手性單壁碳納米管與牛血紅蛋白復合物氧化還原過程的光譜學研究

中圖分類號：0657.3

文獻標志碼：A

血紅蛋白（Hb）在動物肌肉組織中扮演著關(guān)鍵角色，它是一種富含鐵的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)執(zhí)行多項生理功能，如氧氣的運輸、儲存及參與氧化還原反應[1-2]。在肺部，血紅蛋白與氧氣結(jié)合，形成氧合血紅蛋白（HbO₂） ，隨后在組織細胞中釋放氧氣，恢復為還原態(tài)的血紅蛋白（HHb）。在臨床中，血紅蛋白在沒有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等抗氧化酶系統(tǒng)保護的情況下，易于自發(fā)氧化，形成高鐵血紅蛋白（MetHb）。這種氧化產(chǎn)物不僅會干擾血紅蛋白的正常氧氣輸送功能，還可能在一系列氧化過程中引起蛋白質(zhì)或血紅素的損傷3]。因此，監(jiān)測血紅蛋白的氧化還原狀態(tài)對于評估氧氣輸送效率及疾病診斷具有顯著的臨床意義。目前，可以利用高效液相色譜法4、電子順磁共振法、電化學法和近紅外吸收光譜法來監(jiān)測血紅蛋白的氧化還原狀態(tài)。上述方法具有一定的局限性，檢測過程易受儀器條件的限制，因此亟待開發(fā)一種可以排除蛋白自身熒光影響的新方法，以實現(xiàn)血紅蛋白氧化還原狀態(tài)的快速、高靈敏檢測。

單壁碳納米管（SWCNTs）是由單層石墨烯片卷曲而成的無縫圓柱體，直徑通常為 1～2nm 。根據(jù)電子結(jié)構(gòu)的不同，SWCNTs可分為金屬性SWCNTs和半導體性SWCNTs。其中，直徑為 0.5～1.4nm 的半導體性SWCNTs經(jīng)輻照激發(fā)后，通過躍遷釋放的光子所對應的波長位于生物透明窗口的近紅外區(qū)域，能夠有效降低生物組織的散射和吸收損耗8。碳納米管因其獨特的光學和物理化學特性，在生命科學領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應用[9-11]。為了實現(xiàn)其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用，對SWCNTs進行功能化修飾是至關(guān)重要的一步。通過生物分子或有機聚合物的非共價修飾，不僅能提高SWCNTs的分散性，還賦予其良好的生物相容性。研究表明，經(jīng)DNA、蛋白質(zhì)、表面活性劑和脂質(zhì)修飾的SWCNTs在人臍靜脈內(nèi)皮細胞、肺上皮細胞和巨噬細胞中顯示出極低的毒性[12-15]。Kam等[2]發(fā)現(xiàn)，核酸包裹的SWCNTs能通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)部，在質(zhì)量濃度低于 5mg/L 的條件下不會引起細胞毒性。

由于SWCNTs的光學特性易受到自身結(jié)構(gòu)和周圍環(huán)境的影響，利用生物分子與SWCNTs的相互作用開發(fā)的熒光探針和生物傳感器已成為研究熱點。基于SWCNTs的熒光傳感器成功用于檢測神經(jīng)遞質(zhì)[16]、脂質(zhì)[17]、 pH^[18] 、阿霉素[19]和離子[20]、 NO^[21] ，H₂O₂^[22] 等小分子物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)最常見的生物分子，它能通過 π-π 堆積、疏水作用和靜電作用與碳納米管結(jié)合[23-25]。不同尺寸和結(jié)構(gòu)的SWCNTs與蛋白質(zhì)的相互作用有所不同。

本文將未分離的SWCNTs與兩種具有特定手性的（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs分別與牛血紅蛋白（BHb）結(jié)合，旨在通過光譜學響應深人探究它們之間的相互作用以及SWCNTs/BHb復合物的氧化還原過程的特性，以揭示SWCNTs與血紅蛋白結(jié)合后的光學行為，為開發(fā)新型的生物傳感器和成像技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)有望推動SWCNTs在生物醫(yī)學診斷中的應用。

實驗部分

1.1材料與試劑

單壁碳納米管CoMoCAT、聚乙二醇（PEG， M_w= 8000）和脫氧膽酸鈉（DOC），均購自美國Sigma-Aldrich公司；葡聚糖（Dex， M_w=70000 由東京化成工業(yè)株式會社提供；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自永華化學科技有限公司；牛血紅蛋白（BHb）、 L -抗壞血酸（AA），購自麥克林生物科技有限公司；過氧化氫溶液0 ，質(zhì)量分數(shù) 3% ）由廣東恒健制藥有限公司提供。

