油莎豆塊莖高水平表達(dá)CePIP1;1基因的克隆與分析

關(guān)鍵詞：油料作物；水通道蛋白；質(zhì)膜內(nèi)在蛋白；亞細(xì)胞定位；表達(dá)分析

中圖分類號：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

水通道蛋白（aquaporin， AQP）隸屬于古老的主要內(nèi)在蛋白（major intrinsic protein， MIP）超家族，是一類高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的膜內(nèi)在蛋白[1]。在高等植物中，AQP 家族可分為質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic protein， PIP）、液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic protein， TIP）、類根瘤26 膜內(nèi)在蛋白（NOD26-like intrinsic protein，NIP）、未鑒定膜內(nèi)在蛋白（X intrinsic protein， XIP）和堿性小分子膜內(nèi)在蛋白（small basic intrinsicprotein， SIP）等五大類[2-6]。其中，PIP 包含PIP1和PIP2 兩個(gè)亞類，是介導(dǎo)細(xì)胞間水分跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ繹1， 7]。

油莎豆（Cyperus esculentus L.）俗稱虎堅(jiān)果，是一種起源于非洲和地中海沿岸的新型草本油料作物[8]。與油菜、大豆、花生等傳統(tǒng)油料作物不同，油莎豆以收獲營養(yǎng)組織——地下塊莖為主要經(jīng)濟(jì)目標(biāo)，是迄今唯一已知在塊莖中高水平積累油脂（24%～35%）的作物[9-12]。油莎豆塊莖營養(yǎng)豐富，除富含油脂外，還含有25%～45%的淀粉、15%～30%的糖、5%～10%的蛋白質(zhì)、8%～10%的膳食纖維以及豐富的維生素C/E 和礦物質(zhì)[13]。更重要的是，油莎豆具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、發(fā)展?jié)摿Υ?、每畝產(chǎn)油量高、適合機(jī)械化等特點(diǎn)，便于在不擠占現(xiàn)有耕地的情況下利用沙化邊際土地增加我國的食用油和飼料原料供給，滿足國家的戰(zhàn)略需求[14-15]。雖然如此，至今仍對油莎豆的遺傳背景、產(chǎn)油和適應(yīng)機(jī)制知之甚少?；诤嘶蚝腿~綠體DNA 序列的進(jìn)化分析顯示，油莎豆隸屬禾本目莎草科莎草屬，其與同屬香附子的分化時(shí)間約在560 萬年前，在此之后油莎豆進(jìn)化出產(chǎn)油的塊莖[8， 16-18]。已報(bào)道的油莎豆染色體數(shù)目差異很大，介于54～156 條之間[19-20]，暗示其可能存在多種倍型。與其他油料作物相比，油莎豆的分子生物學(xué)研究比較薄弱。除CeWRI1、CeWRI4、CeEPSPS 、CeALS 、CeSMP1～5 、CeOLE1～6 、CeTIP1;1、CeTIP2;1 等少數(shù)基因得到克隆和鑒定外[9-12， 17-18， 21-23]，至今未見有關(guān)PIP 基因的報(bào)道。通過分析公共數(shù)據(jù)庫中的蛋白組數(shù)據(jù)[16]，本團(tuán)隊(duì)鑒定到1 個(gè)在塊莖中高水平表達(dá)的PIP 基因，根據(jù)序列特征和進(jìn)化關(guān)系將其命名為CePIP1;1。本研究主要報(bào)道該基因的基因結(jié)構(gòu)、序列特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)特性及蛋白亞細(xì)胞定位，以期為下一步的功能分析及油莎豆遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 基因克隆和表達(dá)分析所用油莎豆品系為熱研3 號[9]；亞細(xì)胞定位分析所用材料為本氏煙草[24]。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌DH5α 和農(nóng)桿菌GV3101（內(nèi)含輔助質(zhì)粒pSoup-P19）感受態(tài)、亞細(xì)胞定位載體pNC-Cam1304-SubN 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 生化試劑、酶及試劑盒詳見文獻(xiàn)[17]。

