基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討穿心蓮改善心肌缺血再灌注損傷的潛在作用機(jī)制

摘要目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討穿心蓮改善心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制。方法：應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）篩選出穿心蓮的有效成分和作用靶點(diǎn)，采用UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)注釋靶點(diǎn)基因；利用人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、DisGeNET、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）獲得MIRI的靶點(diǎn);運(yùn)用Venn在線軟件獲取穿心蓮與MIRI的共同靶點(diǎn)基因，并以Venn圖展示；采用CytosCape3.9.1軟件構(gòu)建“藥物-藥物有效成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖；應(yīng)用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析；通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)將交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，利用Cytoscape3.9.1軟件Cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過(guò)AutoDockTools1.5.7軟件與PyMol2.5.0對(duì)篩選后的6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白受體和藥物活性成分配體進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果：篩選得到穿心蓮的36個(gè)有效活性成分和172個(gè)靶點(diǎn)基因，MIRI相關(guān)靶點(diǎn)基因1466個(gè)，49個(gè)藥物與疾病交集靶點(diǎn)；獲得關(guān)鍵核心靶點(diǎn)有α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL6）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、一氧化氮合酶（NOS3）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53），其主要參與一氧化氮生物合成、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；KEGG通路富集分析顯示主要作用機(jī)制可能與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號(hào)通路、EB病毒感染和白細(xì)胞介素（IL）-17信號(hào)通路等有關(guān)。結(jié)論：穿心蓮對(duì)MIRI的干預(yù)作用具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多環(huán)節(jié)的調(diào)控特點(diǎn)，其調(diào)控靶點(diǎn)可能主要涉及AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3和TP53等；其調(diào)控的通路可能涉及氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞生存和凋亡相關(guān)信號(hào)通路等，這為后續(xù)深入探討穿心蓮改善MIRI的潛在分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

AbstractObjectivehepotentiatargetsandmechanismsofandrographispaniculatainimprovingmyocardialishemieperfusioninjuy （MIRI）wereexploredbynetworkpharmacologyandmolecularlinkagetechniques.Methods：Theactiveingredientsandtargetsitesof andrographispaniculatawerescreenedoutusingthePharmacologyDatabaseandAnalysisPlatformforTradionalChineseMedicine System（TCMSP）.Thetarget genes wereannotatedusingthe UniPortdatabase.Thetargetsof MIRlwereobtainedbythe HumanGene Database（GeneCards），iseNET，herapeuticTrgetatabase（TD），andtheOnlineHumanendelianGeneticDatabase（O）.e commontargetgenesofandrographispaniculataandMIRlwereobtainedbytheVennonlinesoftwareandpresentedasVennplots.The visualizationnetworkdiagramofdrugdrugactiveingredientargetwasonstructedbyusingCytosape3.9.1softare.TeAotation， VisuaizationandComprehensiveDiscoveryDatabase（DAVID）wasapliedtoconductgeneontology（GO）classicationenrichment analysisandKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）pathwayenrichmentanalysisontheintersectiontargets.Protein interaction（PPl）analysisofthintersectiontargetswasconductedtroughtheSTIGdatabase，andthePlnetworkwasanalyzed usingtheCytoubbapluginofCytosape3.9.1softaretoobtainthekeytargets.Themoleculardockingverficationofthesreeedsix keytargetproteinreceptorsanddrugactivedistributorswasconductedthroughAutoockTools1.5.7softwareandPyMol2.5esults： Thirtysixeftiectimpontsdrgtgesofdgasicataeeddg166atedat genesand49druganddiseaseintersectiontargets.ThekeycoretargetswerebtainedincludingAKT1，F(xiàn)，IL6，CASP3，N，and TP53，whichweremainlyinvolvedinbologicalproessessuchasnitricoxidebiosynthesis，lipopolysaccharide-mediatedsignal transduction，apoptosis，geneexpresionandinflammatoryresponse.KEGGpathwayenrichmentanalysisrevealedthatthemain mechanismsofactionrelatedtolipidsandatherosclerosis，thephosphatidylinositol3-kinasePl3K）proteinkinaseB（AKT）signaling pathway，theadvancedglycationendproduct（AGE）advancedglycationendproductreceptor（RAGE）signalingpathwayindiabetic coplicatiit paniculataonMiRlshows theregulatory characteristics of multiple components，multiple targets，multiple pathwaysand multiple links.Its regulatorytargetsmainlyinvolves L6，CASP3，NOS3，and TP53，etc.Its regulates pathwaysmay involves oxidative stressand inflammation-relatedsignaling pathwa survival andapoptosis-related signalingpathways，etc.Thiswillprovide foundation for the subsequentin-depth explorationof the potentialmolecularmechanism relatedandrographis paniculata improving MIRl.