1.2儀器與設(shè)備

SCQ-250F型功率可調(diào)細胞粉碎機（上海聲彥超聲波儀器有限公司）；Fresco-21型高速離心機（ThermoFisher公司）；MINI-10K+型低速離心機（杭州米歐儀器有限公司）；UV-2600型紫外（UV）-可見（Vis）-近紅外（NIR）吸收光譜儀（日本島津公司）；Horiba-Yvon·nanologo-3型熒光光譜儀（堀場（中國）貿(mào)易有限公司）；F-4600型日立熒光分光光度計（日立高新技術(shù)公司）；ChirascanV100型圓二色譜儀（英國應用光物理有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1SWCNTs的分散稱取 1.0mg SWCNTs，加人 1.0mL DOC溶液 w=2% ），在冰水浴下超聲1h使其分散，之后于 25^°C 下離心1h，轉(zhuǎn)速為 13800r/min 。

取上清液，即得SWCNTs分散液。

1.3.2單一手性SWCNTs的分離 （6，5）-SWCNTs的分離：在離心管中加入 250μLPEG（w=15%） 和 250μL Dex（ w=15% 溶液，混勻后離心以形成雙水相。在雙水相系統(tǒng)中加入 10μL SWCNTs分散液、 15μL SDS中 w=10% ）和 6μL DOC溶液 （w=1% ），混勻離心。取出下相，加入 250μL PEG（ w=15% ）和 DOC溶液 （w=2% ），混勻離心后上相出現(xiàn)紫色即得（6，5）SWCNTs.

（8，3）-SWCNTs的分離：將上一步的上相與 250μL Dex （w=15%） 混合，再加入 4～6μL DOC溶液（ w= 2% ），混勻離心。下相出現(xiàn)淡綠色即得（8，3）-SWCNTs。1.3.3BHb/SWCNTs復合物制備將BHb溶解于磷酸鹽緩沖液 （0.01mol/L ，pH7.4）中，使其終濃度為 。分別取 25μL 、濃度為 0.4μmol/L 的SWCNTs、（6，5）-SWCNTs、（8，3）-SWCNTs分散液與1mL 濃度為 4μmol/L 的BHb溶液混合，室溫下孵育30min 。測定復合物樣品的吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜。

1.3.4過氧化氫對SWCNTs/BHb復合物的氧化作用

在SWCNTs/BHb、（6，5）-SWCNTs/BHb 和 （8，3）-SWCNTs/BHb復合物中，分別加入不同濃度的 H₂O₂ 溶液，并在室溫條件下反應 30min 。為了測量熒光光譜， H₂O₂ 濃度范圍為 0～21.5μmol/L ；而對于近紅外熒光光譜的測量， H₂O₂ 濃度范圍為 0～16.3μmol/L 實驗中，將未添加SWCNTs的BHb溶液作為空白對照組。

1.3.5抗壞血酸對SWCNTs/BHb復合物的還原作用

為了研究抗壞血酸的還原作用，先在3個復合物中加人 H₂O₂ 溶液并反應 30min ，使血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，再分別加入不同濃度的抗壞血酸溶液，繼續(xù)反應 30min 。在測定熒光光譜時， H₂O₂ 的終濃度為 20μmol/L ，抗壞血酸的濃度范圍設(shè)定為 0～ 51.3μmol/L ；而在測定近紅外熒光光譜時， H₂O₂ 的終濃度為 16μmol/L ，抗壞血酸的濃度范圍設(shè)定為 0～ 15.1μmolL 。實驗中，使用未添加SWCNTs的BHb溶液作為空白對照組。

1.3.6光譜測定使用ChirascanV100型圓二色譜儀對樣品進行圓二色譜的測定，氮氣吹掃速率為 3L/min 掃描速率 20nm/min ，波長測量范圍為 190～260nm 采用CDNN程序（一個基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的圓二色譜數(shù)據(jù)分析軟件，可用于預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和螺旋含量[2）對數(shù)據(jù)進行分析，以計算BHb 的二級結(jié)構(gòu)。以空白雙水相溶液為對照，在 300～500nm 和 300～1300nm 波長范圍內(nèi)測定樣品的吸收光譜。使用F-4600型熒光分光光度儀測定熒光發(fā)射光譜，狹縫寬度 10nm 激發(fā)波長 280nm ，發(fā)射波長為 300～550nm 。使用Horiba-Yvon·nanologo-3型熒光光譜儀測定樣品的近紅外熒光光譜，狹縫寬度 8nm ，測量范圍 900～1080nm 0SWCNTs和（6，5）-SWCNTs的激發(fā)波長均為 575nm （8，3）-SWCNTs的激發(fā)波長為 679nm 。每個樣品平行測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 SWCNTs的分離

