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    巴西橡膠樹CCaMK基因家族成員的鑒定和表達分析

    2017-03-31 19:57:05肖小虎隋金蕾戚繼艷秦云霞黃亞成
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:表達分析

    肖小虎 隋金蕾 戚繼艷 秦云霞 黃亞成 唐朝榮

    摘 要 鈣/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶(CCaMK,calcium- and calmodulin-dependent protein kinase)是一種鈣離子結(jié)合蛋白,在鈣信號傳導(dǎo)過程中起重要作用。本研究以已發(fā)表的CCaMK序列作為檢索序列,對橡膠樹和其他5種植物(木薯、水稻、楊樹、蓖麻和擬南芥)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行全面搜索,鑒定得到6個CCaMK基因,其中包括一個橡膠樹CCaMK基因,命名為HbCCaMK1。序列分析發(fā)現(xiàn):5種植物的CCaMK氨基酸序列同源性較高,為73%~94%?;蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),HbCCaMK1和所分析的其他植物CCaMK一樣均,含有6個內(nèi)含子、1個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和3個EF-hand結(jié)構(gòu)域;從結(jié)構(gòu)和進化上看,HbCCaMK1和蓖麻、木薯2種植物的CCaMK具有較近的親緣關(guān)系;在表達方面,HbCCaMK1在橡膠樹根中表達豐度最高,其次為樹葉和花;另外,HbCCaMK1的表達還與葉片發(fā)育、真菌侵染和低溫脅迫有關(guān)。

    關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ;CCaMK ;基因家族 ;結(jié)構(gòu)與進化 ;表達分析

    中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A Doi:10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.004

    所有生物都依賴于復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控自身代謝和對環(huán)境的適應(yīng)性。在眾多信號傳遞途徑中,鈣離子作為細胞內(nèi)第二信使發(fā)揮著重要作用[1-3]。一些鈣離子感受器或鈣離子結(jié)合蛋白能夠識別瞬間鈣離子濃度的變化,進而誘導(dǎo)下游蛋白質(zhì)磷酸化方式和基因表達模式的改變[2],實現(xiàn)植物對外界環(huán)境變化的應(yīng)答。在植物中己鑒定的鈣離子結(jié)合蛋白包括4種:鈣調(diào)素(calmodulins,CaM)、鈣依賴性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPKs)、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CCaMKs)和鈣調(diào)磷酸酯酶B類蛋白。CCaMK基因編碼的蛋白包含4個結(jié)構(gòu)域,分別為N-末端結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、CaM結(jié)合域和EF手性結(jié)構(gòu)域。在植物中,已經(jīng)從煙草、玉米、百合、百脈根、豌豆等多種植物中鑒定出CCaMK。研究發(fā)現(xiàn),CCaMK廣泛參與植物光信號傳導(dǎo)、花藥發(fā)育、寄主與病原的互作及逆境脅迫等多種生物學(xué)過程[4-7]。但在橡膠樹和木薯等大戟科植物中卻未見CCaMK相關(guān)研究的報道。本研究以已發(fā)表的CCaMK氨基酸序列為探針,對橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻共6種植物的基因組數(shù)據(jù)進行全面搜索,鑒定得到6個CCaMK基因家族成員,其中橡膠樹、木薯、水稻等植物中僅有一個成員,而擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn)CCaMK成員。利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫對這些家族成員的基因結(jié)構(gòu)、進化和表達水平等進行了系統(tǒng)分析。本研究結(jié)果將有助于深入了解橡膠樹CCaMK的生物學(xué)功能。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    本實驗室Solexa測序所用材料為巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)‘熱研7-33-97,除了根取自組培苗(由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華玉偉老師贈送的‘熱研 7-33-9組培苗)外,其他組織(包括膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花)均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊的正常割膠橡膠樹(開割2年以上);不同發(fā)育時期的橡膠樹葉片取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所種質(zhì)資源圃,為1年生的‘熱研7-33-97嫁接苗;乙烯利處理的材料主要來自海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊,品系為熱研7-33-9,正常開割樹(3天1刀,不涂乙烯利刺激),用 1.5% 乙烯利分別在不同時間處理橡膠樹,相應(yīng)4個時間點為0、3、12和 24 h,具體方法參照文獻[8]進行。

