• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    信號分子與葉銹菌誘導下小麥病程相關蛋白1基因的表達分析

    2015-10-20 21:04栗小英等
    江蘇農業(yè)科學 2015年9期
    關鍵詞:表達分析原核表達

    栗小英等

    摘要:病程相關蛋白1(pathogenesis-related proteins1,PR1)是一類以基因家族形式存在的重要病程相關蛋白,在前期研究中,在小麥抗葉銹病近等基因系材料TaLr35中成功獲得了1個小麥病程相關蛋白1基因TaLr35PR1,具有植物防御體系中的SCP保守結構域。利用生物信息學方法進一步明確,該基因含有信號肽,定位于細胞間隙,可能含有跨膜結構域,相對分子量為17.3 ku,與多個植物病程相關蛋白1序列具有較高同源性;利用半定量RT-PCR方法結合genetools、SPSS軟件分析TaLr35PR1基因表達模式,結果表明,信號分子水楊酸(salicylic acid,SA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)明顯誘導該基因表達,且用信號分子預處理后接種葉銹菌,基因表達量明顯增加;構建了TaLr35PR1基因的原核表達載體pEASY-PR1,在大腸桿菌中高效表達分子量約為17 ku的融合蛋白,明確其最佳誘導條件為在 0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導8 h。

    關鍵詞:葉銹菌;信號分子;病程相關蛋白1;表達分析;原核表達

    中圖分類號: Q756文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2015)09-0028-04

    收稿日期:2014-08-27

    基金項目:國家重點基礎研究發(fā)展計劃(編號:2013CB127700);河北省自然科學基金(編號:C2012204005)。

    作者簡介:栗小英(1988—),女,河北張家口人,碩士研究生,研究方向為分子植物病理。E-mail:506112516@163.com。

    通信作者:王海燕,副教授,主要從事分子植物病理學研究。E-mail:ndwanghaiyan@163.com。植物在長期的進化過程中,為了抵抗病害對自身生長的不良影響,在一定程度上發(fā)展了感受生物脅迫信號的機制,通過體內的信號傳導途徑,激發(fā)轉錄因子與相應的順式作用元件的結合,進而啟動特定基因的轉錄和表達,最后導致植物對脅迫作出反應[1]。病程相關(pathogenesis-related,PR)蛋白質在信號傳遞與脅迫應答中起調節(jié)作用。PR 基因的最初發(fā)現主要是由于它們在植物受到病原物侵染時會大量表達。PR蛋白質除了在抗病反應中發(fā)揮重要作用外,在植物抗衰老、傷害、非生物逆境脅迫和激素處理,以及正常生長中也發(fā)揮重要作用。在PR蛋白家族中,PR1是一類重要的蛋白,但對其作用機制以及靶物質還尚不了解[2]。水楊酸(salicylic acid,SA)或乙烯(ethylene) 可誘導PR1基因的表達,常被作為系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)的分子標記[3],因此,PR1基因編碼的蛋白質成為目前的研究熱點。

    PR1蛋白最早從煙草中發(fā)現,隨后從許多單子葉和雙子葉植物中鑒定出PR1基因。PR1是一類可經病原菌和SA大量誘導表達的PR蛋白,蛋白分子量為14~17 ku,有酸性和堿性,大多呈堿性。PR1 被證實具有抗病毒擴散、限制真菌入侵和保護植物抵御逆境脅迫等功能[4-5]。Agrawal 等研究證明OsPR1a、OsPR1b基因受茉莉酸(jasmonic acid,JA)、SA、過氧化氫(H2O2)、蛋白酶抑制劑斑蝥素(cantharidin,CN)、草藻滅(endothall,EN)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的誘導,對光傷害及磷酸酶抑制劑等環(huán)境脅迫和化學處理作出反應[6-8]。楊德翠等研究發(fā)現,PR1基因表達量與水楊酸的積累密切相關,表達量的升高增強了牡丹對柱枝孢葉斑?。–ylindrocladium canadense)的抗性,并且發(fā)現該病侵染牡丹 24 h 后,PR1基因的表達顯著提高[9]。