雙水相萃取法是分離手性SWCNTs的常用手段[27]。該技術(shù)通過調(diào)整表面活性劑的濃度來改變不同手性SWCNTs在兩相中的分配比例，實現(xiàn)它們的分離。圖1（a）示出了SWCNTs在分離前后的紫外-可見-近紅外吸收光譜，其中未分離的SWCNTs表現(xiàn)出多個手性體的吸收峰，而單一手性的（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs則在特定波長（分別為980、575nm和950、 660nm ）[28]顯示出其電子躍遷能 E₁₁ 和 E₂₂ 的特征吸收峰。由圖1（b）和圖1（c）、（d）可見，與SWCNTs相比，（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs顯示出更強的熒光強度，這歸因于在SWCNTs中存在能夠抑制熒光的金屬性SWCNTs。本文通過應用朗伯-比爾定律 A=εlc （其中， A 為吸光度; ε 為摩爾吸光系數(shù)， ε_{（6，5）}= 6700L/（mol?cm） ！ ε_（8，3）=4500L/（mol?cm）^[29] ；1為液層厚度； c 為SWCNTs的濃度），可以計算出每種SWCNTs的具體濃度。本文得到SWCNTs、（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs的濃度分別為19.3、 0.39mmolL 和0.38mmol/L 。

2.2 SWCNTs/BHb復合物表征

圖2示出了BHb、SWCNTs、（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs及其形成的復合物的紫外-可見-近紅外吸收光譜。BHb在 400nm 處的吸收峰是由 ππ 電子躍遷引起的 Soret 帶吸收峰[30]。SWCNTs、（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs與BHb結(jié)合后，復合物的吸收光譜在 400nm 處也出現(xiàn)顯著的吸收峰，初步表明了BHb與這3種SWCNTs之間發(fā)生了偶聯(lián)作用。

圖3（a）所示為BHb及其與不同SWCNTs結(jié)合前后的熒光光譜。在 280nm 的激發(fā)波長下，BHb在337nm 波長處產(chǎn)生熒光發(fā)射，這是來自色氨酸和酪氨酸殘基的熒光貢獻[31。當BHb分別與3種不同的SWCNTs結(jié)合后，其熒光強度普遍降低。相同濃度的SWCNTs、（6，5）-SWCNTs和 （8，3）-SWCNTs分別使BHb的熒光淬滅 59.9% 、 10.9% 和 3.3% ，表明BHb與SWCNTs之間存在相互作用。研究表明BHb的色氨酸殘基對SWCNTs側(cè)壁具有很高的結(jié)合親和力，當BHb與SWCNTs結(jié)合后，氨基酸殘基的極性降低，使BHb與SWCNTs復合物的疏水性增加，進而抑制了BHb的固有熒光[32-33]。在這些SWCNTs中，未分離的SWCNTs對BHb熒光的淬滅作用最為顯著，可能是因為未分離的SWCNTs中混合的金屬性管比半導體性管對蛋白質(zhì)有更強的結(jié)合作用，從而使BHb熒光發(fā)生明顯的淬滅[34]。相比之下，經(jīng)分離后的單一手性（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs對BHb的影響較小。

圓二色譜是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要工具。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)如 a -螺旋、 β. -折疊和無規(guī)卷曲分別在遠紫外區(qū)域的208、222、217、 195nm 處呈現(xiàn)負峰，而在190、195＼～198、 212nm 處呈正峰[35]。因此，通過對圓二色譜光譜峰的位置和形狀進行分析能夠了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化及其與其他分子的相互作用。從圖3（b）中可以看到，BHb在 208，222nm 處呈負峰，對應于a. -螺旋構(gòu)象。加入SWCNTs后兩個負峰信號強度降低，表明與SWCNTs結(jié)合使BHb的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。產(chǎn)生該結(jié)果的主要原因為SWCNTs與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基產(chǎn)生了 π-π 堆積相互作用，該作用可以影響蛋白質(zhì)肽的疏水性和電子密度，從而改變其結(jié)構(gòu)[36-37]。通過CDNN程序分析了3種SWCNTs對BHb二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果列于表1?？梢钥闯?，（6，5）-SWCNTs和（8，3）-SWCNTs的加人使BHb的 a 螺旋結(jié)構(gòu)的含量（摩爾分數(shù)，以下同）分別減少了9.2% 和 3.6% ，未分離的SWCNTs由于濃度較高，對BHb的作用更加強烈，使其 α -螺旋結(jié)構(gòu)的含量減少了 13.8% 。而 β -折疊、 β -轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量均相應增加，表明與SWCNTs結(jié)合導致BHb的結(jié)構(gòu)發(fā)生變性和展開[38-39]，這進一步證實了SWCNTs/BHb復合物的成功制備。

