半枝蓮治療惡性胸腔積液作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對接研究

陳宇 駱學(xué)新

[摘要]?目的?通過網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接方法，探究半枝蓮治療惡性胸腔積液（malignant?pleural?effusion，MPE）的作用機制。方法?利用IBW?SPSS?Modeler?18.0軟件對紹興第二醫(yī)院中醫(yī)科門診治療MPE處方信息進行數(shù)據(jù)挖掘，使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺篩選半枝蓮有效活性成分，利用GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取MPE疾病靶點，通過Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。利用DAVID在線平臺生成基因本體（gene?ontology，GO）功能富集分析圖和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路富集分析圖。使用PyMol和AutoDock?vina軟件將半枝蓮有效活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接驗證。結(jié)果?半枝蓮治療MPE的主要活性成分有18種，其中黃芩黃酮、3-甲基鼠李素、薺苧黃酮、黃芩素、木犀草素等為主要活性成分，EGFR、AKT1、HIF1A、SRC等為核心靶點蛋白。結(jié)論?半枝蓮?fù)ㄟ^多成分、多靶點作用于MPE，為進一步研發(fā)MPE治療藥物提供理論基礎(chǔ)和新的切入點。

[關(guān)鍵詞]?半枝蓮；惡性胸腔積液；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接技術(shù)

[中圖分類號]?R285??????[文獻標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.016

Network?pharmacology?and?molecular?docking?of?the?Sculellaria?barbata?in?the?treatment?of?malignant?pleural?effusion

CHEN?Yu1，?LUO?Xuexin2

1.The?Second?School?of?Clinical?Medicine，?Zhejiang?Chinese?Medical?University，?Hangzhou?310053，?Zhejiang，?China;?2.Traditional?Chinese?Medicine?Department，?Shaoxing?Second?Hospital，?Shaoxing?312000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?Scutellaria?barbata?in?treating?malignant?pleural?effusion?（MPE）?through?network?pharmacology?and?molecular?docking?methods.?Methods?Using?IBW?SPSS?Modeler?18.0?software?to?data?mine?the?malignant?pleural?effusion?prescription?information?in?the?Outpatient?Department?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Shaoxing?Second?Hospital.?Using?the?Chinese?medicine?system?pharmacology?database?and?analysis?platform?screening?lotus?effective?active?ingredients?and?related?targets，?malignant?pleural?effusion?disease?targets?in?GeneCards，?OMIM，?DisGeNET?database，?the?network?diagram?of?“TCM-component-target”?was?constructed?through?Cytoscape3.9.1?software.?The?DAVID?online?platform?was?used?to?generate?the?gene?ontology?（GO）?and?functional?enrichment?analysis?map?and?the?pathway?enrichment?analysis?map?of?Kyoto?Encyclopedia?of?Gene?and?Genomes?（KEGG）.?Using?PyMol?and?AutoDock?vina?software?to?test?the?molecular?docking?of?the?active?components?with?core?target?proteins.?Results?There?are?18?main?active?ingredients?in?the?treatment?of?MPE?with?Scutellaria?barbata，?among?which?baicalin，?3-methylrhamnosum，?shepherds?purse?flavonoids，?baicalin，?luteolin，?etc.?are?the?main?active?ingredients，?and?EGFR，?AKT1，?HIF1A，?SRC，?etc.?are?the?core?target?proteins.?Conclusion?Banzhilian?acts?on?malignant?pleural?effusion?through?multiple?components?and?targets，?providing?a?theoretical?basis?and?new?entry?point?for?the?further?development?of?drugs?for?the?treatment?of?malignant?pleural?effusion.

[Key?words]?Sculellaria?barbata;?Malignant?pleural?effusion;?Network?pharmacology;?Molecular?docking?technology

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮的干燥全草，性寒，味辛、苦，歸肺、肝、腎經(jīng)，主要化學(xué)成分為黃酮類、多糖類、二萜類等，主要功效為清熱解毒、化瘀利尿[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明半枝蓮中的黃酮類成分具有多種藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等，是潛在的天然抗氧化劑，臨床應(yīng)用前景廣泛[2]。

