年齡相關肝病中的肝臟細胞異質性研究進展

李清鈺 廖春雨 趙思羽 原玉柱 趙永睿 肖莉 孫麗新

[摘要]?年齡相關肝病是成年人群中發(fā)病率隨著年齡增加呈指數(shù)級增長的一系列肝臟相關疾病。肝臟細胞異質性是指年齡相關肝病患者體內的多種肝臟細胞的衰老表現(xiàn)形式不同，具體表現(xiàn)為蛋白質、生物標志物表達水平及細胞功能等方面的差異。隨著全球老齡化的到來，慢性肝病發(fā)病率增加，肝臟細胞衰老在多種慢性肝病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。靶向消除衰老肝臟細胞或抑制衰老相關分泌表型可顯著改善相關疾病?，F(xiàn)對近年來肝臟細胞衰老及相關疾病聯(lián)系的最新研究進展進行綜述。

[關鍵詞]?細胞衰老；慢性肝病；細胞異質性

[中圖分類號]?R963????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.027

隨著機體的衰老，肝臟的生物結構與功能不斷退化，年齡相關肝病發(fā)病率增加。研究發(fā)現(xiàn)年齡相關肝病患者體內的多種肝臟細胞（肝細胞、肝竇內皮細胞、肝星狀細胞及庫普弗細胞）衰老表現(xiàn)形式不同，具體表現(xiàn)為蛋白質和生物標志物表達水平及細胞功能等方面的差異，即肝臟細胞異質性，但其相關疾病的具體機制與聯(lián)系尚不清楚。本文就肝臟細胞衰老在相關疾病發(fā)生與發(fā)展中的作用進行綜述，以期為延緩肝臟衰老及相關疾病治療提供新靶點和新思路。

1??年齡相關肝臟疾病

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic?fatty?liver?disease，NAFLD）已成為我國最常見的慢性肝病，年齡是NAFLD進展中密切相關的因素之一[1]。NAFLD包括單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic?steatohepatitis，NASH）及相關的肝纖維化和肝硬化[2]。一項研究對患有NAFLD/NASH的人群進行肝臟活檢和廣泛的特征分析，結果表明NAFLD/NASH患者體內多種衰老肝臟細胞增加[3]。同樣的多項研究表明，在肝纖維化[4]、肝硬化[5]和肝細胞肝癌（hepatic?cell?carcinoma，HCC）[6]中，年齡均是高風險因素。此外，年齡也是酒精性肝?。╝lcoholic?liver?disease，ALD）[7]、病毒性肝炎[8]等慢性肝病的影響因素之一。由此推測，肝臟細胞衰老可能在慢性肝病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2??相關疾病中的肝臟細胞異質性

2.1???肝細胞

肝細胞是肝臟基本功能單位肝小葉中主要的實質細胞，也是肝臟功能的主要承擔者。衰老肝細胞發(fā)生形態(tài)、功能及表觀遺傳修飾等方面的變化。衰老肝臟中肝細胞數(shù)量減少，體積增加[9]。隨著年齡增長，NRF2信號減退相關的氧化還原失衡會拮抗Wnt/β-catenin信號通路，激活FoxO、p53相關信號通路，從而削弱肝細胞增殖[10]。NASH患者體內可見球形肝細胞，說明肝細胞發(fā)生變性，即微管破裂和嚴重損傷，表明肝細胞損傷可能推動NASH進展[11]。

衰老肝細胞的衰老相關標志物表達增加，發(fā)生G1/S期細胞周期阻滯。衰老肝細胞中細胞周期抑制因子p16Ink4a、p21及p53表達增加，衰老相關的β-半乳糖苷酶和異染色質蛋白1β表達增加，氧化應激來源的脂質過氧化產物和脂滴積累，活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）增加[9]。乙型肝炎病毒（hepatitis?B?virus，HBV）可上調肝細胞中p16和p21水平，促進Rb蛋白活化[12]。NAFLD小鼠的肝細胞中p16、p53、p21及衰老相關的β-半乳糖苷酶的表達水平上調[13]。此外，NAFLD患者的肝細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent?kinases?4，CDK4）水平升高，而CDK4抗性C/EBPα-S193A小鼠則不會隨著年齡的增長而發(fā)生肝脂肪變性，故抑制CDK4可能是慢性肝病治療新途徑[14]。因此，改善衰老肝細胞周期阻滯可能成為慢性肝病的潛在治療策略。

