超聲引導(dǎo)下導(dǎo)絲損傷主動脈瓣誘導(dǎo)鈣化性主動脈瓣狹窄大鼠動物模型研究

摘要目的：探討直接機械損傷對大鼠主動脈瓣的影響。方法：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組、輕度模型組、中度模型組、重度模型組，每組10只。在超聲引導(dǎo)下，將導(dǎo)絲經(jīng)右頸總動脈置入SD大鼠左心室，造成主動脈瓣損傷。通過超聲檢測各組大鼠左室心功能和主動脈瓣狹窄情況；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察瓣膜厚度變化；茜素紅染色檢測瓣膜鈣鹽沉積情況；免疫組織化學(xué)染色方法檢測各組標(biāo)本中巨噬細(xì)胞、骨橋蛋白（OPN）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性細(xì)胞表達(dá)情況；蛋白免疫印跡法（WestemBlot）檢測各組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）表達(dá)情況。結(jié)果：造模8周后，輕度模型組、中度模型組、重度模型組左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）左室短軸縮短率（LVFS）和主動脈瓣有效瓣口面積（AVA）降低，主動脈瓣峰值流速、主動脈瓣跨瓣壓力梯度（AVPG）增加，以重度模型組最為明顯（ Plt;0.05 ）。與假手術(shù)相比，輕度模型組、中度模型組、重度模型組大鼠主動脈瓣膜增厚，鈣鹽沉積增多， CD₆₈ 浸潤增多，OPN和 α -SMA陽性細(xì)胞表達(dá)增多，BMP2蛋白表達(dá)增多，其中以重度模型組變化最為顯著（ Plt;0.05 。結(jié)論：導(dǎo)絲損傷大鼠主動脈瓣鈣化模型模擬了人的主動脈瓣狹窄特征，包括動脈瓣峰值流速和AVPG增加、AVA縮小、主動脈瓣膜增厚、纖維化、巨噬細(xì)胞浸潤和鈣鹽沉積。

AbstractObjective：Toestablishtheratmodelwithaorticvalvestenosisbydirectmechanicalinjuryontheaorticvalveofrats.ethods： Afteroneweekofadaptiverearing，theratswererandomlydividedintotheshamoperationgroup，themildmodelgroup，themoderate modelgroupandtheseveremodelgroup，with1atsineachgroup.Underutrasoundguidance，theguidewirewasinsertedintotheleft ventricleofSDatstouhtgmmorotidteyausigortialeijulfttriculaadacfutiodle stenosisofratsineachgroupweredetectedbyutrasound.Hematoxylin-eosin（HE）stainingwasusedtoobservethechangesinvalve thicknesslzaridaningasusedttectcalcisatdepositioninles.exprsioofacropagesteooi）， andαsmooth muscleactnamp;-SMA）positivecellinspecimensof eachgroupwasdetected byimmunohistochemical stainingmethod. Theexpressionof bonemorphogeneticprotein-2（BMP-2）ineachgroupwasdetectedbyWestemBlot.Results：Eightweksafter modeling，inthemildmodelgroupmoderatemodelgroupandseveremodelgroup，theleftvenricularejectionfraction（LVF），left ventricularoaisoregate）ndtiotfldcresdiltakortlfoloi andaortic valve cross-valve pressure gradient（AVPG） increased，with severe injury（ Plt;0.05 .Comparedwithshamoperation，theaortic valvesof ratsinthemildmodelgroup，moderatemodelgroup，andseveremodelgroup，thickness，calciumsaltdepostionicreased， CD₆₈ infiltration increased，the expressions of OPN and α -SMA positive cells increased，and the expression of BMP2 protein increased，and the changes insevere injurywere the mostsignificant（ Plt;0.05） .Conclusion：The rat model of aorticvalvecalcification by guidewire injury simulatedtheharacteristisofumanaorticalvestenosis，cludingincreasedpeakveloitandAVGofteaterialveeduced effectiverateofttkftiossoiatdo

Keywordscalcific aortic valve stenosis;Ultrasound; guide wire damage;animal model