Keywordsmyocardialischemia/reperfusioninjuryandrographispaniculata;networkphamacolgymacromoleculardcking；mcani

急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）是一種危及生命的心血管疾病。自2002年以來(lái)，我國(guó)AMI死亡率總體呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)，且自2012年開(kāi)始農(nóng)村地區(qū)AMI死亡率明顯升高，2020年城市地區(qū)AMI死亡率為60.29/10萬(wàn)，農(nóng)村地區(qū)AMI死亡率為78.65/10萬(wàn)。AMI伴心肌缺血再灌注損傷（myocardialischemiareperfusioninjury，MIRI）進(jìn)一步加重心臟功能的障礙，增加了AMI的不良預(yù)后。MIRI的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，主要涉及多種病理生理因素，如氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、鈣超載、內(nèi)皮功能障礙、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)等[23]。即使目前已對(duì)MIRI機(jī)制的理解有了較大進(jìn)展，但臨床防治效果仍不容樂(lè)觀。因此，探索其分子機(jī)制以尋求減輕或避免MIRI的策略或?qū)⒊蔀樾碌奶魬?zhàn)。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥（traditional Chinese medicine，TCM）在改善MIRI方面取得了一定的進(jìn)展[46]。TCM區(qū)別于西藥，具有多靶點(diǎn)、多通路、多環(huán)節(jié)和整體觀念的治療優(yōu)勢(shì)。穿心蓮，作為一種重要的草本植物，廣泛應(yīng)用于中國(guó)、印度以及多個(gè)東南亞國(guó)家的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中。研究表明，穿心蓮具有抗炎性反應(yīng)、抗氧化、降血脂、降血糖、保肝、保腎、抗瘧疾、抗過(guò)敏和保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理作用[78]。研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮在治療MIRI方面可能具有一定的保護(hù)作用9，但更深入的分子機(jī)制研究甚少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從整體性和系統(tǒng)性方面對(duì)藥物、疾病之間相互關(guān)系進(jìn)行全面分析的一門新興學(xué)科。本研究擬在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基礎(chǔ)上采用分子對(duì)接技術(shù)，進(jìn)一步探討穿心蓮在抗MIRI方面的具體分子作用機(jī)制，以期為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供新思路。

1資料與方法

1.1藥物有效成分及其靶點(diǎn)獲取

本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems PharmacologyDatabase andAnalysisPlatform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索“穿心蓮\"以收集該草本藥的相關(guān)信息，限定口服利用度（ .OB）≥30% 和類藥性（DL）≥18% 篩選有效成分并通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相應(yīng)化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)[10]。滿足篩選條件但是未能在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相應(yīng)作用靶點(diǎn)的化合物，搜索其CAS號(hào)并輸入PubChem數(shù) 據(jù)庫(kù)[1]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以 獲取其CanonicalSMILES 號(hào)。通過(guò) Swiss Target Prediction平臺(tái)[12]（http：//www.swisstargetprediction.ch），物種選擇為“Homosapiens”，將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)取Probability gt;0 作為補(bǔ)充。此外，在此基礎(chǔ)上使用中醫(yī)百科全書（The EncyclopediaofTraditional ChineseMedicine，ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/）數(shù)據(jù)庫(kù)[13]以及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行再次補(bǔ)充，取評(píng)分 0.490.67 為Good的成分，最后僅保留可靠性分值 gt; 0.8的靶標(biāo)。應(yīng)用UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)[14]（https：//www.uniprot.org），以物種為人類且為已驗(yàn)證的基因作為篩選條件，對(duì)預(yù)測(cè)的藥物靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正，統(tǒng)一為GeneSymbol。