衰老肝細胞釋放白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）及基質金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinase，MMP）等衰老相關分泌表型（senescence-associated?secretory?phenotype，SASP）[15]。HBV和丁型肝炎病毒（hepatitis?D?virus，HDV）陽性肝硬化及HCC患者的肝細胞中TNF-α和IL-6水平升高，且HBV陽性HCC患者的肝細胞過表達MMP-9和低表達TIMP-1和TIMP-3，從而獲得更高的侵襲潛力[12]。由此推測，衰老肝細胞的SASP加重慢性肝病，而抑制SASP成分分泌可能有助于緩解病情。

衰老肝細胞自噬功能下降，蛋白質穩(wěn)態(tài)喪失。氧化和錯誤折疊的蛋白質及其聚集體的積累可引發(fā)細胞蛋白質毒性，如脂褐素積累和ROS產生增加，從而進一步抑制自噬，形成惡性循環(huán)[16]。NAFLD小鼠的肝細胞自噬水平下調，表現(xiàn)為LC3II/LC3I比率降低、自噬底物p62蛋白積累及線粒體自噬相關蛋白Fundc1表達減少[13]。因此，維持肝細胞自噬水平可能有助于延緩NAFLD進展。

2.2??肝竇內皮細胞

肝竇內皮細胞（hepatic?sinusoidal?endothelial?cell，LSEC）是肝臟中主要的非實質細胞，也是肝竇內壁的組成單位。衰老LSEC中細胞間黏附分子-1（intercellular?cell?adhesion?molecule-1，ICAM-1）和血管性血友病因子（von?Willebrand?Factor，vWF）等介導偽毛細血管化的標志物表達增加，小窩蛋白-1、參與調控肝細胞再生的無翅型MMTV整合位點家族成員2（wingless-related?MMTV?integration?site?2，Wnt2）及肝細胞生長因子（hepatocyte?growth?factor，HGF）表達減少[17]。衰老LSEC發(fā)生偽毛細血管化，表現(xiàn)為窗孔變小、數(shù)量減少及內皮增厚，這些變化與竇周基底層形成和細胞外基質（extracellular?matrix，ECM）在竇周隙中的沉積增加有關。偽毛細血管化導致LSEC內吞減弱，大分子清除率降低，這可能與清道夫受體功能受損相關[17]。偽毛細血管化的LSEC可激活靜止的肝星狀細胞（hepatic?stellate?cell，HSC）使其轉化為肌成纖維細胞，導致肝纖維化發(fā)生[18]；說明衰老LSEC偽毛細血管化是慢性肝病發(fā)展的關鍵步驟，維持LSEC的正常表型和功能可抑制NASH向肝纖維化的發(fā)展。另外，在LSEC中阻斷ICAM-1可抑制腫瘤細胞在體內外的粘附與遷移，提示下調衰老LSEC中ICAM-1表達，抑制LSEC偽毛細血管化，有助于延緩HCC進展[19]。

TNF-α、IL-1、IL-6等SASP成分在衰老LSEC中的表達相對增加[20]。與其他衰老肝臟細胞相比，p16INK4a主要在衰老LSEC中表達[21]。年齡相關的氧化應激上調LSEC中ROS水平，且由于抗氧化酶血紅素加氧酶-1的表達減少，衰老LSEC更易受氧化應激的損害[22]。

