基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞在肝臟疾病治療中的應(yīng)用價值

基金項目：國家自然科學(xué)基金（82360132）；甘肅省衛(wèi)生健康行業(yè)科技創(chuàng)新重大項目（GSWSZD2024-11）；甘肅省重點研發(fā)計劃項目（22YF7FA085）；甘肅省聯(lián)合科研基金項目（23JRRA1489，24JRRA911）；甘肅省中醫(yī)藥課題重點項目（GZKZ-2022-7）；甘肅省重點人才項目（甘組通字[2024]4號）

Abstract：Theimmunomodulatory，repair，andregeneration-promotingfunctionsofmesenchmalstemcelsmakethemoneofthe potentialtreatmentmethodsforliverdiseases.Atpresent，viralandnon-viraldeliverymethodshavebeendevelopedtogeneticaly modify mesenchyalstemcels，ndgenemodificationcanpromote thesurvival，oming，andcyokinesecretionofmesenchal stemcell，therebyenhancingtheabilityof mesenchymal stemcellstotreatliverdiseases.Thisarticlemainlysummarizes the researchadvancesingene-modifiedmesenchyalstemcelsinthetreatmentofliverdiseases，nordertoprovidenewinsightsand strategies for theclinical treatment of liver diseases.

Key Words：Mesenchymal Stem Cels;Organisms，Genetically Modified;Liver Disease;Therapeutics

Researchfunding：National NaturalScienceFoundationofChina（8236ol32）；MajorProjectofScienceandTechnologIovation in Health Sectorof Gansu Province（GSWSZD2024-11）；KeyRamp;DProgram ofGansu Province（22YF7FA085））;Joint Research FundProjectof GansuProvince（23JRRA1489，24JRRA911）；KeyProjectof Traditional Chinese Medicine in GansuProvince （GZKZ-2022-7）; Gansu Provincial Key Talent Project （Gan Group No.[2024]4）

肝損傷是由肝炎病毒、藥物或毒物等引發(fā)的肝臟病理改變，其病程進展可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭及肝細(xì)胞癌（HCC）等終末期肝病。研究顯示，肝臟疾病每年導(dǎo)致約

200萬人死亡，占全球總死亡人數(shù)的 4%^[1] 。肝硬化患者的預(yù)后與并發(fā)癥密切相關(guān)，當(dāng)合并腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腎功能不全或繼發(fā)感染時，特別是出現(xiàn)慢加急性肝衰竭時，患者病死率將增加5＼～10倍[1]。盡管肝移植為肝硬化并發(fā)癥和HCC患者提供了挽救生命的療法，但也面臨肝臟供體分配政策、等待名單上的優(yōu)先次序和終末期肝病模型評分缺陷等多種挑戰(zhàn)[2]。近年來，基于肝臟自然再生能力的組織工程技術(shù)，使肝臟疾病的治療出現(xiàn)了新的選擇。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSC）具有歸巢、促進組織再生、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、旁分泌等特性，在肝臟疾病中具有治療潛力[]。為提高MSC的植入效率與治療效果，研究者采取低氧環(huán)境誘導(dǎo)、藥物干預(yù)及基因修飾等手段改善MSC的生存率與定向遷移能力[4]，本文主要討論基因修飾MSC的策略及治療肝臟疾病的潛力。