惡性胸腔積液（malignant?pleural?effusion，MPE）是指原發(fā)于胸膜的惡性腫瘤或其他惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜而引起的胸腔積液[3]。在我國MPE的發(fā)生率約占胸腔積液的29.6%[4]。多項研究表明半枝蓮對MPE具有有效治療作用。MPE患者機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，MPE的形成與過量自由基引起脂質(zhì)過氧化使毒性液體滲入胸膜腔有關(guān)[5-6]。半枝蓮具有較強的抗氧化作用，可有效清除1–二苯基–2–三硝基苯肼、2–聯(lián)氮–二銨鹽等自由基[7]。金志超[8]以半枝蓮、葶藶子等自擬中藥消水方，通過實驗發(fā)現(xiàn)消水方可減少MPE模型小鼠的MPE生成量，延長小鼠的生存時間。李佩文經(jīng)過長期臨床實踐，認為半枝蓮具有化瘀利水、抗腫瘤的功效，可有效治療MPE[9]。沈敏鶴善用半枝蓮、沙參、麥冬等為基礎(chǔ)方治療MPE，起到養(yǎng)肺陰而不戀邪，消懸飲而不傷正的功效[10]。因此探測半枝蓮對MPE的有效藥物成分及作用潛力對后續(xù)藥物研發(fā)具有重要意義。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，將半枝蓮主要藥物活性成分與MPE核心靶點進行對接分析，為深入研究半枝蓮治療MPE提供新思路和理論依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??數(shù)據(jù)挖掘

選取2021年1月至2023年1月就診于紹興第二醫(yī)院駱學(xué)新中醫(yī)門診的MPE患者96例。其中男38例、女58例，平均年齡（51.36±13.29）歲。利用IBW?SPSS?Modeler?18.0軟件進行數(shù)據(jù)挖掘；利用Excel軟件對收集的處方進行中藥頻數(shù)分析。

1.2??半枝蓮成分收集與篩選

以“半枝蓮”或“banzhilian”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional?Chinese?Medicines?Systems?Pharmacology?Platform，TCMSP）查詢半枝蓮的化學(xué)成分。首先以生物利用度（oral?bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選，再利用Swiss?ADME平臺以胃腸道吸收得分為“high”，類藥性至少通過2個“Yes”為條件篩選藥物活性成分。

1.3??MPE疾病靶點的收集

在GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中以“Malignant?Pleural?Effusion”為關(guān)鍵詞，檢索并篩選MPE作用的相關(guān)基因。

1.4??半枝蓮活性成分-MPE靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny?2.1在線工具對藥物活性成分和疾病靶點基因取交集，得到共同靶點交集基因。將其導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建交集靶點蛋白相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape3.9.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，篩選出核心靶點，并繪制“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5??京都基因與基因組百科全書通路富集與基因本體生物過程分析

利用DAVID在線平臺對共同靶點交集基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路分析和基因本體（gene?ontology，GO）分析（P<0.05為篩選條件），對KEGG通路富集進行可視化分析并繪制氣泡圖，GO分析按基因數(shù)進行可視化分析并繪制氣泡圖。

1.6??分析對接驗證

利用AutoDock?vina軟件，將1.4項中的藥物活性成分進行拓撲分析，篩選出度值排名前5位的活性成分與篩選出的MPE核心靶點進行分子對接。

2??結(jié)果

2.1??中藥頻數(shù)分析

96首治療MPE中藥方中共有134味藥，使用頻率排名前6的中藥見表1，其中使用頻次最高的中藥為半枝蓮。

2.2??半枝蓮活性成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，且利用Swiss?ADME平臺以GI?absorption得分為“high”，DL至少通過2個“Yes”作為篩選條件，得到18條半枝蓮有效活性成分，見表2。

2.3??靶點基因的收集和整理

選取在GeneCards數(shù)據(jù)庫中>中位數(shù)6.3的MPE靶點基因，合并OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中靶點基因，共得到879條MPE相關(guān)靶點基因。

2.4??構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)半枝蓮藥物活性成分和MPE相關(guān)靶點繪制韋恩圖，獲取87個共同靶點基因，即半枝蓮治療MPE的潛在靶點。通過Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，根據(jù)度值排名發(fā)現(xiàn)半枝蓮治療MPE的核心靶點可能是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/?threonine-protein?kinase，AKT1）、表皮生長因子受體（epidermal?growth?factor?receptor，EGFR）、非受體酪氨酸激酶（sarcoma?receptor?coactivator，SRC）、腫瘤缺氧信號通路的中樞因子（hypoxia?inducible?factor?1-alpha，HIF1A）等，并繪制核心靶點篩選過程，見圖1。將半枝蓮有效活性成分與共同靶點基因匹配，繪制“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。結(jié)果顯示半枝蓮?fù)ㄟ^多成分、多靶點作用于MPE。

2.5??生物功能和通路富集分析

GO分析結(jié)果顯示半枝蓮作用于MPE靶基因的生物過程（biological?progress，BP）主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質(zhì)自磷酸化等，見圖3。分子功能（molecular?function，MF）主要涉及三磷酸腺苷結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等，見圖4。細胞組成（cellular?component，CC）主要涉及胞外區(qū)、大分子復(fù)合物、核質(zhì)等，見圖5。KEGG通路富集結(jié)果見圖6，通路主要包括癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol?3?kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein?kinase?B，Akt?）信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路等，提示以上可能是半枝蓮作用于MPE的主要通路。