    小麥(Triticum aestivum)是重要的糧食作物,是全世界一半以上人口的主糧。小麥生產經常受到病蟲害的威脅,尤其由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起的小麥葉銹病是威脅全球小麥穩(wěn)產高產的主要病害之一。小麥抗葉銹病基因Lr35,其抗性從2葉期開始表達,6葉期完全表達,是1個十分有效的成株抗葉銹病基因。筆者前期利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術從含有小麥抗葉銹病基因Lr35的近等基因系材料TcLr35中獲得1個PR1基因的cDNA全長,命名為TaLr35PR1[10]。本研究擬利用半定量RT-PCR明確TaLr35PR1基因在受葉銹菌和信號分子誘導后核酸水平的表達特征,為進一步探究其在生物與非生物脅迫過程中的功能及了解生物脅迫應答機理提供線索。

    1材料與方法

    1.1試驗材料

    供試植物材料為攜帶小麥抗葉銹病基因Lr35的回交6代近等基因系材料TcLr35,及與其遺傳背景相同的感病親本“Thatcher”;供試小麥葉銹菌菌株為07-10-426-1(PHNT),該菌株對TcLr35呈非親和反應(反應型為1型),對Thatcher呈親和反應(反應型為4型)。各種限制性內切酶、質粒、膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶購自生工生物工程上海(股份)有限公司;原核表達載體pEASYTM-E1購自北京全式金生物技術有限公司。

    1.2試驗方法

    化學試劑處理:參考Zambounis等的方法[11]配制50 μmol/L SA溶液、50 μmol/L ABA溶液,噴灑于六葉期的成株小麥葉片表面至溶液滴下,于18~25 ℃、光照時間10~14 h的溫室培養(yǎng),處理3 d后,開始接種葉銹菌07-10-426-1(孢子萌發(fā)率為80%以上),以未接菌處理為對照,分別在接種后0、6、12、24、36、48、72、120 h取0.1 g葉片,液氮速凍后于-80 ℃儲藏備用。

    1.3總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

    采用Bio-Flux公司的BIOZOL試劑盒提取小麥各處理樣品總RNA,按照寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄酶試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。反轉錄合成的模板直接用于PR1基因的半定量RT-PCR分析。

    1.4小麥TaLr35PR1生物信息學分析

    利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(http://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.)、ProtScale(http://expasy.org/tools/)和Spidey(http://www. nebi. nlm. nih. Gov/spidey)在線工具完成對基因結構模式的分析。分別利用SOPMA程序和Phyre2在線工具完成對蛋白質二級、三級結構的預測。

    1.5小麥TaLr35PR1基因表達模式分析

    根據TaLr35PR1基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)設計特異引物TaLr35PR1-F、TaLr35PR1-R(TaLr35PR1-F:5′- CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′;TaLr35PR1-R:5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′),以小麥中組成型表達的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank登錄號:AF251217;GAPDH-F:5′-AACTGCCTTGCTCCTCTTGC-3′;GAPDH-R:5′-CTGTTGTCACCCTGGAAGTCA-3′)作為內標基因。以葉銹菌、ABA,SA處理后不同時間點的小麥葉片的cDNA為模板進行半定量RT-PCR。PCR反應條件為:94 ℃預變性1 min;94 ℃變性30 s,51 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán)。每個樣品設3個重復。試驗數據通過genetools軟件得出表達量大小,利用SPSS軟件計算方差和顯著性,綜合進行分析,獲得TaLr35PR1基因的相對表達量。