1常見的基因編輯方法

基因組編輯技術(shù)是利用序列特異性DNA結(jié)合模塊在活細(xì)胞的基因組中引入基因座特異性DNA插入、缺失或改變。從巨核酸酶、鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶開始，基因組編輯工具已經(jīng)發(fā)展成為基因工程的重要工具之一[5]。2012年成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)核酸酶9（clusteredregularly interspacedshort palindromic repeats- associated protein 9，CRISPR-Cas9）基因編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，進一步擴展了基因組編輯的可能性[6]。目前，基因編輯療法在腫瘤學(xué)、遺傳病和感染性疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用正在快速開發(fā)[7]，研究人員正在探索其在乙型肝炎、丙型肝炎的臨床前模型中的試驗療法。CRISPR-Cas系統(tǒng)在肝病領(lǐng)域已被應(yīng)用于遺傳性肝病、肝炎和肝癌的疾病模型中，通過基因篩選、基因的插入和敲除確定對肝臟病理至關(guān)重要的基因，從而改變肝病相關(guān)基因的功能[8]。治療性基因編輯包括體內(nèi)基因編輯和離體基因編輯。體內(nèi)基因編輯，即細(xì)胞直接在體內(nèi)進行編輯。治療性體內(nèi)基因編輯的遞送技術(shù)包括病毒載體、脂質(zhì)納米顆粒和病毒樣顆粒，已在多項臨床試驗中進行了評估。目前，CRISPR-Cas9體內(nèi)基因編輯在視網(wǎng)膜變性和遺傳性血管水腫的臨床實驗中已經(jīng)取得關(guān)鍵進展[9-10]，但安全有效的遞送基因組編輯成分的方法仍然是體內(nèi)基因組編輯療法的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。離體基因編輯，即將細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外進行基因編輯后引入患者體內(nèi)。依賴于病毒載體作為便攜式“特洛伊木馬\"的開發(fā)，造血干細(xì)胞基因療法的臨床試驗日益增長[1]。截至2023年第一季度末，全球有100多種不同的基因、細(xì)胞和RNA療法獲得批準(zhǔn)，還有3700多種處于臨床和臨床前開發(fā)階段，其中有11項涉及基因修飾，包括基因修飾的造血干細(xì)胞與嵌合抗原受體T細(xì)胞[12]但尚無基因修飾MSC療法獲得批準(zhǔn)。其原因在于：首先，MSC的來源如胎兒組織的獲取仍然具有倫理爭議，每個捐贈胎兒可分離的干細(xì)胞數(shù)量有限，體外培養(yǎng)過程中“干細(xì)胞”喪失的問題是開發(fā)基于該來源療法的主要挑戰(zhàn)[13]。其次，盡管基因治療和基因編輯技術(shù)創(chuàng)建的干細(xì)胞及其衍生物，與天然干細(xì)胞衍生物相比，其功能、特異性和反應(yīng)性均得到改善，但在臨床應(yīng)用層面，患者需具備辨識經(jīng)權(quán)威機構(gòu)認(rèn)證的正規(guī)干細(xì)胞治療中心的能力?；隗w外擴增細(xì)胞的療法需要大量的證據(jù)來證明其安全性，例如干細(xì)胞的免疫抑制和血管生成特性可能在某些情況下促進腫瘤生長[14]。

2提高MSC治療潛力的基因修飾策略

2.1病毒轉(zhuǎn)染使用病毒載體的基因修飾是利用病毒轉(zhuǎn)染MSC并將病毒基因插入宿主基因組的天然能力，包括與病毒基因組連接或替換病毒基因的目標(biāo)基因[15]病毒載體包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒。用于臨床應(yīng)用的大多數(shù)載體基于腺病毒，其次是逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒。病毒載體因高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和穩(wěn)定的基因表達被普遍使用。

2.2非病毒轉(zhuǎn)染非病毒轉(zhuǎn)染包括物理和化學(xué)轉(zhuǎn)染法[16]。常用的化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括脂質(zhì)體、聚合物、細(xì)胞滲透肽和無機納米顆粒，用于MSC轉(zhuǎn)染的常見有機材料是脂質(zhì)、聚合物、多糖和肽，二氧化硅和氧化鐵主要用于無機材料。常用的物理轉(zhuǎn)染法包括電穿孔、核轉(zhuǎn)染和微穿孔，轉(zhuǎn)染效率分別約 40% ） 50% 和 80%^[17] ，其中，微穿孔的轉(zhuǎn)染效率最高，但該方法仍需要擴大臨床適用性。

