù) × 該級代表值）/（調(diào)查總株數(shù) × 最高級代表值）

弼猴桃的病癥分級：0級，無腐爛；1級，病斑面積 ?1/4 整個弼猴桃面積；2級，病斑面積 ?1/2 整個弼猴桃面積；3級，病斑面積 ?3/4 整個弼猴桃面積;4級，病斑面積 ? 整個弼猴桃面積。

相對防效 Σ=Σ （對照平均病情指數(shù)-處理平均病情指數(shù)）/對照平均病情指數(shù)×100%[18-19]

2 結(jié)果與分析

2.1致病菌的分離與鑒定對病斑的弼猴桃果實進行分離、純化、培養(yǎng)，根據(jù)其菌落的形態(tài)、顏色，分離真菌9株。其中經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，表面暗褐色，圓形菌落，疏松菌絲，反面呈黑色。顯微鏡下觀察其分生孢子，倒棍棒形，有橫、縱隔膜（圖1）。將分離物ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行對比分析，結(jié)果顯示，供試株的ITS序列與鏈格孢菌屬的同源性高達 99% ，下載鏈格孢菌屬的鏈格孢菌（Alternariaalternat）與鐮刀菌（Fusariumgraminearum）的ITS序列，利用MEGA5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），結(jié)合菌落形態(tài)和ITS序列分析，確定此菌株為鏈格孢屬（A. alternat）

2.2鏈格孢的致病性檢測通過回接試驗，鏈格孢菌孢子侵染弼猴桃果15d后，孢子懸浮液濃度為 10⁴，10⁵，10⁶ 、10⁷ spores/mL均能使果實發(fā)病，隨孢子濃度的增加，病癥越明顯，果實表面白色菌絲的面積越大，軟腐病狀越明顯，果實病變處略凹陷且?guī)в谢疑“撸▓D3）。為了更好地呈現(xiàn)試驗效果，后續(xù)試驗選取最高濃度 10⁷ spores/mL進行試驗。

2.3鏈格孢菌的平板抑菌試驗4種農(nóng)藥對鏈格孢菌菌落生長抑制見圖4。通過5d的平板抑制試驗，第5天露娜森組的平均直徑為 0.99cm ，翠貝組平均直徑為 2.88cm ，乙蒜素組的平均直徑為 1.73cm ，百菌清組平均直徑為 2.63cm 對照組平均直徑為 5.83cm ，農(nóng)藥組與對照組抑制效果顯著（ Plt;0.001） 。 43% 露娜森（ 21.5% 氟吡菌酰胺 +21.5% 肟菌酯）、翠貝（ 50% 醚菌酯） 80% 乙蒜素（大蒜素同基物）、百菌清（ 75% 四氯間苯二腈）4種農(nóng)藥的 EC₅₀ 分別為 0.000 177 、 0.005534、0.006346、0.0317856μg/mL（表1）。取露娜森、乙蒜素進行后續(xù)防效試驗。

2.4乙蒜素與露娜森對鏈格孢菌的防效通過 15d 的防效試驗結(jié)果表明，空白組弼猴桃果實因衰老、失水出現(xiàn)軟化，但在其頂端出現(xiàn)少量病征（圖5A）；酵母接種組也出現(xiàn)軟化，接種位置出現(xiàn)少量菌絲（圖5B）；接種孢子濃度為10⁷ spores/mL的弼猴桃出現(xiàn)腐爛，表面出現(xiàn)大量白色菌絲（圖5C）；經(jīng)過乙蒜素農(nóng)藥浸泡處理，接種鏈格孢菌（A.alter-nate）的弼猴桃因衰老同樣軟化，表面有白色菌絲（圖5D）；經(jīng)過露娜森農(nóng)藥浸泡處理再接種鏈格孢的弼猴桃因衰老軟腐（圖5E）。 10⁷ spores/mL鏈格孢孢子懸浮液處理的病情指數(shù)為56.25，乙蒜素浸泡處理接種的病情指數(shù)為8.33，相對防治效果為 85.17% ；露娜森浸泡處理的病情指數(shù)為6.25，相對防治效果為 88.89% 。表明露娜森、乙蒜素對鏈格孢菌引起的弼猴桃軟腐病均有防效，且2種農(nóng)藥的防效無顯著差異（表2）。

3結(jié)論與討論

致病菌的分離與鑒定是病害防治中的重要環(huán)節(jié)。該研究從病斑弼猴桃果實中分離、鑒定了一株鏈格孢菌（A.alter-nate），引起采后弼猴桃果實軟腐，弼猴桃表面出現(xiàn)白色菌絲，其病癥與Auger等[20]研究結(jié)果一致。

目前弼猴桃真菌病害的防控仍主要依賴于化學(xué)防治，該試驗采用的4種農(nóng)藥均為低毒農(nóng)藥，乙蒜素作為植物仿生農(nóng)藥，大蒜素的乙基同系物，無公害且易被吸收、降解，是我國先開發(fā)研制的綠色廣譜仿生殺菌劑之一[14]。露娜森主要由21.5% 氟吡菌酰胺 +21.5% 肟菌酯2種有效成分復(fù)配組成，除有優(yōu)秀的防病功能外，還能提高果實品質(zhì)、延長采收期[21]。白菌清的主要成分為四氯間苯二晴，屬于高效廣譜、低毒殺菌劑，易在植物表面黏著，常用于防治多種真菌病害。翠貝即醚菌酯，綠色環(huán)保且因其新型作用方式與常規(guī)各類殺菌劑無交互抗性，能防治蘋果葉斑病、梨黑斑病等。前人研究發(fā)現(xiàn)乙蒜素、百菌清在防治弼猴桃細菌性潰瘍病上的效果良好[22-24]，翠貝對獼猴桃灰霉病、褐斑病有優(yōu)秀的防治效果[25]，露娜森在弼猴桃病害上的應(yīng)用較少。