    1.6小麥TaLr35PR1原核表達載體的構建與誘導表達

    設計原核表達特異引物YTaLr35PR1-F:5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′、YTaLr35PR1-R:5′-CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′;PCR產物與表達載體pEASY-E1進行連接并轉化。首先使用PCR擴增用引物驗證目的片段與載體連接是否成功,再利用上游引物YTaLr35PR1-F和載體自帶T7終止子引物T7terminator(5′-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3′)驗證目的片段插入的方向性,然后轉入表達載體BL21(DE3)感受態(tài)細胞后進行誘導表達。

    2結果與分析

    2.1小麥TaLr35PR1基因特征分析

    ProtScale軟件[12]預測TaLr35PR1編碼的蛋白總體表現為疏水性;SignalP 4.1[13]預測TaLr35PR1氨基酸序列具有信號肽,信號肽酶切位點在第1~24個氨基酸殘基之間。利用 SMART在線軟件對TaLr35PR1基因進行結構分析,結果表明該基因具有保守的抗真菌結構域SCP(圖1);利用Phyre2軟件分析,結果表明該基因由4條α螺旋、4條β折疊構成,呈三明治般的ɑβɑ結構。

    2.2小麥TaLr35PR1基因表達模式

    2.2.1SA誘導葉片中TaLr35PR1基因的表達譜分析50 μmol/L SA脅迫處理后,TaLr35PR1基因表達量在處理 12 h 明顯增加,并達到最大,約為對照組(0 h)表達量的7.6倍;之后隨著時間延長,表達量減少,到120 h又略有增加,約為對照組(0 h)表達量的2.6倍(圖2)。為了明確信號分子與葉銹菌的協(xié)調作用,50 μmol/L水楊酸脅迫處理3 d后,再接種葉銹菌,TaLr35PR1基因表達量在接種12 h極顯著增加并達到最大(P<0.01),約為對照組(0 h)的2.6倍;之后隨著接種時間延長,表達量顯著減少,到120 h又略有增加,約為未接種對照組(0 h)表達量的1.8倍。水楊酸預處理后再接種葉銹菌的表達趨勢與未接菌處理基本一致,但整體表達水平高于未接菌處理,接菌0 h后,TaLr35PR1基因表達量約為未接菌處理5.9倍。上述結果均扣除了Thatcher的表達量。

    2.2.2ABA誘導葉片中TaLr35PR1基因的表達譜分析50 μmol/L ABA脅迫處理后,TaLr35PR1基因表達量在處理 12 h 明顯增加,72 h達到表達高峰,約為對照組(0 h)表達量的3.6倍,至120 h表達量減少(圖3)。為了明確信號分子與葉銹菌的協(xié)調作用,在50 μmol/L脫落酸脅迫預處理后,再接種葉銹菌。結果表明,TaLr35PR1基因表達量在接種12 h后顯著增加,至72 h達到最大(P<0.05),約為未接種對照組(0 h)的1.8倍;之后隨著接種時間延長,表達量稍有減少,整體表達趨勢與未接菌處理一致,但表達量明顯高于未接菌處理;接菌0 h后,TaLr35PR1基因表達量約為脫落酸處理(0 h)的3.2倍。上述結果均扣除了Thatcher的表達量。

    2.3TaLr35PR1基因原核表達載體的構建

    利用pEASY-E1表達試劑盒構建表達載體TaLr35PR1-pEASY,為驗證目的片段是否與載體成功連接,利用YTaLr35PR1-F、YTaLr35PR1-R引物進行PCR擴增,對重組子進行初篩,獲得約420 bp左右的片段,與該引物對TcLr35總RNA的PCR擴增產物大小一致,說明目的基因已經整合到pEASY-E1載體上。為驗證目的片段插入載體的方向是否正確,使用YTaLr35PR1-F、T7terminator重組引物對重組子進行篩選,預期擴增產物為目的片段與載體序列的重組片段,獲得約500 bp左右的片段(圖4),證明插入載體的方向正確。測序結果進一步表明,目的片段插入表達載體的位置和讀碼框正確。