3基因修飾增加MSC在肝臟疾病治療中的優(yōu)勢

3.1基因修飾提高MSC的遷移與歸巢MSC的活力和遷移能力對肝病療效起著至關(guān)重要的作用。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）作為一種糖蛋白激素，具有保護神經(jīng)、抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡等多重功能[18]。使用過表達EPO的骨髓MSC治療肝纖維化小鼠模型，結(jié)果表明EPO過表達促進骨髓MSC的細(xì)胞活力和遷移，減輕肝纖維化[19]。成纖維細(xì)胞生長因子21（fibroblast growthfactors21，F(xiàn)GF21）是一種內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)激素，可以調(diào)節(jié)能量平衡、葡萄糖和脂質(zhì)代謝[20]。持續(xù)過表達FGF21的工程化MSC，增強其向受損部位的歸巢，并且減少MSC凋亡，在治療小鼠酒精性肝病方面表現(xiàn)出較好的效果[21]。因此，基因修飾的MSC不僅能夠維持高且穩(wěn)定的基因表達水平，還能促進其向損傷部位的有效遷移，從而提升MSC治療肝病的潛能。

3.2基因修飾促進MSC分泌細(xì)胞因子，提高MSC免疫調(diào)節(jié)能力研究表明培養(yǎng)高密度人脂肪MSC會誘導(dǎo)干擾素β（interferon- β ，IFN-β）分泌[22]，IFN- β 可通過MSC中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活劑1途徑誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞生長因子的表達[23]。將攜帶人IFN- β 基因的非病毒載體導(dǎo)入脂肪MSC后發(fā)現(xiàn)，過表達IFN- β.{β} 的MSC通過促進肝細(xì)胞生長因子的分泌，減輕小鼠的腸道組織炎癥和腸道滲漏[24]，并在酒精性肝病小鼠模型中展現(xiàn)良好的治療效果。自身免疫性肝病是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，其中CD4⁺ 和 CD8⁺T 細(xì)胞是肝臟中浸潤的主要類型。 CD4⁺ T細(xì)胞表達獨特的抑制性受體CD32b，該受體是免疫抑制因子可溶性纖維蛋白原樣蛋白2（solublefibronectin-likeprotein 2，sFg|2 的唯一受體， sFgl2 是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的關(guān)鍵免疫抑制因子及效應(yīng)分子[25]。將 sFgl2 修飾的MSC與自身免疫性肝病小鼠 CD4⁺T 細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，sFgl2修飾的MSC可通過增強Src同源2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology 2 domain-containing protein tyrosinephosphatase2，SHP2）和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2/3（cellularsignaltransductionmolecules2/3，Smad2/3）的磷酸化，促進調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，抑制輔助性T細(xì)胞的分化，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[26]

4基因修飾MSC在肝臟疾病中的應(yīng)用

4.1基因修飾MSC在肝纖維化、肝硬化中的應(yīng)用肝硬化是由于損傷后新生的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積所致，其中涉及肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化，活化后的HSC引發(fā)絲裂原介導(dǎo)的增殖，結(jié)締組織生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF- _?β1 ）驅(qū)動的纖維化增加，炎癥和免疫調(diào)節(jié)放大，以及細(xì)胞外基質(zhì)降解下降[27]。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（extracellularmatrixprotein1，ECM1）是一種分泌性糖蛋白，參與胚胎軟骨形成、皮膚分化、血管生成和細(xì)胞增殖，肝纖維化時ECM1減少，補充外源性ECM1可以通過阻斷HSC活化，逆轉(zhuǎn)肝纖維化[28]。將ECM1過表達的毛囊來源的MSC移植人肝硬化小鼠體內(nèi)，其通過TGF-β/Smad途徑抑制HSC活化，顯著改善肝硬化小鼠的肝功能和肝臟病理損傷[29]。過表達Smad7可抑制HSC的膠原蛋白表達和細(xì)胞增殖[30]，使用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Smad7基因產(chǎn)生過表達的MSC治療肝硬化大鼠，結(jié)果顯示過表達Smad7的MSC通過抑制TGF-β1/Smad信號通路減輕肝硬化[31]。再生肝磷酸酶-1（phosphatase ofregeneratingliver-1，PRL-1）具有促進細(xì)胞遷移和侵襲的能力，被確定為肝再生的早期基因[32-33]，肝硬化大鼠模型移植過表達PRL-1的胎盤來源的MSC后，治療組肝臟線粒體特異性標(biāo)志物蛋白表達水平增加，線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)和三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)量增加，基因修飾的MSC通過調(diào)節(jié)肝臟中的線粒體代謝，促進肝硬化大鼠肝功能的恢復(fù)[34]。