1.2疾病靶點(diǎn)收集

以“myocardial ischemiareperfusion injury”為檢索詞，通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)[15]（GeneCards，https：/www.genecards.org/）和在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)[16]（OMIM，https：//www.omim.org/）進(jìn)行檢索，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)所得數(shù)據(jù)以Relevancescore ≥8 為篩選條件。同時(shí)以“myocardial reperfusion injury\"為檢索詞，采用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)[17]（https：//www.disgenet.org/）、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[18]（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）進(jìn)行補(bǔ)充檢索，其中DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)所得數(shù)據(jù)以Score_gda ?0.5 為篩選條件。上述結(jié)果匯總后刪除重復(fù)項(xiàng)，獲得MIRI的基因靶點(diǎn)。

1.3篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)及繪制Venn圖

將穿心蓮和MIRI相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，利用Venn在線軟件繪制韋恩圖，確定穿心蓮和MIRI的交集靶點(diǎn)作為穿心蓮抗MIRI的可能潛在靶點(diǎn)。

1.4藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物、有效成分和靶點(diǎn)導(dǎo)人Cytoscape3.9.1[19]中構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)\"可視化處理獲得初步網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用NetworkAnalyzer工具，計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度（Degree）值。其中，節(jié)點(diǎn)代表著藥物、化合物或靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的連接代表其存在相互作用，節(jié)點(diǎn)的Degree值代表節(jié)點(diǎn)之間相連的數(shù)目。

1.5蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將獲取的交集靶點(diǎn)輸人STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[20]（https：//cn.string-db.org/），篩選條件為物種“Homosapiens”，最低相互作用得分 ?0.4 ，去除在網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)的節(jié)點(diǎn)；以TSV格式導(dǎo)出相應(yīng)結(jié)果，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小、顏色與Degree值成正比。運(yùn)用Cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選分析，分別以最大團(tuán)中心性（MCC）、緊密中心性（Closeness）、度（Degree）值、中介中心性（Betweenness）應(yīng)力中心性（Stress）計(jì)算前20個(gè)核心基因，再次利用Venn在線軟件取其交集，獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)。鑒于在Cytohubba中指標(biāo)MCC的可信度更好[21]，因此將獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)按照MCC降序排列，最終選取出相互關(guān)系最密切的靶點(diǎn)作為穿心蓮抗MIRI的潛在核心關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科 全 書（kyoto encyclopedia ofgenesandgenomes，KEGG）富集分析

通過(guò)運(yùn)用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）[22]和微生信可視化平臺(tái)（https：//www.bioinformatics.com.cn），本研究對(duì)穿心蓮和MIRI的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。利用DAVID平臺(tái)，導(dǎo)入穿心蓮與MIRI的共同靶點(diǎn)，并進(jìn)行相應(yīng)參數(shù)設(shè)置，即Thresholds設(shè)定為Count：3，EASE：0.05為篩選條件，分別將GO生物過(guò)程（biologicalprocesses，BP）細(xì)胞組成（cellularcomponents，CC）、分子功能（molecularfunctions，MF）和KEGG通路進(jìn)行富集分析。利用微生信網(wǎng)站，選取 Plt;0.05 的條目分別制作GO三合一柱狀圖和KEGG富集氣泡圖，探討穿心蓮抗MIRI相關(guān)生物學(xué)過(guò)程和關(guān)鍵信號(hào)通路。

1.7靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在KEGG的基礎(chǔ)上，通過(guò)使用Cytoscape3.9.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)Degree值進(jìn)行排序，找出富集在上述通路上的穿心蓮改善MIRI的潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)，最終構(gòu)建“靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.8分子對(duì)接驗(yàn)證

經(jīng)有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)[11]（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的有效成分并下載其sdf格式的三維結(jié)構(gòu)，使用Chem3D20.0軟件將sdf格式處理后轉(zhuǎn)化為mol2格式文件，同時(shí)應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)[23]（PDB，http：//www.rcsb.org）搜索關(guān)鍵靶點(diǎn)并下載其三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)PyMOL2.5.0和AutoDockTools1.5.7軟件對(duì)受體和配體進(jìn)行相應(yīng)處理，輸出pdbqt格式，借助AutoDockVina對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接[24]。將分子對(duì)接數(shù)據(jù)導(dǎo)入PyMOL2.5.0軟件進(jìn)行可視化展示。