    2.4TaLr35PR1基因的體外誘導表達

    以不同溫度、不同IPTG濃度、不同時間誘導轉化了表達載體pEASY-PR1的大腸桿菌BL21(DE3)。經SDS-PAGE

    分析可見,在25 ℃溫度下,誘導的pEASY-PR1在17 ku左右產生1條新的誘導條帶,大小與理論值推算相符,而在27 ℃溫度下未見明顯誘導條帶(圖5-A);以未經誘導的pEASY-PR1為對照,0.01~0.80 mmol/L IPTG誘導菌體均產生1條約17 ku的新條帶,確定0.80 mmol/L IPTG為最佳的誘導濃度(圖5-B);隨著誘導時間的延長,誘導2 h蛋白表達量增加明顯,6 h至過夜趨于穩(wěn)定,最佳誘導時間為8 h(圖5-C)。結果表明,小麥TaLr35PR1基因在大腸桿菌中得到了高效表達,獲得了分子量約為17 ku的融合蛋白,最佳誘導條件為在0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導8 h。

    3結論與討論

    有報道證明擬南芥在抵抗病原物后的茉莉酸(JA)、SA信號轉導網絡協(xié)調擬南芥抗病性[14]。此外,在病原物侵染前用SA處理擬南芥,發(fā)現可以誘導SAR反應以及PR蛋白的表達,以增強抗病能力[15]。PR1基因能被病菌侵染和信號分子脅迫所誘導[16-17],PR1基因的表達增強了植物抵御病害和其他各種脅迫的能力。機械損傷、植物激素(JA、SA、ET)、蛋白磷酸酶抑制劑斑蝥素(CN)、草藻滅(EN)都能誘導水稻OsPR1a基因的表達[18]。SA介導的SAR反應主要對活體營養(yǎng)型病菌起作用,而JA/ET介導的抗病信號途徑對抵抗腐生型真菌侵染起到作用[19]。棉花的PR3、PR10、GST18基因在轉錄水平上不僅受JA、SA的誘導,而且受棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)誘導后表達水平顯著上調[11]。小麥葉銹菌為典型的活體營養(yǎng)型病菌。本研究旨在明確SA和葉銹菌誘導對TaLr35PR1基因表達的影響,結果發(fā)現TaLr35PR1基因表達受SA單獨誘導;同時,在SA脅迫處理后再接種葉銹菌,TaLr35PR1基因表達趨勢與SA誘導表達趨勢一致,而且SA與葉銹菌協(xié)同作用顯著增加了TaLr35PR1表達量,且其表達量明顯高于葉銹菌單獨誘導。

    ABA是調節(jié)植物生長發(fā)育的一種激素。當植物面臨不利的自然環(huán)境時,植物體內ABA的含量會增加,進而促進植物生長。植物體內存在ABA、非ABA 2種調節(jié)系統(tǒng)[20]。實現這種調節(jié)必須能夠順利完成從刺激到準確反應的一系列信號轉導過程,這主要包括以受體為中心的脫落酸信號的細胞識別、以第二信使為中心的胞內信號轉換,以及以蛋白磷酸化為中心的信號放大與傳導等過程[14]。在前期研究中證明ABA可以誘導病程相關蛋白的表達[21],在本研究中發(fā)現TaLr35PR1基因表達受ABA誘導,而且脫落酸與葉銹菌協(xié)同作用明顯誘導TaLr35PR1基因的表達,而且表達量顯著高于SA和葉銹菌單獨誘導?;?種信號分子對TaLr35PR1基因的誘導表達模式,推測小麥TaLr35PR1基因在參與小麥抗葉銹病防御反應時,可能通過SA、ABA 2種信號途徑,但具體作用機制還需進一步探討。