1.1.4 數(shù)據(jù)庫資源 油莎豆的基因組數(shù)據(jù)下載于CNGBdb （ https：//db.cngb.org/search/assembly/CNA0051961/）數(shù)據(jù)庫；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/703731）數(shù)據(jù)庫；蛋白組數(shù)據(jù)下載于ProteomeXchange/PRIDE （ https：//www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD021894）數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 CePIP1;1 的鑒定 采用上述蛋白組數(shù)據(jù)鑒定塊莖表達(dá)PIP 基因，其中，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索采用Proteome Discoverer（v2.4.1.15）軟件；采用HISAT 2 軟件將上述轉(zhuǎn)錄組讀段比對到基因組，基因相對定量采用FKPM（ fragments perkilobase of exon per million fragments mapped）法。

1.2.2 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 參照文獻(xiàn)[18]，分別提取油莎豆不同發(fā)育時(shí)期塊莖的總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后合成cDNA 第一鏈用于基因克隆與表達(dá)分析。

1.2.3 基因克隆與載體構(gòu)建 根據(jù)油莎豆的基因組和轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物對CePIP1;1F/R（5?AATCCACTCATCATCTCCAC?3/5?AAGTAACAACACAGCAAGGC?3） 和CePIP1;1HF/R（ 5?AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGGAGGCGAAGGAGCAGG?3/5?GGTCTCAGCAGACCACAAGTTTATCTGCTCTTGAATGGG?3 ）， 分別用于CePIP1;1 全長cDNA 的分離和亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建：首輪PCR 擴(kuò)增以CePIP1;1F/R 為引物，塊莖來源的cDNA 作為模板； 第二輪PCR 以CePIP1;1HF/R 為引物，稀釋100 倍的首輪PCR產(chǎn)物作為模板，具體PCR 反應(yīng)和載體構(gòu)建流程詳見文獻(xiàn)[17]。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 基因結(jié)構(gòu)分析采用GSDS（v2.0）（http：//gsds.gao-lab.org/）在線軟件；蛋白的理化特性和保守結(jié)構(gòu)域分析分別采用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）和NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線軟件；亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分別采用WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort. html）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_ sopma.html ） 和SWISS-MODEL （ https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件；多序列比對和進(jìn)化樹的構(gòu)建分別采用ClustalX（v1.83）和MEGA（v6.06）軟件；跨膜螺旋區(qū)根據(jù)與已結(jié)晶菠菜PIP2;1[7]的序列比對進(jìn)行界定。

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析 將pNC-Cam1304-CePIP1;1 和陽性質(zhì)粒pNC-HbPIP2;3-RFP[25]轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，參照喬雪瑩等[24]的方法制備浸染液及進(jìn)行煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化48 h 后用激光共聚焦顯微鏡Zeiss LMS880 進(jìn)行熒光觀察。

1.2.6 熒光定量分析 參照文獻(xiàn)[9]，以CeUBL5作為內(nèi)參，利用引物對CePIP1;1Fq/Rq（5?CCCCCTCCAAGTGTGCCT?3/5?GGTTGATGTGTCCACCTGAGATT?3）進(jìn)行熒光定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 塊莖表達(dá)CePIP1;1 蛋白的鑒定及編碼區(qū)序列的分離

為鑒定油莎豆塊莖中的主要PIP 基因，本研究首先分析了已有的蛋白組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CePIP1;1在新鮮收獲的成熟塊莖、吸水48 h 的塊莖以及萌發(fā)的塊莖中均有較高的豐度，暗示其可能在塊莖發(fā)育過程中起重要作用。為此，采用RT-PCR 技術(shù)對該基因867 bp 的編碼區(qū)（CDS）序列進(jìn)行分離（圖1），并將其克隆到亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pNC-Cam1304-CePIP1;1。通過將克隆到的序列比對到基因組，發(fā)現(xiàn)其與基因的對應(yīng)區(qū)域完全一致。CePIP1;1 位于Scaffold9，基因全長3321 bp，含有3 個(gè)內(nèi)含子（圖2A）。