2.3過氧化氫對SWCNTs/BHb復合物氧化過程的光譜學研究

血紅蛋白與雙電子氧化劑 H₂O₂ 之間容易發(fā)生反應[40]，易于轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，這種轉(zhuǎn)變可能引起供氧障礙和細胞損傷。通過光譜技術(shù)，可以追蹤血紅蛋白的氧化還原狀態(tài)。本文通過熒光光譜和近紅外熒光光譜分析了 H₂O₂ 對3種SWCNTs/BHb復合物的氧化過程，結(jié)果分別見圖4和圖5。

表1BHb與SWCNTs結(jié)合前后的二級結(jié)構(gòu)含量

Table1 Contentof secondarystructureofBHb beforeand after combinationwithSWCNTs

圖4示出了隨著 H₂O₂"濃度上升，BHb及其與SWCNTs的復合物的熒光強度增加，同時最大發(fā)射波長發(fā)生紅移。這一現(xiàn)象表明， H₂O₂"促使亞鐵血紅蛋白向高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變，導致血紅素分解，熒光強度因此增加。發(fā)射波長的紅移表明色氨酸和酪氨酸殘基周圍的微環(huán)境極性減少。在 H₂O₂ 的影響下，BHb的最終熒光強度比初始值增強了3.5倍，而SWCNTs/BHb、（6，5）-SWCNTs/BHb和（8，3）-SWCNTs/BHb的熒光強度分別比初始值增強了2.5倍、3.2倍和2.9倍。上述結(jié)果表明，與SWCNTs的結(jié)合能在一定程度上減緩BHb的氧化，減少高鐵血紅蛋白的形成。

SWCNTs在近紅外區(qū)域展現(xiàn)出穩(wěn)定的熒光特性，且不發(fā)生光漂白或光閃爍，這些特性有助于減少生物組織背景吸收對血紅蛋白氧化還原狀態(tài)監(jiān)測的干擾，為血紅蛋白的檢測提供一種更為有效的技術(shù)手段。

熒光光譜隨 H₂O₂ 濃度變化的情況。與BHb的熒光響應相似，SWCNTs的熒光強度也隨 H₂O₂ 濃度的增加而增強，與初始值相比，（6，5）-SWCNTs、（8，3）-SWCNTs和未分離的SWCNTs的最終熒光強度分別增強了77.6% 84.5% 和 57.3% 。SWCNTs熒光的變化可能與介電環(huán)境的改變或與氧化還原小分子之間的電荷轉(zhuǎn)移有關(guān)[41]。SWCNTs為單原子層結(jié)構(gòu)，其光學躍遷能級容易受到周圍介電環(huán)境的影響。一般來說，隨著聚合物在SWCNTs側(cè)壁的覆蓋率增加，碳納米管與水接觸減少，管壁附近介電常數(shù)下降，SWCNTs的第一、第二子能帶都會藍移。而與氧化還原分子發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移會導致SWCNTs的價電子密度發(fā)生改變，從而影響光學性質(zhì)[42-43]。因此，SWCNTs熒光增強的原因可能為：（1）在 H₂O₂ 的作用下，吸附在SWCNTs表面的BHb結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而改變了SWCNTs周圍的介電環(huán)境； （2）H₂O₂ 與SWCNTs/BHb復合物之間的電荷轉(zhuǎn)移增加了體系中的電子共軛程度，從而減小了電子躍遷的能量差異，導致SWCNTs的近紅外熒光增強。

2.4抗壞血酸對SWCNTs/BHb復合物還原過程的光譜學研究

抗壞血酸是人體中重要的抗氧化劑，它能夠作為氧化還原輔助因子和催化劑，消除導致游離血紅蛋白氧化損傷的關(guān)鍵前體物質(zhì)[44]。本文首先引入H₂O₂ 溶液促使血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，隨后在不同濃度的 L -抗壞血酸作用下，探討了BHb與SWCNTs復合物的還原過程。圖6示出了BHb和SWCNTs復合物的熒光光譜變化情況。隨著 L 抗壞血酸濃度的增加，BHb及其與SWCNTs復合物的發(fā)射波長出現(xiàn)了輕微的藍移，熒光強度也隨之降低。這表明血紅蛋白向高鐵血紅蛋白的轉(zhuǎn)化過程是可逆的。在還原過程中，BHb的結(jié)構(gòu)逐漸恢復，高鐵血紅蛋白被還原回亞鐵血紅蛋白，導致色氨酸殘基和酪氨酸殘基周圍的微環(huán)境疏水性更強[45]，從而降低了復合物體系的熒光強度。具體來說，隨著 L. 抗壞血酸濃度增加，空白BHb的熒光強度相比初始值降低了 47.3% ，而SWCNTs/BHb、（6，5）-SWCNTs/BHb和（8，3）-SWCNTs/BHb中BHb的熒光強度相比初始值分別降低了 31.1% 、 35.0% 和 28.2% 。研究結(jié)果表明，盡管 L -抗壞血酸能夠促使高鐵血紅蛋白的還原，但并不能完全恢復到其原始狀態(tài)。