    水稻、小麥等作物中關于病程相關蛋白從蛋白水平驗證抗病性的研究報道較多。李雪姣等研究發(fā)現,在水稻與白葉枯病菌互作時,病程相關蛋白1家族在接菌后不同時間點、不同生長期都發(fā)揮作用[22];關明俐等的研究有力地證明了不同的病程相關蛋白在水稻與白葉枯病菌互作時發(fā)揮作用[23];此外,牛吉山等應用RT-PCR和cDNA文庫篩選技術,從抗白粉病小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系中分離到1個小麥類甜蛋白基因的全長cDNA,Western分析表明其可能與小麥 6VS/6AL 易位系的抗白粉病性相關[24];余宇克隆得到了小麥類甜蛋白基因的全長序列,并利用原核表達得到純度較高的類甜蛋白[25]。后續(xù)研究將進一步制備單克隆抗體,從蛋白水平分析其表達模式,并分析其他信號分子對該基因的影響,探析信號傳遞途徑。

    參考文獻:

    [1]Fujita M,Fujita Y,Noutoshi Y,et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses:a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J]. Current Opinion in Plant Biology,2006,9(4):436-442.

    [2]Hou M,Xu W,Bai H,et al. Characteristic expression of rice pathogenesis-related proteins in rice leaves during interactions with Xanthomonas oryzae pv. oryzae[J]. Plant Cell Reports,2012,31(5):895-904.

    [3]van Loon L C,van Strien E A. The families of pathogenesis-related proteins,their activities and comparative analysis of PR-1 type proteins[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology,1999,55(2):85-97.

    [4]Cutt J R,Harpster M H,Dixon D C,et al. Disease response to tobacco Mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis-related PR1b gene[J]. Virology,1989,173(1):89-97.

    [5]Rauscher M,Adám A L,Wirtz S,et al. PR-1 protein inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad bean[J]. The Plant Journal,1999,19(6):625-633.

    [6]Agrawal G K,Jwa N S,Rakwal R. A novel rice(Oryza sativa L.) acidic PR1 gene highly responsive to cut,phytohormones,and protein phosphatase inhibitors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,274(1):157-165.

    [7]Agrawal G K,Rakwal R,Jwa N S. Rice(Oryza sativa L.) OsPR1b gene is phytohormonally regulated in close interaction with light signals[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,278(2):290-298.

    [8]Agrawal G K,Rakwal R,Jwa N S,et al. Signalling molecules and blast pathogen attack activates rice OsPR1a and OsPR1b genes:a model illustrating components participating during defence/stress response[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2001,39(12):1095-1103.

    [9]楊德翠,張玉喜,鄭國生. 牡丹病程相關蛋白1基因的克隆及表達分析[J]. 園藝學報,2013,40(8):1583-1590.

    [10]王海燕,劉大群,楊文香,等. TcLr35小麥中病程相關蛋白1基因的克隆及分析[J]. 植物遺傳資源學報,2007,8(1):16-20,29.

    [11]Zambounis A G,Kalamaki M S,Tani E E,et al. Expression analysis of Defense-Related genes in cotton(aossypium hirsutum) after Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum infection and following chemical elicitation using a salicylic acid analog and methyl jasmonate[J]. Plant Molecular Biology Reporter,2012,30(1):225-234.

    [12]Kyte J,Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology,1982,157(1):105-132.

    [13]Nielsen H,Engelbrecht J,Brunak S,et al. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites[J]. Protein Engineering,1997,10(1):1-6.

    [14]Berrocal-Lobo M,Molina A. Arabidopsis defense response against Fusarium oxysporum[J]. Trends in Plant Science,2008,13(3):145-150.

    [15]Edgar C I,Mcgrath K C,Dombrecht B,et al. Salicylic acid mediates resistance to the vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum in the model host Arabidopsis thaliana[J]. Australas Plant Pathology,2006,35(6):581-591.

    [16]Tang Y,Kuang J F,Wang F Y,et al. Molecular characterization of PR and WRKY genes during SA- and MeJA-induced resistance against Colletotrichum musae in banana fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2013,79:62-68.