2結(jié)果

2.1藥物活性成分及其靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)收集到36個(gè) 藥物活性成分。獲取相應(yīng)化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，匯總后 去除重復(fù)值，穿心蓮有效活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因共計(jì) 172個(gè)。詳見(jiàn)表1。

2.2穿心蓮活性成分與MIRI交集基因的分析 2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的選取

通過(guò)GeneCards、OMIM、DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)得到MIRI靶點(diǎn)基因1466個(gè)。將172個(gè)藥物靶點(diǎn)與1466個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集得到交集靶點(diǎn)49個(gè)，即穿心蓮抗MIRI的潛在靶點(diǎn)。詳見(jiàn)圖1。

2.3“藥物-有效成分-靶點(diǎn)\"網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Cytoscape3.9.1軟件，構(gòu)建穿心蓮抗MIRI的藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)包括209個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中菱形代表的是穿心蓮藥物，周圍正方形代表的是藥物有效成分PubChemCID，外圍圓形代表基因靶點(diǎn)），572條邊，根據(jù)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree值，排序后發(fā)現(xiàn)穿心蓮中最主要的10個(gè)活性化合物依次為：panicolin、1-monoolein、wogonin、mono-O-methylwightin、14-deoxy-11-oxoandrographolide、oroxylina、deoxycamptothecine、14-deoxyandrographolide、andrographidineF_qt、carvacrol。詳見(jiàn)圖2。

將獲取的交集靶點(diǎn)導(dǎo)人STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，保存STRING數(shù)據(jù)庫(kù)生成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖以及每條邊代表蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用（見(jiàn)圖3）。將輸出的TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見(jiàn)圖4，用于后續(xù)核心靶點(diǎn)的篩選。網(wǎng)絡(luò)中顯示表明連線越多，關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)，PPI網(wǎng)絡(luò)中交集靶點(diǎn)的排名越靠前。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPI網(wǎng)絡(luò)中包含49個(gè)節(jié)點(diǎn) .1002 條邊。利用Cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，分別設(shè)置MCC、Closeness、Degree值、Betweenness和Stress（見(jiàn)表2），計(jì)算前20個(gè)核心基因并繪制韋恩圖（見(jiàn)圖5），得到15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，按照MCC降序排列（見(jiàn)表3），依次為 α -絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL6）、雌激素受體（ESR1）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、纖維連接蛋白（FN1）、熱休克蛋白 90-α （HSP90AA1）半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、一氧化氮合酶（NOS3）、清蛋白（ALB）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、白細(xì)胞介素-1β（IL1B）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白-D1（CCND1）。在PPI網(wǎng)絡(luò)中將15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)創(chuàng)建子集以構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖6），該網(wǎng)絡(luò)中有15個(gè)節(jié)點(diǎn)、105條邊。按照最大團(tuán)中心性降序從紅到黃漸變。顏色越紅，意味著其在最大團(tuán)中心性中排名越靠前。排名最前的為AKT1，排名最末為CCND1。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

將49個(gè)穿心蓮活性成分與MIRI的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得GO功能分析及KEGG通路分析結(jié)果。

GO-BP富集分析顯示其可能通過(guò)調(diào)控以下生物過(guò)程，包括正向調(diào)控一氧化氮生物合成過(guò)程（positiveregulationofnitricoxidebiosyntheticprocess）、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑（lipopolysaccharide-mediatedsignalingpathway）、凋亡過(guò)程的正向調(diào)控（positiveregulationofapoptoticprocess）、凋亡過(guò)程的負(fù)向調(diào)控（negativeregulationofapoptoticprocess）、基因表達(dá)的負(fù)向調(diào)控（negative regulation of gene expression）、炎癥反應(yīng)（inflammatoryresponse）、血管生成（angiogenesis）、蛋白激酶B信號(hào)傳導(dǎo)（proteinkinaseBsignaling）、蛋白激酶B信號(hào)傳導(dǎo)的正向調(diào)控（positiveregulationofproteinkinaseBsignaling）、自噬的負(fù)向調(diào)控（negative regulationof autophagy）。