自噬對于LSEC穩(wěn)態(tài)維持十分重要，而衰老相關的氧化應激可導致LSEC自噬失調，然而自噬失調也會削弱其處理氧化應激的能力，從而加重肝纖維化，形成惡性循環(huán)[23]。NASH患者體內的LSEC自噬失調上調趨化因子、細胞因子及黏附分子的表達，進而促進肝臟炎癥、內皮-間質轉化及肝纖維化過程[24]。因此，維持LSEC自噬水平可能有助于延緩肝纖維化進展。

2.3??HSC

HSC是位于Disse間隙內的周細胞。迄今為止，衰老對HSC影響的相關研究較少，但HSC激活與肝纖維化發(fā)病及進展的聯(lián)系一直是近年的研究熱點。正常情況下HSC處于靜止狀態(tài)，在肝損傷或衰老肝細胞誘導下被激活，活化的HSC釋放富含纖維蛋白的納米級囊泡，這是肝纖維化與肝硬化發(fā)展的關鍵啟動過程[13]?；罨腍SC高表達α-平滑肌肌動蛋白和結蛋白，并分泌過量的ECM成分，如膠原蛋白和纖連蛋白，導致ECM過度沉積，進而驅動肝纖維化進展[25]。衰老肝細胞中SIRT1的年齡依賴性下降激活NLRP3炎癥小體炎癥通路，進而驅動HSC活化，導致老年ALD小鼠的嚴重肝纖維化[26]。而衰老的HSC分泌MMP，消化基質金屬蛋白和膠原蛋白，從而減少ECM沉積，以限制與逆轉肝纖維化[25]。因此，誘導HSC衰老可能是抑制肝纖維化發(fā)生與發(fā)展的有益機制。但是，衰老HSC還表達SASP相關成分，其似乎在NAFLD進展為HCC的過程中起關鍵作用[27]。

衰老HSC自噬水平下調。而自噬可抑制活化HSC釋放纖維化細胞外囊泡，進而減輕肝纖維化[25]，故上調HSC自噬水平可能是肝纖維化治療策略。

2.4??庫普弗細胞

庫普弗細胞位于肝竇腔內，是肝臟常駐巨噬細胞中最具代表性的免疫細胞，參與感染和大分子吞噬的先天免疫反應。盡管庫普弗細胞激活常見于肝脂肪變性、NASH及肝纖維化等大多數(shù)慢性肝病，但與HSC類似，衰老對庫普弗細胞影響的研究并不多[28]。衰老對巨噬細胞的影響包括數(shù)量增加，在含有T、B細胞的大淋巴結構中分布增加，吞噬、自噬作用減弱，并呈現(xiàn)促炎狀態(tài)[29-30]；細胞因子分泌增加，如IL-6，但TNF-α、Mrc1、Arg1及IL-10的表達在衰老庫普弗細胞中未發(fā)生變化[20]。

3??衰老肝臟細胞作為疾病治療靶點

3.1??靶向消除衰老肝臟細胞

嵌合抗原受體（chimeric?antigen?receptor，CAR）-T細胞通過靶向消除表面高表達尿激酶型纖溶酶原激活物受體的衰老肝臟細胞，可改善CCl4誘導或NASH模型小鼠的肝纖維化和肝功能，表明Senolytic?CAR-T細胞對不同病因的肝纖維化均具有治療作用[31]。BET家族蛋白質降解劑通過減少非同源末端連接加劇DNA雙鏈斷裂，并上調自噬基因表達，消除肥胖小鼠肝臟中衰老HSC，從而抑制HCC的發(fā)展[27]。但在WT小鼠經達沙替尼+槲皮素給藥被清除衰老HSC后，顯示出更多的纖維結締組織增生，表明衰老HSC的清除將加重肝纖維化；與之相反，誘導活化HSC衰老則有益于肝纖維化消退[25，32]。由此可知，活化HSC在不同慢性肝病中所發(fā)揮的作用不同，對其進行深入探究將有助于對不同慢性肝病患者進行針對性治療。另外，衰老LSEC在體內仍然執(zhí)行包括抗炎、內吞、分泌促肝細胞再生因子及維持HSC表型等重要功能。通過基因工程手段靶向清除高表達p16INK4a的衰老LSEC后，由于沒有新的LSEC來填補空缺，反而誘發(fā)了肝臟纖維化的發(fā)生[33]。因此，并非所有衰老肝臟細胞的清除均有利，衰老肝臟細胞清除治療的靶向性顯得尤為重要。