    [17]Agrawal G K,Jwa N S,Rakwal R. A novel rice(Oryza sativa L.) acidic PR1 gene highly responsive to cut,phytohormones,and protein phosphatase inhibitors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,274(1):157-165.

    [18]von Dahl C C,Baldwin I T. Deciphering the role of ethylene in plant herbivore interactions[J]. Journal of Plant Growth Regulation,2007,26:201-209.

    [19]Glazebrook J. Contrasting mechanism of defence against biotrophic pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology,2005,43:205-227.

    [20]Chinnusamy V,Schumaker K,Zhu J K. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants[J]. Journal of Experimental Botany,2004,55(395):225-236.

    [21]栗小英,高琳,張艷俊,等. 葉銹菌及信號分子誘導小麥 TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表達分析[J]. 中國農業(yè)科學,2014,47(14):2774-2783.

    [22]李雪姣,范偉,牛東東,等. 水稻病程相關PR1家族蛋白質在葉片生長及與白葉枯病菌互作反應中的表達[J]. 植物學報,2014,49(2):127-138.

    [23]關明俐,竇世娟,李雪姣,等. 病程相關蛋白質在水稻與白葉枯病菌互作過程中的表達[J]. 中國農業(yè)科學,2013,46(20):4179-4188.

    [24]牛吉山,于玲,陳佩度,等. 小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系葉片cDNA文庫構建及鑒定[J]. 南京農業(yè)大學學報,2001,24(1):5-8.

    [25]余宇. 小麥類甜蛋白TLP基因的克隆與原核表達[D].