GO-CC富集分析顯示其主要參與以下細(xì)胞組分的構(gòu)成，包括巨大分子復(fù)合物（macromolecularcomplex）、線粒體（mitochondrion）、細(xì)胞溶質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmicreticulum）、細(xì)胞核（nucleus）、細(xì)胞核周圍區(qū)域（perinuclearregionofcytoplasm）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmicreticulumlumen）、胞外區(qū)域（extracellularregion）、細(xì)胞核質(zhì)（nucleoplasm）。

GO-MF富集分析顯示其分子功能主要包括酶結(jié)合（enzymebinding）、相同蛋白質(zhì)結(jié)合（identicalproteinbinding）、蛋白激酶結(jié)合（proteinkinasebinding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitinprotein ligasebinding）、蛋白酶結(jié)合（proteasebinding）、RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄因子活性、通過(guò)配體激活的序列特異性DNA結(jié)合（RNApolymeraseItranscriptionfactor activity，ligand-activatedsequence-specificDNAbinding）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（proteinserine/threonine/tyrosinekinaseactivity）、蛋白激酶活性（proteinkinaseactivity）、蛋白質(zhì)結(jié)合（proteinbinding）、類固醇結(jié)合（steroidbinding）。詳見(jiàn)圖7。

KEGG通路富集分析（見(jiàn)圖8）顯示其可能通過(guò)參與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（lipidandatherosclerosis）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路（PI3K-AKTsignalingpathway）、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號(hào)通路（AGE-RAGE signalingpathway indiabeticcomplications）、EB病毒感染（epstein-barrvirusinfection）、白細(xì)胞介素（IL）-17信號(hào)通路（IL-17signalingpathway）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（fluidshearstressandatherosclerosis）、NOD樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）、凋亡（apoptosis）、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路（TNFsignalingpathway）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路（MAPKsignalingpathway）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗性（EGFRtyrosinekinaseinhibitorresistance）、p53信號(hào)通路（p53signalingpathway）、胰島素抵抗（insulinresistance）、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路（HIF-1signalingpathway）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路（VEGF signalingpathway）、Toll樣受體信號(hào)通路（TollHike receptor signaling pathway）、核因子-kB（NF- κκB ）信號(hào)通路（NFkappaBsignalingpathway）、Janus激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）信號(hào)通路（JAK-STATsignalingpathway）、趨化因子信號(hào)通路（chemokine signalingpathway）、血小板活化（plateletactivation）為主要調(diào)控作用途徑。

2.6靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于KEGG通路富集分析結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)靶點(diǎn)-通路之間的關(guān)系進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖9）。其中Degree值較高的依次是AKT1、NFKB1、TNF、BCL2、IL6、MAPK14、IL1B、CASP3、NOS3、CXCL8等共35個(gè)，主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、EB病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、調(diào)亡、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗性、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等20個(gè)信號(hào)通路。

2.7分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果分析

一般而言，配體分子與受體蛋白間結(jié)合能愈小則表示二者結(jié)合親和力愈強(qiáng)，結(jié)構(gòu)也愈穩(wěn)定。本研究將PPI核心網(wǎng)絡(luò)中排名前15位的靶點(diǎn)與靶點(diǎn)-通路之間構(gòu)建的靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖中排名前15位的靶點(diǎn)取交集，獲得共同靶點(diǎn)6個(gè)進(jìn)行分子對(duì)接，即通過(guò)對(duì)AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3、TP53與及其相應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接。詳見(jiàn)表4。

2.7.1 活性成分與AKT1相互作用分析

wogonin、panicolin與AKT1對(duì)接結(jié)果表明，2種活性成分和AKT1均存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，結(jié)合能力為panicolingt;wogonin。潛在的結(jié)合位點(diǎn)主要有THR-87、ARG-15、GLU-17和ARG-48。其中，panicolin可與氨基酸形成4個(gè)氫鍵，化合物與蛋白口袋結(jié)合能力相對(duì)較佳。詳見(jiàn)圖10。