該研究結(jié)果表明，4種農(nóng)藥均可抑制鏈格孢孢子的生長速率，露娜森與乙蒜素可明顯抑制孢子在弼猴桃果實的萌發(fā)。由于鏈格孢菌等病菌孢子在早春弼猴桃花期開始侵染，提前在弼猴桃花期至果實發(fā)育前期使用露娜森和乙蒜素進行防治。弼猴桃果實真菌病害的防治，應(yīng)及時清理病果病葉，配合化學(xué)防治方法，適量使用農(nóng)藥，綜合治理[26]。該研究結(jié)果為弼猴桃果實軟腐病防治提供了一定理論依據(jù)

參考文獻

[1]石浩，王仁才，王，等.弼猴桃采后病害植物源殺菌劑的篩選及其抑菌效果分析[J].經(jīng)濟林研究，2020，38（1）：75-82.

[2]李華麗，魏仲珊，鄧萍，等.獼猴桃的營養(yǎng)價值及其加工應(yīng)用[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019（1）：119-122

[3]石金巧，龍友華，黎曉茜，等.貴長弼猴桃軟腐病病原菌分離鑒定及其植物源殺菌劑室內(nèi)篩選[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，34（3）：331-337.

[4]謝紅輝.鏈格孢屬部分種的分類研究現(xiàn)狀[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2012（4） ：28-33.

[5]USHIYAMAK，AONON，KITAN，etal.Firstreport ofPestalotia disease，anthracnose and angular leaf spot of kiwifruit and their pathogens in Japan[J].Japanese journal of phytopathology，1996，62（1） ：61-68.

[6]肖蓉，石浩，卜范文，等.弼侯桃病害防治研究進展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021（8） ：116-120.

[7]邵雪花，楊永璐，賴多，等.橄欖黑斑病病原菌的分離鑒定及防治藥劑篩選[J].核農(nóng)學(xué)報，2024，38（1）：68-75.

[8]張雨萌，鄒強，牛新湘，等.棗果黑斑病病原菌的分離鑒定[C]//中國植物病理學(xué)會.中國植物病理學(xué)會2023年學(xué)術(shù)年會論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2023：293.

[9]詹慶玲，屠涵舒，王夢琪，等.‘滁菊'葉部病害病原菌鑒定與化學(xué)防治[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2024，47（3）：443-452.

[10]木扎帕爾·吐魯洪，烏漢夫，侯雨，等.細綠萍黑腐病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性和防治藥劑篩選[J].草地學(xué)報，2023，31（12）：3651-3660.

[11]葉子，蘇初連，孫宇，等.露娜森和拿敵穩(wěn)對芒果采后炭疽病的防治效果[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報，2022，12（7）：21-25.

[12]南宇航，劉劍輝，李巖.露娜森對黃瓜靶斑病的田間藥效試驗[J].中國林副特產(chǎn)，2016（4）：35-36.

[13]楊慧蓮.翠貝防治葡萄白粉病試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)村科技，2015（3）：51.

[14]古崇.乙蒜素[J].湖南農(nóng)業(yè)，2011（1）：25.

[15]支繼紅，冀敏.黃瓜枯萎病藥劑防治效果試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)村科技，2023（9） ：80-81.

[16]HUANG K，TANG JM，ZOUY，etal. Whole genome sequence of Alternariaalternata，thecausalagentofblackspotofkiwifruit[J].Frontiersinmicrobiology，2021，12：1-13.

[17]劉丹，李煥宇，付婷婷，等.基于正交試驗設(shè)計優(yōu)化真菌DNA提取的CTAB法[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017，52（2）：139-145.

[18]魏曉兵，付俊范，李自博，等.不同生物殺菌劑對人參灰霉病的室內(nèi)毒力及田間防效[J].植物保護，2015，41（5）：217-220，236.

[19]胡容平，石軍，林立金，等.弼候桃潰瘍病高效防治藥劑的篩選及田間應(yīng)用評價[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2020，36（6）：112-116.

[20]AUGER J，PEREZ I，ESTERIO M.Diaporthe ambigua associated withpost-harvest fruit rot of kiwifruit in Chile[J].Plant disease，2O13，97（6）：843.

[21]白粉病防治專家—露娜森簡介[J].四川農(nóng)業(yè)科技，2016（5）：72.

[22]王瑞，雷霽卿，查仕連，等.二十種生物源殺菌劑對三株弼猴桃潰瘍病病原菌的毒力測定[J].北方園藝，2018（21）：54-59.

[23]李文靜，任立瑞，方文生，等.乙蒜素和嘧菌酯及其復(fù)配劑對4種病原真菌的室內(nèi)毒力測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（21）：113-118.

[24]王瑞，雷霽卿，查仕連，等.3株弼猴桃細菌性潰瘍病致病菌的藥劑室內(nèi)毒力比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：141-143.

[25]胡妍月，孫楊，郭明程，等.8種藥劑對弼猴桃灰霉病和褐斑病的防治效果評價[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021（4）：82-85.

[26]劉曉馳，馮新，路喻丹，等.弼猴桃軟腐病發(fā)生與防治技術(shù)研究進展[J].東南園藝，2022，10（3）：213-219