程進行近紅外熒光光譜檢測（圖7）。從圖7中可以看出，在 L. 抗壞血酸作用下，（6，5）-SWCNTs、（8，3）-SWCNTs和未分離SWCNTs的熒光強度基本恢復到初始水平，說明氧化還原導致的熒光強度的改變是可逆的，其中 （8，3）-SWCNTs/BHb的熒光強度在 L 抗壞血酸濃度為 0～4.3μmol/L 范圍內(nèi)急劇下降，表明其對于L-抗壞血酸的濃度響應更加敏感。（8，3）-SWCNTs有望作為近紅外熒光探針用于體內(nèi) L -抗壞血酸的檢測。

3結(jié)論

本文采用光譜分析技術(shù)，深人探討了SWCNTs與BHb在形成SWCNTs/BHb、（6，5）-SWCNTs/BHb及（8，3）-SWCNTs/BHb復合物時，兩者間的相互作用機制，并分析了復合物在氧化還原反應過程中熒光特性的動態(tài)變化。研究表明，與SWCNTs的結(jié)合改變了BHb的二級結(jié)構(gòu)以及熒光基團所處的局部環(huán)境，進而觸發(fā)了BHb的熒光淬滅。未分離的SWCNTs因其自淬滅效應，導致了BHb熒光猝滅程度及 a -螺旋結(jié)構(gòu)破壞的加劇。在氧化條件下，通過 H₂O₂ 的作用，亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，這一過程不僅改變了BHb中氨基酸殘基周圍的極性環(huán)境，也影響了SWCNTs的介電性質(zhì)。隨著 H₂O₂ 濃度的遞增，BHb與SWCNTs的熒光強度均呈現(xiàn)上升趨勢。相反地，在抗壞血酸的還原作用下，上述變化得以逆轉(zhuǎn)，BHb與SWCNTs的熒光強度基本恢復至初始水平，這一發(fā)現(xiàn)證實了SWCNTs/BHb復合物在氧化還原過程中的可逆性。本研究不僅為血紅蛋白氧化還原狀態(tài)的監(jiān)測開辟了新的途徑，還為開發(fā)基于SWCNTs的近紅外光學傳感器提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Spectroscopic Analysis of the Redox Processes of the Ensemble between Chiral Single-Walled Carbon Nanotubes and Bovine Hemoglobin Complex

TAN Huixin1， CHEN Jing1，DONG Kaixiang1，LIU Yan1， ZHANG Hongyang2，HU Ping2， ZHANG Min1

（1.ShanghaiFrontiers Science CenterofOptogenetic Techniques forCellMetabolism，Schoolofharmacy，EastChina

UniversityofScience and Technology，Shanghai 20o237，China;2.Shanghai KeyLaboratoryofFunctionalMaterials Chemistry， School of Chemistry and Molecular Engineering，East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

Abstract： In this paper， unseparated single-walled carbon nanotubes （SWCNTs） and two types of single-chiral SWCNTs，namely （6，5）-SWCNTs and （8，3）-SWCNTs，were used to associate with bovine hemoglobin （BHb）， respectively.The interaction between SWCNTs and BHb，and the spectralresponses corresponding to the redox process of SWCNTs/BHb composites， were analyzed.Theresults indicated that thebinding with SWCNTs led to changes in the secondary structure of BHb， with the largest structural alteration observed for unseparated SWCNTs，resulting in fluorescence quenching and a -helix loss in BHb.During the oxidation process， the fluorescence intensity of both BHb and SWCNTs at their maximum emission wavelengths increased;Whereas，during the reduction processthe fluorescence intensityofBHb and SWCNTs gradually recovered to the original state.The findings ofthis study provide insight into monitoring the redox process of hemoglobin.

Key words： single-walled carbon nanotubes; bovine hemoglobin; interaction; fluorescence spectrum; redox

（責任編輯：張欣）