2.6??分子對接驗證

將黃芩黃酮、3-甲基鼠李素、薺苧黃酮、黃芩素、木犀草素分別與AKT1、EGFR、SRC、HIF1A進行分子對接。所有對接結(jié)果結(jié)合能均<-5，對接結(jié)果較好，其中分子對接結(jié)果較好的有薺苧黃酮與AKT1（結(jié)合能-5.81）、3-甲基鼠李素與EGFR（結(jié)合能-5.4）等。分子對接三維結(jié)果見圖7和圖8，分子對接表面模型見圖9和圖10。此結(jié)果進一步確認了網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測結(jié)果的置信度。

3??討論

MPE在中醫(yī)屬于“懸飲”“癖飲”等范疇[11]?！督饏T要略》記載：“飲后水流脅下，咳唾引痛，謂之懸飲?！彪m然MPE的診療日趨精準(zhǔn)，但目前的藥物治療仍存在單靶點、單通路、毒副作用、耐藥等問題。因此，尋求多靶點、多途徑、低副反應(yīng)、療效確切的抗腫瘤藥物或方法是目前MPE的研究熱點。

本研究通過使用生物信息技術(shù)，構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，篩選得到半枝蓮治療MPE的主要活性成分有18種，其中黃芩黃酮、3-甲基鼠李素、薺苧黃酮、黃芩素、木犀草素具有較高的度值和相關(guān)性。已有研究表明黃芩黃酮在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性作用，黃芩黃酮可作用于特定的腫瘤細胞誘導(dǎo)自噬相關(guān)死亡[12]；3-甲基鼠李素具有有效的抗炎、抗氧化特性，可通過miR-34a/Notch-1信號通路誘導(dǎo)人乳腺癌細胞凋亡[13]；薺苧黃酮可緩解機體氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白，改善機體能量代謝[14]；黃芩素可抑制SW480細胞增殖，誘導(dǎo)細胞皺縮并發(fā)生凋亡[15]；木犀草素與腫瘤發(fā)生、細胞發(fā)育、死亡密切相關(guān)[16]。在分子對接結(jié)果中，EGFR、AKT1、HIF1A、SRC等靶點具有較高的結(jié)合力。AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中高度同源亞型的一種，EGFR是表皮生長因子家族的第一位成員[17]；AKT1和EGFR都具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、分裂、凋亡等多個過程[18]。Yapeng等[19]對80例晚期肺腺癌MPE患者使用表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal?growth?factor?receptor?tyrosine?kinase?inhibitor，EGFR-TKI）聯(lián)合內(nèi)皮抑素治療效果顯著高于對照組。AKT1、EGFR靶點可聯(lián)合作用于抑制細胞凋亡過程、參與細胞存活途徑來治療MPE。

SRC是非受體酪氨酸激酶，同樣具有調(diào)控癌基因的作用[20]。Ahandoust等[21]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)和細胞外結(jié)構(gòu)域的膜突蛋白（moesins，MSN）在促癌信號中呈相反作用，過表達MSN可增加SRC的活性。這表明可通過調(diào)控MSN來影響SRC通路進而治療MPE。HIF1A可作為轉(zhuǎn)錄基因調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，其下游的靶基因參與血管新生、糖酵解等多種細胞功能，MPE中HIF1A相關(guān)的診斷及潛在的治療靶點有待進一步挖掘[22-23]。Quanlei等[24]在64個個體生物芯片研究中發(fā)現(xiàn)miR-195-5p、miR-182-5p對良MPE具有明顯的鑒別診斷作用，而HIF1A的mRNA和蛋白質(zhì)的表達下調(diào)。因此miR-195-5p、miR-182-5p可能是通過干預(yù)HIF1A參與MPE的病理過程。

通過GO分析發(fā)現(xiàn)半枝蓮作用于MPE主要的生物過程涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質(zhì)自磷酸化等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示半枝蓮治療MPE的重要信號通路包括癌癥相關(guān)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路等。Li等[25]發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者接受一線化療或靶向治療后，胸腔積液中EGFR突變率高達88.5%，EGFR基因突變的患者較無突變患者EGFR-TKI治療療效好，EGFR基因是否突變可作為TKI治療的重要預(yù)測因子[26-27]。EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路對于指導(dǎo)臨床選擇EGFR-TKI治療MPE具有重要意義。分子對接結(jié)果顯示半枝蓮藥物活性成分小分子均與作用靶點完成較好對接，進一步驗證了半枝蓮可有效作用于MPE的猜想。

目前關(guān)于半枝蓮治療MPE的研究更多是復(fù)方研究，但在MPE的臨床治療中半枝蓮單藥應(yīng)用廣泛。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘和生物信息技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)半枝蓮可通過多組分、多靶點、多途徑治療MPE，為后續(xù)MPE的相關(guān)研究及臨床防治奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–04–26）

（修回日期：2024–01–31）