鈣化性主動脈瓣狹窄（calcifiedaorticvalvestenosis，CAVS）是老齡化社會面臨的主要健康問題，可導(dǎo)致心力衰竭、心律失常等，嚴(yán)重威脅人類健康及生命。我國中老年人群瓣膜鈣化發(fā)生率為 12.5% ，其中主動脈瓣鈣化占 94.4%^[1] ，且隨著年齡的增長，其鈣化部位及程度也逐漸增加[2]。CAVS的自然發(fā)展是緩慢和漸進(jìn)的，其特點是經(jīng)歷了一個漫長的無癥狀期，但一旦病人出現(xiàn)呼吸困難或暈厥等癥狀就會危及生命[3]。目前，尚無能有效改變疾病進(jìn)展的醫(yī)學(xué)干預(yù)措施。CAVS病人僅在晚期階段出現(xiàn)癥狀或左心室功能不全時采用外科瓣膜置換4，由于存在并發(fā)癥的風(fēng)險，并不是所有病人都適合進(jìn)行該手術(shù)。因此，探明其發(fā)病機制，尋找早期干預(yù)手段，延緩瓣膜鈣化性病變進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)病變，具有重大的社會意義和經(jīng)濟價值。

動物模型是研究CAVS病理生理學(xué)機制和潛在治療措施的重要工具。最早報道的一種基于飲食的研究CAVS的動物模型為小鼠CAVS模型[5]。最常用的小鼠基因敲除模型為低密度脂蛋白受體（ ∠DLR^-1- 敲除小鼠[。除了飲食和基因敲除小鼠模型之外，還有在超聲心動圖引導(dǎo)下經(jīng)由右頸總動脈將彈簧導(dǎo)絲插入左心室中，并用導(dǎo)絲損傷瓣膜小葉來誘導(dǎo)CAVS瓣膜損傷模型[7]。這些都有助于了解CAVS的作用機制。然而，這些飲食誘導(dǎo)模型通常存在造模周期長、經(jīng)濟效益低且誘導(dǎo)模型不一致等問題。且導(dǎo)絲損傷小鼠模型存在操作困難、損傷過程中死亡率高、不易觀察等問題。因此，尋找一種周期較短、可操作性較高、成功率較高的動物模型尤為重要。本研究試圖建立導(dǎo)絲機械損傷誘導(dǎo)的CAVS大鼠模型，并根據(jù)損傷程度不同建立輕度、中度和重度模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

10～12 周齡雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量 （250±30）g 購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2019-0008]，在河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心無特定病原體（SPF）級環(huán)境飼養(yǎng)，室內(nèi)通風(fēng)、溫度和濕度良好。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUC-202303020）。

1.1.2 試劑與材料

蘇木素-伊紅（HE）染色液（Servicebio），茜素紅染色液（Servicebio），anti-CD68抗體（Servicebio），anti-a-SMA抗體（Servicebio），anti-骨橋蛋白（OPN）抗體（Servicebio），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（Servicebio），骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）抗體（Servicebio）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的制備及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組、輕度模型組、中度模型組、重度模型組，每組10只。大鼠造模前禁食水12h，用 1% 的戊巴比妥鈉（ 30（9/169） 腹腔注射麻醉。充分麻醉后，固定大鼠四肢，脫掉毛發(fā)，碘伏消毒。于右頸部縱向剪約2cm切口，用彎鑷鈍性分離出右頸總動脈，使其充分暴露。分離出的動脈穿3根結(jié)扎線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。右手持留置針先45進(jìn)針后平行血管推進(jìn)右頸總動脈，結(jié)扎線固定留置針后拔出針芯。將導(dǎo)絲沿留置針在超聲引導(dǎo)下緩慢送入主動脈瓣膜處。對于輕度損傷，使用帶有短且焊接尖端的直導(dǎo)絲（AbbottHI-TORQUE 0.014^′′ ），前后移動100次后再以每秒2次的速度旋轉(zhuǎn)200次。對于中度和重度的損傷，使用一根尖端為 30^° 角的常規(guī)導(dǎo)絲（ASAHIINTECCMIRACLEbros12），中度損傷前后移動200次后再以每秒2次的速度旋轉(zhuǎn)400次，重度損傷前后移動300次后再以每秒2次的速度旋轉(zhuǎn)600次。損傷后，立即使用彩色多普勒超聲評估急性主動脈瓣反流。假手術(shù)組以同樣的方式進(jìn)行，但導(dǎo)絲只插入右頸動脈，而沒有穿過主動脈瓣進(jìn)人左心室。導(dǎo)絲損傷主動脈瓣膜超聲圖見圖1。

A為輕度損傷超聲圖；B為中/重度損傷超聲圖。LV為左心室；Wire為導(dǎo)絲）

1.2.2 主動脈瓣膜組織的制備

造模8周后麻醉下大量失血法處死大鼠，將心臟與部分主動脈取下，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗心臟后，濾紙擦干，固定于 4% 多聚甲醛，經(jīng)脫水、石蠟包埋， 4μm 連續(xù)切片。