4.2基因修飾MSC在肝衰竭中的應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growthfactor，VEGF）可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖、遷移和浸潤，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[35]。VEGF165是其主要亞型，具有很強的促血管生成功能。使用臍帶MSC作為VEGF165基因的基因傳遞載體，治療大鼠急性肝衰竭（acuteliverfailure，ALF）模型，發(fā)現(xiàn)過表達VEGF165增強臍帶MSC的多能性，促進臍帶MSC在ALF大鼠肝組織中的歸巢和定植，并改善肝損傷，促進肝再生[36]。 Xu 等[37]評估ALF患者和ALF小鼠肝臟中趨化因子的表達譜發(fā)現(xiàn)，受損肝臟中CC趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR2）表達高度上調(diào)，使用過表達CCR2的MSC治療ALF小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，MSC的療效顯著增強，具體表現(xiàn)為ALF小鼠存活率顯著提高、肝損傷癥狀減輕（包括減少炎癥浸潤和肝細(xì)胞凋亡）以及肝再生能力提升。肝細(xì)胞核因子 4α （hepatocyte nuclear factor-4 alpha， HNF4α ）是核激素受體家族的重要轉(zhuǎn)錄因子，對于維持正常的肝臟結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。過表達 HNF4α 的人臍帶MSC可促進替代型活化巨噬細(xì)胞極化并減輕MSC的旁分泌因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而抑制ALF肝臟炎癥和損傷[38]。因此，外源性基因修飾通過促進MSC的歸巢等特性，在治療ALF小鼠模型中展現(xiàn)出有效的治療潛力，然而基因修飾的MSC與肝實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞之間的串?dāng)_及潛在的分子機制仍需要進一步研究。

4.3基因修飾MSC在肝癌中的應(yīng)用HCC是一種常見的肝臟惡性腫瘤，具有高度血管化特征[39]，據(jù)估計，2020年全球有905700人被診斷為肝癌，830200人死于肝癌，其中中國的肝癌病例占全球的 45.3% ，肝癌死亡人數(shù)占全球 47.1%^[40] 。研究表明，VEGF在HCC中過度表達，并且與腫瘤血管生成密切相關(guān)[4I]。可溶性fms樣酪氨酸激酶-1（soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1）可通過與游離的VEGF結(jié)合或與血管內(nèi)皮生長因子受體-2形成無活性的異源二聚體來抑制血管生成[42]。將慢病毒轉(zhuǎn)染sFlt-1的MSC植入HCC小鼠模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，MSC可有效分泌sFlt-1，抑制體外血管形成，從而抑制腫瘤生長并延長小鼠生存期[43]。 Wu 等[44研究發(fā)現(xiàn)，過表達 HNF4α 的MSC通過下調(diào) Wnt/β -catenin信號通路，減少HCC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，從而抑制HCC進展。表明基因修飾賦予MSC抗腫瘤特性，使MSC成為基因治療的理想遞送載體。4.4miRNA修飾的MSC在肝臟疾病中的應(yīng)用miRNA是小型非編碼RNA，可調(diào)節(jié)大多數(shù)細(xì)胞類型中的信使RNA表達和翻譯效率。miRNA通過與特定的mRNA靶點結(jié)合，促進其降解和/或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因表達，miRNA表達的改變與肝臟代謝失調(diào)、肝損傷、肝纖維化和腫瘤發(fā)展相關(guān)[45]。慢性肝損傷通過激活HSC使其分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，產(chǎn)生纖維瘢痕，導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化[46]。HSC分泌的賴氨酰氧化酶樣蛋白2在肝纖維化中上調(diào)，通過共價交聯(lián)穩(wěn)定膠原蛋白和彈性蛋白使纖維化瘢痕不可逆，從而增加ECM剛度，促進中央纖維化效應(yīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的激活，是治療肝纖維化的重要靶點[47]。MSC來源的細(xì)胞外囊泡（smallextracellularvesicle，sEV）作為miRNA遞送載體在多種疾病的治療中取得了重大進展。使用miR-4465修飾的MSC-sEV可將miR-4465傳遞到HSC中，通過下調(diào)賴氨酰氧化酶樣蛋白2表達，減少HSC中的膠原沉積，緩解肝纖維化[48]。