    網(wǎng)上測序數(shù)據(jù)來自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra),包括不同組織(PRJNA201084)、真菌侵染(Corynespora cassiicola tolerance,PRJNA179126)、高低溫干旱脅迫(PRJNA182078)和乙烯利處理(PRJNA182079)等的數(shù)據(jù),詳細信息參見數(shù)據(jù)庫中實驗說明。

    1.2 方法

    1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析

    為了全面鑒定橡膠樹、擬南芥、楊樹、水稻、木薯和蓖麻的CCaMK基因家族成員,從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數(shù)據(jù)庫下載了6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù);以已發(fā)表的CCaMK序列為探針[4-7],對6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行搜索,得到候選CCaMK基因家族成員,利用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對候選基因的結(jié)構(gòu)域進行分析;再利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫的在線軟件Pepstats(http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/)對基因的等電點和分子量進行批量分析。

    1.2.2 基因結(jié)構(gòu)與進化分析

    利用在線軟件GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對橡膠樹和其他5種植物CCaMK基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進行分析。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建橡膠樹和其他5種植物的CCaMK氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,采用Neighbor-Joining方法進行分子系統(tǒng)學(xué)分析,進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗。

    1.2.3 基因的表達模式分析

    利用本實驗室和NCBI的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對橡膠樹CCaMK基因家族成員的表達模式進行分析[9]:將NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)中與橡膠樹相關(guān)的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載到本地服務(wù)器,去除低質(zhì)量序列,利用程序RSEM進行表達分析[10]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CCaMK基因的鑒定與序列分析

    本研究以已發(fā)表的玉米等植物的CCaMK基因氨基酸序列為探針,利用tblastn搜索橡膠樹、木薯、蓖麻、水稻、楊樹和擬南芥6種植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù),共鑒定得到了6個CCaMK基因(表1),橡膠樹、木薯、水稻和蓖麻中均僅有1個,楊樹中有2個,但在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)同源基因,將橡膠樹的CCaMK基因命名為HbCCaMK1。通過序列分析發(fā)現(xiàn),橡膠樹HbCCaMK1基因編碼510個氨基酸,分子量為57 ku,等電點為5.6,有6個內(nèi)含子。通過氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn),橡膠樹CCaMK含有多個保守的蛋白激酶和EF-hand結(jié)構(gòu)域(圖 1)。序列分析發(fā)現(xiàn),5種植物的CCaMK氨基酸序列同源性較高,為73%~94%。

    2.2 基因結(jié)構(gòu)和進化分析

    利用在線軟件GSDS對橡膠樹和其他4種植物CCaMK基因的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進行了分析,并結(jié)合各家族成員在進化上的相互關(guān)系進行作圖(圖 2)。分析發(fā)現(xiàn),所分析的5種植物各家族成員,都含有6個內(nèi)含子、1個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和3個EF-hand 結(jié)構(gòu)域,這和先前研究的CCaMK結(jié)構(gòu)特征一致[4-7]。橡膠樹、木薯和蓖麻3種植物CCaMK基因外顯子/內(nèi)含子的組織結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域在外顯子上的相對位置具有更高的相似性,在進化樹上HbCCaMK1和MeCCaMK1聚在一起,說明它們具有更近的親緣關(guān)系。另外,研究還發(fā)現(xiàn),楊樹的PtCCaMK2基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的相對位置與該物種中的另一個成員PtCCaMK1以及其他物種的CCaMK成員相比均具有較大差異,推測該基因在進化過程中發(fā)生了較大的變異。