2.2 CePIP1;1 生物信息學(xué)分析序列分析

顯示，CePIP1;1 編碼288 個(gè)氨基酸，理論分子量為30.76 kDa，等電點(diǎn)為8.82，不穩(wěn)定系數(shù)為32.95，總平均疏水指數(shù)為0.384，脂肪族指數(shù)為95.28，推測其為穩(wěn)定的堿性疏水型蛋白。CDD 分析顯示蛋白的第47～276 位為MIP 結(jié)構(gòu)域（pfam00230）（圖2B）。CePIP1;1 與SoPIP2;1 的序列一致性為65.70%，均擁有6 個(gè)跨膜螺旋（即TM1–6）、2 個(gè)半螺旋（即HB 和HE）以及2 個(gè)位于半螺旋頂端的NPA 基序；ar/R 選擇性濾器（F-H-T-R）和對應(yīng)于SoPIP2;1 S115 的磷酸化位點(diǎn)和L197 門控位點(diǎn)完全一致；在5 個(gè)Froger 位點(diǎn)中，僅P1 存在差異，SoPIP2;1 為M-S-A-F-W，而CePIP1;1 為Q-S-A-F-W 。相比于SoPIP2;1 ，CePIP1;1 具有延伸的N 端和較短的C 端，同時(shí)缺乏對應(yīng)于SoPIP2;1 S188、S274 和S277 的磷酸化位點(diǎn)，符合PIP1 亞類的基本特征（圖2C）。進(jìn)化分析顯示，CePIP1;1 與水稻的PIP1 亞類聚在一起，與OsPIP1;2、OsPIP1;1、OsPIP1;3 的一致性分別為90.30%、87.90%和85.50%（圖2D）。SOPMA分析顯示，CePIP1;1 的α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占32.64%、19.10%、2.78%和45.49%（圖2E）。以SoPIP2;1 作為模板的同源建模進(jìn)一步表明CePIP1;1 含有6 個(gè)跨膜螺旋，同時(shí)也顯示其可以形成同源四聚體（圖2F）。

2.3 CePIP1;1 亞細(xì)胞定位分析

WoLF PSORT 預(yù)測顯示CePIP1;1 定位在細(xì)胞膜。為驗(yàn)證該結(jié)果， 本研究以先前報(bào)道的HbPIP2;3[25]作為陽性對照，將含pNC-HbPIP2;3-RFP 和pNC-Cam1304-CePIP1;1 的農(nóng)桿菌工程菌等量混合后微量注射煙草葉片。共聚焦觀察結(jié)果顯示， EGFP-CePIP1;1 的綠色熒光信號與HbPIP2;3-RFP 的紅色熒光信號高度重合，這表明CePIP1;1 確實(shí)是定位在細(xì)胞膜（圖3）。

2.4 CePIP1;1基因表達(dá)分析

為揭示CePIP1;1 的時(shí)空表達(dá)特性，首先利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其在幼嫩葉片、成熟葉片、葉鞘、根、芽尖、匍匐莖、播后40 d 塊莖、播后85 d塊莖和播后120 d 塊莖等主要組織和發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，該基因在所分析的樣本中均有較高水平的表達(dá)，其中，豐度最高的是葉鞘，最低的是芽尖；與幼嫩葉片相比，基因在成熟葉片中的表達(dá)下調(diào)；在塊莖發(fā)育過程中，呈現(xiàn)典型的鐘形趨勢（圖4a），峰值出現(xiàn)在發(fā)育中期。為進(jìn)一步揭示基因表達(dá)與塊莖含水量之間的關(guān)系，采用qRT-PCR 技術(shù)分析其在塊莖起始形成1 d（S1）、20 d（S2）、25 d（S3）和35 d（S4）的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，該基因呈先升后降的趨勢（圖4b），這與塊莖水分動力學(xué)趨勢基本一致。

3 討論

AQP 最先因其高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性而得名，是介導(dǎo)細(xì)胞間水分跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，因此，AQP 介導(dǎo)的水分平衡理所當(dāng)然成為植物生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[1， 7]。至今，AQP 基因已在擬南芥、水稻、菠菜、番木瓜、蓖麻、麻瘋樹、木薯、橡膠樹等不同植物中得到了克隆和鑒定[1-7， 22-25]。