2.7.2活性成分與TNF相互作用分析 14-deoxyandrographolide、dehydroandrographolide、wogonin、 14-deoxy-11-oxoandrographolide、 3-dehydrodeoxyandrographolide14-deoxy-15Hsopropylidene-11

與TNF對(duì)接結(jié)果表明，6種化合物和TNF均存在較好的結(jié)合作用，結(jié)合能力為Wogonin gt; 14-deoxy-15-Isopropylidene-11gt;3-dehydrodeoxyandrographolidegt;14-deoxyandrographolidegt;dehydroandrographolidegt;14-deoxy-11-oxoandrographolide。潛在的結(jié)合位點(diǎn)主要有GLN-47、ALN-46、ALA-145、ASN-92、GLN-149、PRO-139、GLY-24、LEU-142、PHE-144、TYR-141、SER-95 和 ASN-92。 其 中 wogonin、14-deoxy-11-oxoandrographolide與TNF受體形成氫鍵相對(duì)較多，說(shuō)明該化合物與蛋白結(jié)合口袋結(jié)合相對(duì)較強(qiáng)。詳見(jiàn)圖11。

2.7.3 活性成分與IL6相互作用分析

wogonin、oroxylina、14-deoxy-11-oxoandrographolide、14-deoxyandrographolide、dehydroandrographolide與IL6對(duì)接結(jié)果表明，此5種活性成分與IL6均存在較好的結(jié)合作用，結(jié)合能力為wogoningt;oroxylinagt;dehydroandrographolidegt;14-deoxyandrographolidegt;14-deoxy-11-oxoandrographolide。潛在的結(jié)合位點(diǎn)主要有LYS-47、GLN-157、ARG-105、LEU-93、ASN-45、THR-139、ALA-59、LYS-67、SER-170、ASN-65、LEU-63、LEU-65。5種化合物均可與氨基酸形成至少2個(gè)氫鍵。其中wogonin與IL6受體的活性殘基形成4個(gè)氫鍵，說(shuō)明該化合物與蛋白結(jié)合口袋結(jié)合相對(duì)較強(qiáng)。詳見(jiàn)圖12。

2.7.4活性成分與CASP3相互作用分析

wogonin、oroxylina與CASP3對(duì)接結(jié)果表明，2種穿心蓮有效成分和CASP3均存在較強(qiáng)的結(jié)合作用。潛在的結(jié)合位點(diǎn)主要有MET-61、ASN-208和ASP-45。wogonin和oroxylina分別與CASP3受體的活性殘基形成1個(gè)氫鍵和2個(gè)氫鍵。詳見(jiàn)圖13。

2.7.5 活性成分與NOS3相互作用分析

deoxycamptothecine、quercetintetramethyl ^{3′，4′，5，7）} ether與NOS3對(duì)接結(jié)果表明，2種活性成分和NOS3均存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，結(jié)合能力為deoxycamptothecinegt;quercetin tetramethyl （3^′，4^′，5，7） ether。潛在的結(jié)合位點(diǎn)主要有TYR-475和TRP-178。2種穿心蓮活性成分均與氨基酸形成1個(gè)氫鍵。詳見(jiàn)圖14。

（A為wogonin與 IL6;B為oroxylina與 IL6;C為14-deoxy-11-oxoandrographolide與IL6; D為14-deoxyandrographolide與 IL6; E為dehydroandrographolide與 IL6）

[A為deoxycamptothecine與NOS3;B為quercetintetramethyl （3^′，4^′，5，7 Dether與NOS3]

2.7.6活性成分與TP53相互作用分析wogonin與TP53對(duì)接結(jié)果表明，wogonin和TP53

存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，潛在的結(jié)合位點(diǎn)主要有ASN-345。

wogonin與氨基酸形成2個(gè)氫鍵。詳見(jiàn)圖15。

3討論

MIRI可降低AMI治療效果及加重脈管病變程度，也是引起惡性心律失常或心源性猝死及預(yù)后的重要因素。防治MIRI尚缺少有效的藥物和方法，AMI并發(fā)MIRI的死亡率依然較高[25]。穿心蓮是一種十分重要的中藥材。目前，僅有穿心蓮少部分活性成分報(bào)道對(duì)MIRI可能有抑制作用[9.26]，并且涉及分子機(jī)制甚少。