    2.3 橡膠樹CCaMK基因的表達分析

    利用本實驗室現(xiàn)有的Solexa測序數(shù)據(jù)對HbCCaMK1在不同組織、不同葉片發(fā)育時期和乙烯利處理下的表達模式進行了分析。結(jié)果(圖 3)表明,HbCCaMK1在根中的表達豐度最高,遠高于其他組織,在花中的表達豐度也較高,而在膠乳中的表達豐度最低;隨葉片的發(fā)育,HbCCaMK1的表達呈明顯的上升趨勢;在乙烯利處理前后,HbCCaMK1在膠乳中的表達豐度都特別低,幾乎不表達。

    本研究還利用NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對HbCCaMK1基因在不同實驗條件下的表達情況進行了分析。結(jié)果(圖4)表明,HbCCaMK1在所分析的樹葉、樹皮和膠乳等3種組織中表達豐度普遍較低,其中在葉片中的表達遠低于樹皮,這與利用本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果不太一致(圖3);乙烯利處理前后,HbCCaMK1在膠乳中的表達都很低,這與基于本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致;C. cassiicola侵染和低溫脅迫處理可以誘導(dǎo)HbCCaMK1在葉片中的表達。

    3 討論

    已有研究發(fā)現(xiàn),CCaMK廣泛參與植物的生長發(fā)育及與逆境脅迫相關(guān)的多種生物學(xué)過程[4-7]。本研究通過對6種不同植物進行全基因組搜索,共鑒定出6個CCaMK基因家族成員,其中在擬南芥中未能搜索到CCaMK。在結(jié)構(gòu)域方面,CCaMK和CDPK相比主要少了第一個EF-hand結(jié)構(gòu)域[11],推測CCaMK與CDPK具有較近的親緣關(guān)系和類似的功能,而在擬南芥中,CDPK家族基因的某些成員可能承擔(dān)了與其它植物中CCaMK基因一樣的功能。通過基因結(jié)構(gòu)和進化方面的比較,發(fā)現(xiàn)HbCCaMK1與木薯、蓖麻CCaMK基因具有更近的親緣關(guān)系,這與橡膠、木薯、蓖麻同屬大戟科的結(jié)論一致。本研究充分利用現(xiàn)有的Solexa測序數(shù)據(jù)對HbCCaMK1的表達情況進行全面的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HbCCaMK1在根中的表達豐度遠遠高于其他組織(圖3)。有研究發(fā)現(xiàn),CCaMK基因在苜蓿和百脈根中的表達豐度也最高,并且發(fā)現(xiàn)CCaMK基因在植物與細菌、真菌共生過程中起作用,同時與根瘤的形成有關(guān)[7,12]。據(jù)此可推測,HbCCaMK1很可能在橡膠樹和根際微生物(細菌、真菌)的共生中起作用,同時在根瘤形成中發(fā)揮重要作用。在葉片發(fā)育過程中,HbCCaMK1的表達豐度呈上升趨勢,說明該基因可能與橡膠樹葉片的光信號應(yīng)答及傳導(dǎo)有一定的相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn),HbCCaMK1的表達受真菌侵染和低溫等逆境脅迫處理的誘導(dǎo),表明該基因可能參與相關(guān)應(yīng)答反應(yīng),在其它植物的CCaMK基因研究中也有類似的報道[4-7]。

    另外,本實驗室的高通量數(shù)據(jù)已被成功應(yīng)用于橡膠樹基因組數(shù)據(jù)的分析以及橡膠樹蔗糖合成酶基因家族的相關(guān)分析,相關(guān)結(jié)果已發(fā)表在Nature Plants[13]和 Febs Journal[9],這進一步證實了本研究結(jié)果的可靠性。綜上所述,本研究首次從橡膠樹中鑒定出一個CCaMK基因HbCCaMK1,并從基因結(jié)構(gòu)、進化和表達等方面對其進行了初步分析,研究結(jié)果將為進一步研究HbCCaMK1在橡膠樹中的功能奠定基礎(chǔ)。

    參考文獻

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