3.2??延緩肝臟細胞衰老

可溶性環(huán)氧化物水解酶/環(huán)氧合酶-2雙重抑制劑PTUPB可通過SIRT1抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強肝細胞自噬，進而延緩肝細胞衰老，從而減輕NAFLD；且PTUPB對肝細胞衰老的延緩作用可進一步抑制HSC活化，從而發(fā)揮肝纖維化治療作用[13]。白藜蘆醇激活SIRT1或過表達SIRT1和過表達胰島素樣生長因子1可促進p53去乙酰化，抑制核p53與早老素相互作用；進而減輕氧化應激引發(fā)的肝細胞過早衰老，維持LSEC開窗，從而改善肝脂肪變性與纖維化[34]。然而，p53作為DNA損傷的細胞周期檢查點，其被抑制可能會增加細胞癌變與腫瘤發(fā)生的概率，故針對p53進行治療的強度和時間需要精準把控[35]。另外，單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞核RNA測序（snRNA-seq）分析表明，熱量限制通過調節(jié)肝臟細胞的ATG基因表達可激活自噬以抑制肝臟細胞衰老，故熱量限制可能為未來年齡相關肝病治療新途徑[36]。

3.3??抑制衰老肝臟細胞SASP

甘露聚糖結合凝集素可直接與HSC細胞表面低密度脂蛋白受體相關蛋白1相關的鈣網蛋白相互作用，通過上調哺乳動物的雷帕霉素/p53/p21信號通路誘導活化HSC衰老，使其增殖減弱、ECM和SASP成分合成與分泌減少，從而促進肝纖維化消退[32]。然而，盡管誘導HSC衰老對于減輕肝纖維化有益，但誘導活化的HSC永久衰老可能會阻礙對于維持肝臟結構與功能至關重要的傷口愈合反應和ECM維持，故誘導HSC衰老進行肝纖維化治療的強度和時間是需要考慮的重要問題[37]。CO依賴性SIRT1激活促進三四脯氨酸包含在應激顆粒中，進而下調肝細胞中SASP成分纖溶酶原激活物抑制劑-1水平，從而減輕肝細胞衰老與NAFLD[38]。但SASP種類繁多，且衰老肝臟細胞并未被清除仍可繼續(xù)分泌SASP成分，故此治療策略僅可改善癥狀，需與前兩種治療策略相結合以期達到協(xié)同治療效果。

4??總結與展望

在與年齡相關肝臟疾病中，肝臟細胞表現(xiàn)出異質性，肝實質細胞和LSEC具有衰老特征，而HSC和庫普弗細胞雖然數(shù)量增加且被激活，但并未發(fā)生較多的衰老相關變化。肝臟細胞衰老是一把“雙刃劍”，適度的細胞衰老有益于肝臟結構與功能的維持，并可抑制肝臟細胞癌變與腫瘤的發(fā)生，但衰老肝臟細胞的積累則可能是慢性肝病發(fā)生與發(fā)展的驅動力。此外，近年來scRNA-seq/snRNA-seq成為高通量組學技術的熱點，其可從基因組學、轉錄組學及蛋白質組學多角度更準確地檢測衰老細胞中多種衰老標志物的組合，這有益于衰老細胞異質性的深入研究與疾病個性化治療。

綜上，肝臟細胞衰老與年齡相關肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展關系密切，靶向消除衰老肝細胞、延緩肝臟細胞的衰老及抑制衰老肝臟細胞SASP等治療策略的使用可有效延緩年齡相關肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展進程；但其之間復雜的機制與關系仍亟待闡明，以肝臟細胞衰老為靶點進行深入探究或成為慢性肝病治療的新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–09–02）

（修回日期：2024–02–02）