1.3主要觀察指標(biāo)及其檢測方法

1.3.1 超聲心動圖

超聲心動圖（VINNOD6LAB，飛依諾）檢測大鼠造模前、造模8周時的心功能指標(biāo)。M型超聲心動圖檢測左室心功能指標(biāo)，彩色多普勒超聲心動圖檢測主動脈瓣狹窄情況。M型超聲在胸骨旁長軸切面測量左室射血分?jǐn)?shù)（leftventricularejectionfraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricularfractional shortening，LVFS）、心排血量（cardiacoutput，CO）。彩色多普勒超聲在主動脈弓切面以及心尖四腔切面測量主動脈瓣峰值流速（aorticvalve peakvelocity，AVpeakvelocity）、主動脈瓣跨瓣壓力梯度（aorticvalvetransvalvularpressuregradient，AVPG）、主動脈瓣有效瓣口面積（aorticvalveorificearea，AVA）。輕度狹窄：峰值流速較基線增加 15%～lt;50% ；中度狹窄：峰值流速較基線增加 50%～75% ；重度狹窄：峰值流速較基線增加 gt; 75% 。

1.3.2 HE染色

取石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，按照HE試劑盒進(jìn)行染色，透明后干燥，封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍照。

1.3.3 茜素紅染色

取石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，用茜素紅染液進(jìn)行染色，透明后干燥，封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍照。

1.3.4 免疫組化

取石蠟切片經(jīng)脫蠟脫水后，免疫組化法檢測各組標(biāo)本中 CD_68?α -SMA和OPN陽性細(xì)胞表達(dá)情況。采用ImageJ圖像軟件分析切片的陽性染色面積。

1.3.5 蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測

取凍存的大鼠瓣膜組織 50mg ，經(jīng)研磨后提取蛋白上清液，蛋白變性后，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，TrisHCI緩沖鹽溶液（TBST液）搖床沖洗3遍，每遍 10min ，一抗 4^°C 孵育過夜，TBST搖床沖洗3遍，每遍 10min ，沖洗后二抗孵育 30min ，然后TBST搖床沖洗3遍，每遍10min ，曝光。采用ImageJ圖像軟件分析蛋白印跡的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 表示，多組間比較采用方差分析，方差分析兩兩比較時選用LSD法。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1超聲心動圖檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，造模8周后輕度模型組、中度模型組、重度模型組LVEF、LVFS、AVA降低，AVpeakvelocity、AVPG增加，其中重度模型組變化最為顯著（ Plt; 0.05）。造模8周后與造模前相比，輕度模型組、中度模型組、重度模型組LVEF、LVFS、AVA降低，AVpeakvelocity、AVPG增加，其中重度模型組變化最為顯著 Plt; 0.05）。詳見表1表2、圖2、圖3。

2.2各組大鼠主動脈瓣病理學(xué)檢測

2.2.1各組大鼠主動脈瓣大體標(biāo)本觀察

假手術(shù)組主動脈瓣質(zhì)地柔軟，表面光滑，色澤淺白透亮，組織較??；輕度模型組與假手術(shù)組相比，瓣膜組織質(zhì)地稍增厚；中度模型組、重度模型組主動脈瓣質(zhì)地硬且厚，色澤乳白渾濁，其中重度模型組瓣膜組織渾濁更明顯。詳見圖4。

2.2.2 各組大鼠主動脈瓣HE和茜素紅染色

HE染色觀察主動脈瓣瓣膜形態(tài)變化，結(jié)果顯示， 輕度模型組、中度模型組、重度模型組與假手術(shù)組相比，瓣膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，有不同程度的瓣膜增厚，其中重度模型組變化較為明顯。詳見圖5。

茜素紅染色觀察鈣鹽沉積情況，結(jié)果顯示，假手術(shù) 組和輕度模型組未出現(xiàn)鈣鹽沉積，中度模型組出現(xiàn)極少量鈣鹽沉積，重度模型組出現(xiàn)少量鈣鹽沉積。詳 見圖6。

2.3各組大鼠免疫組化檢測分析

anti CD₆₈ 抗體檢測瓣膜炎性巨噬細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，輕度模型組、中度模型組、重度模型組 CD₆₈ 細(xì)胞陽性率增加，其中，重度模型組最為顯著（ Plt;0.05 ）。anti-OPN抗體檢測瓣膜鈣化情況，結(jié)果顯示，OPN陽性細(xì)胞主要分布在瓣膜病變部位，其中，中度模型組、重度模型組OPN細(xì)胞陽性率較高 ?Plt;0.05 。anti- ?α -SMA抗體檢測瓣膜肌成纖維的分布，結(jié)果顯示， α -SMA陽性細(xì)胞主要分布在病變部位，其中，中度模型組、重度模型組陽性率最高（ Plt; 0.05）。詳見圖 7～ 圖10。