研究發(fā)現(xiàn)，高爾基體膜蛋白1（Golgimembraneprotein1，GOLM1）可以顯著促進HCC的發(fā)展和擴散[49]，miRNA-559、miRNA-141-3p和miRNA-27b3p是已知的控制GOLM1表達的miRNA[50]。在肝臟生理學(xué)方面， miR-27a 家族與GOLM1相互作用將肝祖細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)[51]Bongolo等[52]發(fā)現(xiàn)來自 miR-27a-3p 轉(zhuǎn)染的MSC的外泌體（mesenchymal stemcells-exosomes，MSC-exo）在體外和體內(nèi)均可阻止HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移; miR-27a-3p 通過靶向結(jié)合并下調(diào)癌基因GOLM1發(fā)揮抗HCC作用。因此， miR-27a-3p 是通過GOLM1發(fā)揮作用的潛在HCC治療靶點。此外，miRNA通過調(diào)控細(xì)胞通路中的關(guān)鍵基因，對HCC的進展和多藥耐藥性產(chǎn)生至關(guān)重要的影響[53]。miR-199a-3p是正常肝臟中第三高表達的miRNA，其下調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)[54]，通過慢病毒感染和嘌呤霉素篩選構(gòu)建 miR-199a 修飾的脂肪來源MSC治療原位HCC小鼠模型，結(jié)果顯示，exo能夠有效介導(dǎo) miR-199a 向HCC細(xì)胞的遞送。此外，脂肪MSC-exo-199a可分布到腫瘤組織中，通過靶向哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，mTOR），抑制mTOR通路，提高HCC 細(xì)胞對阿霉素的敏感性[55]。因此，有效的載體介導(dǎo)的miRNA遞送，可能成為改善HCC化療的新策略（圖1，表1）。

5總結(jié)

基因修飾技術(shù)可以提高MSC治療肝病的效果，然而基因修飾MSC臨床轉(zhuǎn)化還需進一步風(fēng)險評估。首先，轉(zhuǎn)染方法可能會導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激，并可能對細(xì)胞代謝和活力產(chǎn)生影響。病毒轉(zhuǎn)染因轉(zhuǎn)染效率高而常用于基因治療的臨床試驗，但商業(yè)規(guī)模的病毒載體相對昂貴且耗時，并仍然存在觸發(fā)免疫原性反應(yīng)或誘變的風(fēng)險，需要在臨床使用中長期監(jiān)測。使用非病毒方法可以避免這些問題，但其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞特異性往往不足。此外，基因工程的MSC還需證明轉(zhuǎn)基因的過度表達不會導(dǎo)致不必要的副作用。因此，基因修飾MSC治療肝臟疾病還需進一步研究準(zhǔn)確性、安全性，以提高治療策略的可靠性。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：趙婷婷負(fù)責(zé)查閱文獻，撰寫文章；周丹、高曉琴、岳偉、王汝琴負(fù)責(zé)審校；李俊峰、張立婷負(fù)責(zé)指導(dǎo)立題，文章修改。

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收稿日期：2024-09-25：錄用日期：2024-12-04本文編輯：劉曉紅

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