本研究綜合多數(shù)據(jù)庫(kù)資料，匯集了穿心蓮的有效成分、靶點(diǎn)及MIRI相關(guān)靶點(diǎn)。交集分析揭示了49個(gè)穿心蓮與MIRI共有靶點(diǎn)。在GO分析中，共同靶點(diǎn)主要涉及一氧化氮生物合成、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)亡、基因表達(dá)等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程。在CC和MF方面，這些靶點(diǎn)在巨大分子復(fù)合物、線粒體、細(xì)胞質(zhì)等方面以及酶結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合活性方面表現(xiàn)出核心基因的富集。這些分析揭示，穿心蓮可能通過(guò)參與上述生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路改善MIRI。KEGG分析識(shí)別了20個(gè)高度富集的信號(hào)通路，表明核心靶點(diǎn)基因的作用不局限于單一信號(hào)通路。例如，AKT1被發(fā)現(xiàn)參與脂質(zhì)代謝、PI3K-AKT信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等11種關(guān)鍵通路，這突顯了穿心蓮靶點(diǎn)不僅通過(guò)單一途徑作用于MIRI，而是通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路的相互作用形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。

基于功能相關(guān)性將KEGG富集通路結(jié)果分為以下五大類：1）氧化應(yīng)激和炎癥的信號(hào)通路，包括AGE-RAGE、TNF和MAPK等信號(hào)通路。AGE-RAGE的激活誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥，且與MIRI的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[27]。TNF信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激在MIRI中發(fā)揮核心作用[28]。MAPK信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和炎癥反應(yīng)，并在MIRI的調(diào)控中扮演關(guān)鍵角色，其中p38MAPK的抑制能增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)，改善 M||R|^[29] 。另有研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮活性成分穿心蓮內(nèi)酯可改善MIRI，其機(jī)制可能與降低p38-MAPK，升高p-ERK1/2蛋白表達(dá)，進(jìn)而增加心肌抗氧化能力相關(guān)[30]；此研究發(fā)現(xiàn)和本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)一致。2）細(xì)胞生存和凋亡相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K-AKT信號(hào)通路、調(diào)亡、P53信號(hào)通路等。PI3K-AKT信號(hào)通路在MIRI中起保護(hù)作用，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控炎癥響應(yīng)來(lái)維持心肌細(xì)胞的存活[31-32]。此外，PI3K-AKT還能調(diào)控p53等腫瘤抑制基因，進(jìn)一步影響細(xì)胞凋亡過(guò)程[33]。3）血管和血小板相關(guān)信號(hào)通路，主要包括VEGF和趨化因子信號(hào)通路。VEGF通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新血管生成，并與PI3K-AKT等信號(hào)通路相互作用[34]。趨化因子通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的遷移，對(duì)MIRI的恢復(fù)過(guò)程產(chǎn)生影響[35]。4）代謝和能量調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如胰島素抵抗。胰島素抵抗可通過(guò)增加氧化應(yīng)激和促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并影響心肌細(xì)胞的保護(hù)途徑而導(dǎo)致MIRI的發(fā)病和嚴(yán)重程度增加[36]5）其他病理過(guò)程，如IL-17信號(hào)通路，通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌重塑，從而加重MIRI的程度[37]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮抗MIRI作用涉及多條信號(hào)通路，包括氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞生存與凋亡等，顯示了其作用的復(fù)雜性與多維性。