2.4 各組大鼠WestemBlot檢測比較

與假手術(shù)相比，中度模型組、重度模型組的BMP-2蛋白表達(dá)增加（ Plt;0.05 。詳見圖11、圖12。

圖11各組大鼠主動脈瓣膜組織BMP-2蛋白表達(dá)條帶圖

3討論

本研究建立并修改了Honda等7提出的導(dǎo)絲誘導(dǎo)的主動脈瓣損傷模型，實施了3種不同強度的主動脈瓣損傷，建立了大鼠輕度、中度或重度CAVS模型方法。與中度損傷相比，嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致主動脈瓣AVpeakvelocity、AVPG和AVA有了更明顯的變化。HE染色顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的主動脈瓣膜增厚，重度模型組增加更為明顯。茜素紅染色顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的瓣膜出現(xiàn)不同程度的鈣鹽沉積，重度模型組更為顯著。免疫組化顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的瓣膜出現(xiàn)不同程度的巨噬細(xì)胞浸潤、纖維化和鈣化，重度模型組更為顯著。WesternBlot顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的BMP-2表達(dá)增強，重度模型組增加更為明顯。同時，輕度模型組、中度模型組、重度模型組大鼠也出現(xiàn)LVEF降低。該大鼠模型模擬了人的主動脈瓣狹窄特征，包括AVpeakvelocity和AVPG增加、AVA減少、主動脈瓣膜增厚、纖維化、巨噬細(xì)胞浸潤和鈣鹽沉積。

目前，已經(jīng)發(fā)表的常見的關(guān)于CAVS的大鼠動物模型是基于靜脈注射華法林。然而，這些大鼠不會發(fā)生血液動力學(xué)顯著的主動脈狹窄[8，并且華法林誘導(dǎo)的主動脈瓣鈣化不同于自然發(fā)生的鈣化[9]。由腎切除術(shù)或高腺嘌呤飲食誘導(dǎo)的幾種尿毒癥大鼠模型出現(xiàn)主動脈瓣鈣化反映了腎衰竭與CAVS的相關(guān)性[\"。此外，注射維生素D在大鼠中能夠引起血管和主動脈瓣鈣化，但無主動脈瓣狹窄[1]。這些模型表明大鼠也可以作為CAVS模型的一種選擇。然而，這些模型在治療干預(yù)的測試中的用途有限，也不能模擬一般的人類病理。為此，需要一個在野生型大鼠中具有可變遺傳背景和適用性的CAVS模型。但是，如果沒有干預(yù)，手術(shù)或飲食野生型大鼠不會發(fā)生CAVS。Honda等描述的導(dǎo)絲誘導(dǎo)CAVS損傷模型，促進(jìn)了野生型小鼠CAVS的快速和有效發(fā)展。本研究實施了Honda等[7]描述的方案，誘發(fā)輕度、中度和重度CAVS。該模型在體內(nèi)生理變化（心肌性能）和組織病理學(xué)（瓣膜增厚、巨噬細(xì)胞浸潤和鈣鹽沉積）方面模擬了人類疾病。此外，本研究中建立的導(dǎo)絲損傷誘導(dǎo)的大鼠CAVS方案提供了一個較為簡單、可操作性強的主動脈瓣狹窄模型。輕度到中度或重度CAVS的分級損傷可以提供對疾病發(fā)展的各個階段的研究。

該模型與大鼠體內(nèi)的所有疾病模型一樣，也存在一定的局限性。首先，通過冠狀動脈導(dǎo)絲引起的急性損傷與人類疾病形成對比，在人類疾病中，CAVS的發(fā)展需要經(jīng)過幾十年的慢性機械應(yīng)力。其次，大鼠的生理學(xué)一般不同于人類的生理學(xué)。因此，所有使用該模型的發(fā)現(xiàn)最終都必須在人類環(huán)境中進(jìn)行探索。然而，該模型可以用來測試對可能導(dǎo)致CAVS的選定機制的假設(shè)。由于不需要基因改變、飲食或藥物來誘導(dǎo)CAVS，因此可以較容易地應(yīng)用于研究某個特定的基因、特定的信號通路。此外，還能應(yīng)用于干預(yù)措施的有效性研究，如飲食或藥物治療。

綜上所述，在超聲引導(dǎo)下導(dǎo)絲損傷主動脈瓣誘導(dǎo)的CAVS大鼠模型可能是有助于理解CAVS病理機制的可行性工具。

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（收稿日期：2023-12-17）（本文編輯鄒麗）