油莎豆隸屬莎草科，與禾本科植物具有較近的親緣關(guān)系[9-11， 17-18]。眾所周知，禾本科包含水稻、小麥、玉米等重要糧食作物，其種子是人類的主要淀粉來源。油莎豆不開花或開花不結(jié)實(shí)，主要通過地下塊莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖[15]。不同于其他塊根塊莖類植物，油莎豆除積累淀粉外，還可以積累高達(dá)35%的油脂[10， 12]，這使其成為研究營養(yǎng)組織高水平積累油脂的理想模型[15， 26]。據(jù)研究，油莎豆的塊莖生長迅速，起始后約35 d 即可成熟[9-10]。在成熟前，塊莖外觀為白色，含水量約為85%；25 d 后開始逐漸變黃，含水量約75%；35 d 時(shí)外觀呈現(xiàn)褐色，含水量降低到45%[9]，這表明水分平衡對于塊莖的發(fā)育乃至干物質(zhì)（包括油脂）的積累至關(guān)重要。事實(shí)也是如此，有的研究僅在成熟塊莖的蛋白組中就鑒定出多個(gè)AQP基因[16]，本研究報(bào)道的CePIP1;1 就是其中之一。

與其他PIP 基因類似，CePIP1;1 含有3 個(gè)內(nèi)含子，其編碼蛋白包含保守的MIP 結(jié)構(gòu)域，分子量為30.76 kDa。CePIP1;1 具有較高的脂肪族指數(shù)（95.28），且總平均疏水指數(shù)gt;0、等電點(diǎn)gt;7.0、不穩(wěn)定系數(shù)為lt;40，屬于穩(wěn)定的堿性疏水型蛋白。在水稻的13 個(gè)PIP 蛋白中，CePIP1;1 與OsPIP1;2的序列一致性最高（90.30%），遠(yuǎn)高于與SoPIP2;1的65.70%；在進(jìn)化分析中也確實(shí)與PIP1 亞類聚在一起；此外，相比于SoPIP2;1 和水稻PIP2 蛋白，CePIP1;1具有較長的N 端和較短的C 端，這些結(jié)果都支持其歸為PIP1 亞類。在煙草葉片中，CePIP1;1 定位在細(xì)胞膜，因其具有SoPIP2;1 類似的ar/R 選擇性濾器（F-H-T-R）以及2個(gè)典型的NPA 基序，推測CePIP1;1在體內(nèi)具有高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性。雖然如此，不少PIP1 在蟾蜍卵母細(xì)胞和酵母體外體系中沒有或僅有微弱的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性， 其中包括OsPIP1;1、OsPIP1;2 和OsPIP1;3[27-28]。深入研究發(fā)現(xiàn)，PIP1 在體外無水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性主要與其不能有效定位到細(xì)胞膜有關(guān)。譬如當(dāng)OsPIP1;3在蟾蜍卵母細(xì)胞和水稻原生質(zhì)過表達(dá)時(shí)，其編碼蛋白被發(fā)現(xiàn)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但當(dāng)其與OsPIP2;2 共表達(dá)時(shí)卻定位在細(xì)胞膜，且具有高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性[29]。因此，推測CePIP1;1可通過與煙草和油莎豆中的PIP2蛋白互作有效定位到細(xì)胞膜，繼而介導(dǎo)水分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)時(shí)空表達(dá)分析，CePIP1;1 屬于組成型表達(dá)基因，廣泛參與包括塊莖在內(nèi)的不同組織的水分平衡：在幼嫩葉片和塊莖成熟前高水平表達(dá)，與其快速的細(xì)胞分裂與擴(kuò)張以及活躍的生理代謝是相適應(yīng)的[24]；在塊莖成熟過程中下調(diào)，與其含水量降低和脫水抗性的獲得是一致的[9-10]；在葉鞘和匍匐莖中的高水平表達(dá)則與其重要的疏導(dǎo)特性是相適應(yīng)的。

綜上，本研究報(bào)道了1個(gè)油莎豆PIP 基因，并明確了其基因結(jié)構(gòu)、序列特征、進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位及表達(dá)特性，這為深入揭示塊莖的水分平衡機(jī)制及油莎豆遺傳改良奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。