為實(shí)現(xiàn)穿心蓮活性成分與這些靶點(diǎn)具有較高的結(jié)合活性，并且在相關(guān)信號(hào)通路上仍保持較高的富集，本研究經(jīng)多次篩選而獲取靶標(biāo)。將獲得49個(gè)藥物和疾病的共有靶點(diǎn)，利用Cytohubba插件設(shè)置參數(shù)，運(yùn)用PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析得到的15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與靶點(diǎn)-通路之間構(gòu)建的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖中排名前15位的靶點(diǎn)取交集，最終得到6個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，以期作為穿心蓮抗MIRI的潛在的靶標(biāo)。這6個(gè)潛在的靶點(diǎn)分別是AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3、TP53。在心肌組織中，AKT1發(fā)揮調(diào)控心肌細(xì)胞活性和功能的重要作用。通過(guò)對(duì)下游因子的調(diào)控，AKT1不僅參與細(xì)胞增殖、凋亡和自噬等關(guān)鍵過(guò)程，而且在減輕MIRI中具有重要作用[38-39]。另一方面，AKT1通過(guò)調(diào)控下游的VEGF等因子，有益于血管生成，亦引起肌漿網(wǎng) Ca²⁺ 通道開(kāi)放明顯增加，這使MIRI中 Ca²⁺ 超載的狀態(tài)顯著減輕[35.40]。TNF、IL6是MIRI進(jìn)程中關(guān)鍵的促炎因子，可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞進(jìn)入心肌缺血損傷區(qū)[5]。而促炎因子TNF、IL6血清含量的降低，顯著減輕了心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)的發(fā)生[41]。在TNF信號(hào)通路上，CASP3作為半胱天冬酶家族的重要成員，活化的CASP3進(jìn)一步切割和激活其他蛋白質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡，并在細(xì)胞凋亡的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[42]，而心肌細(xì)胞凋亡在MIRI病理過(guò)程中起重要作用，抑制半胱天冬酶家族的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕再灌注損傷[3]。NOS3主要分布在冠狀動(dòng)脈血管和心腔面的內(nèi)膜，研究發(fā)現(xiàn)，NOS3的過(guò)表達(dá)有益于改善 M∣R∣^[43] ，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和鈣超載有關(guān)。TP53，也稱為p53蛋白，是一種經(jīng)典的腫瘤抑制基因。p53通過(guò)多種機(jī)制參與MIRI，主要涉及細(xì)胞凋亡，自噬，鐵死亡和氧化應(yīng)激等[33]。本研究分析表明，穿心蓮可能通過(guò)調(diào)控AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3和TP53改善MIRI。

在6個(gè)關(guān)鍵核心靶標(biāo)的基礎(chǔ)上，對(duì)穿心蓮抗MIRI的有效成分進(jìn)一步進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個(gè)關(guān)鍵活性成分與AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3、TP53對(duì)接結(jié)合能都 lt;-20.90kJ/mol ，活性成分均存在一定數(shù)量的氫鍵受體供體，這說(shuō)明10個(gè)關(guān)鍵有效成分與以上相應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白具有較好的結(jié)合活性，推測(cè)穿心蓮有效成分可能通過(guò)這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

作為一門新興學(xué)科，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接的研究，可能在中藥研究中實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。然而本研究也存在一定的不足，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先，本研究的相關(guān)靶點(diǎn)來(lái)自TCMSP、ETCM、GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)。由于每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的側(cè)重點(diǎn)稍有不同，數(shù)據(jù)庫(kù)之間也存在一定的差異。因此，多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)之間的聯(lián)合分析不排除可能存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。其次，本研究使用了分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，這對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果的可靠性提供了一定程度的依據(jù)，但更進(jìn)一步精確的驗(yàn)證，仍需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)完成，這將是下一步研究的重點(diǎn)。

4小結(jié)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，揭示了穿心蓮在抗MIRI過(guò)程中對(duì)一氧化氮生物合成、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)亡、基因表達(dá)等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮可能通過(guò)影響氧化應(yīng)激和炎癥、細(xì)胞生存和凋亡等信號(hào)通路參與MIRI調(diào)控，顯示出復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。這些信號(hào)通路與靶點(diǎn)基因的相互作用可能共同促進(jìn)MIRI的防治效果。AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3和TP53這6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)可能構(gòu)成穿心蓮抗MIRI作用的核心。Wogonin、14-deoxy-11-oxoandrographolide、 oroxylinA、dehydroandrographolide和deoxycamptothecine等成分可能是穿心蓮抗MIRI主要活性物質(zhì)，為進(jìn)一步研究提供了新方向。

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（本文編輯鄒麗）