    猜你喜歡
    表達分析原核表達
    人FOXA1蛋白的原核表達、純化及蛋白互作分析
    花生AhSOS2基因原核表達載體的構建及表達
    香蕉精品网在线| 亚洲综合色惰| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人美女网站在线观看视频| 观看免费一级毛片| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 99久久中文字幕三级久久日本| a级一级毛片免费在线观看| 久久久久久久精品精品| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品三级大全| 日韩强制内射视频| 国产亚洲最大av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 综合色丁香网| 老司机影院成人| 免费黄色在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人二区视频| 99久久人妻综合| 亚洲三级黄色毛片| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产乱人视频| 亚洲欧美精品专区久久| 国内精品美女久久久久久| 精品一区二区三区视频在线| 日本欧美国产在线视频| 国产视频内射| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品成人在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 美女国产视频在线观看| 中国三级夫妇交换| 亚洲最大成人av| 成人国产av品久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99热这里只有是精品50| 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区有黄有色的免费视频| 在线观看一区二区三区激情| av在线播放精品| freevideosex欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲色图综合在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 精品人妻视频免费看| 只有这里有精品99| 国产成年人精品一区二区| 中文欧美无线码| 国产精品无大码| 国产男人的电影天堂91| 精品久久国产蜜桃| 国精品久久久久久国模美| 色播亚洲综合网| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产男人的电影天堂91| 国产视频首页在线观看| 精品一区在线观看国产| 26uuu在线亚洲综合色| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日韩电影二区| 成人亚洲欧美一区二区av| 1000部很黄的大片| 国产精品成人在线| 深夜a级毛片| 男女国产视频网站| 综合色av麻豆| 69av精品久久久久久| 少妇 在线观看| 国内精品宾馆在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| kizo精华| 国产精品.久久久| 国产精品一区二区性色av| 免费看a级黄色片| 亚洲自拍偷在线| 在线观看国产h片| 嫩草影院入口| 国产精品一区www在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日日啪夜夜爽| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美人与善性xxx| 三级国产精品欧美在线观看| 国产一区二区三区av在线| 97超视频在线观看视频| 国产精品人妻久久久影院| 欧美精品国产亚洲| 国产成年人精品一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 视频中文字幕在线观看| 国产高清有码在线观看视频| av在线蜜桃| 我的老师免费观看完整版| 高清午夜精品一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品无大码| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲精品色激情综合| 天美传媒精品一区二区| 免费黄色在线免费观看| 成人二区视频| 国产乱人偷精品视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 中国美白少妇内射xxxbb| av在线亚洲专区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av免费在线看不卡| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久精品热视频| 成人黄色视频免费在线看| 男人舔奶头视频| 午夜福利高清视频| 黄色一级大片看看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 少妇 在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 在线观看国产h片| 久久久精品欧美日韩精品| 美女主播在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 中文字幕久久专区| 高清欧美精品videossex| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 亚洲自偷自拍三级| av网站免费在线观看视频| 亚洲精品,欧美精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 在线观看一区二区三区| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久久伊人网av| 亚洲色图综合在线观看| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久久久久免费av| 人妻 亚洲 视频| 99久久精品一区二区三区| 黄色一级大片看看| 国产免费福利视频在线观看| 中文欧美无线码| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产淫语在线视频| 波多野结衣巨乳人妻| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲综合色惰| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 男男h啪啪无遮挡| 老司机影院成人| 免费黄色在线免费观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产欧美亚洲国产| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| xxx大片免费视频| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 我的女老师完整版在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美精品国产亚洲| 久久国内精品自在自线图片| av在线app专区| 色综合色国产| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 不卡视频在线观看欧美| 免费av不卡在线播放| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产男人的电影天堂91| 嫩草影院入口| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩人妻高清精品专区| 日韩欧美精品v在线| 久久久午夜欧美精品| 国国产精品蜜臀av免费| 一本久久精品| 嘟嘟电影网在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 精品一区二区免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日韩亚洲欧美综合| 禁无遮挡网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 大陆偷拍与自拍| 少妇丰满av| 2018国产大陆天天弄谢| 国产美女午夜福利| 精品视频人人做人人爽| 三级经典国产精品| 只有这里有精品99| 制服丝袜香蕉在线| 男女边吃奶边做爰视频| 精品久久久久久久末码| 美女视频免费永久观看网站| 国国产精品蜜臀av免费| 国产成人91sexporn| 免费观看无遮挡的男女| 最后的刺客免费高清国语| 成人一区二区视频在线观看| 免费观看在线日韩| 亚洲av男天堂| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品蜜桃在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 高清午夜精品一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 天堂网av新在线| 亚洲最大成人中文| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品蜜桃在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲无线观看免费| 少妇熟女欧美另类| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 成人午夜精彩视频在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 在线观看国产h片| 在现免费观看毛片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品一二三| 精品人妻偷拍中文字幕| 色哟哟·www| 熟女人妻精品中文字幕| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 激情 狠狠 欧美| 天堂俺去俺来也www色官网| 在线播放无遮挡| 久久99精品国语久久久| 亚洲av一区综合| 国产精品伦人一区二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| av免费观看日本| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品久久久久久久久免| av在线亚洲专区| av在线观看视频网站免费| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 久久久欧美国产精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级二级三级毛片免费看| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久国产网址| 久久久久久久久大av| 国产精品一二三区在线看| 日本免费在线观看一区| 男男h啪啪无遮挡| 免费看不卡的av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产老妇女一区| 一级毛片久久久久久久久女| 人人妻人人看人人澡| 一级毛片 在线播放| 国产精品久久久久久精品古装| 大话2 男鬼变身卡| 日韩免费高清中文字幕av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美精品国产亚洲| 欧美成人午夜免费资源| 成人黄色视频免费在线看| 在现免费观看毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 97在线视频观看| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲最大成人中文| 亚洲美女视频黄频| 我要看日韩黄色一级片| videossex国产| 中文字幕久久专区| 久久久久久九九精品二区国产| 成人国产麻豆网| 天天躁日日操中文字幕| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 寂寞人妻少妇视频99o| 一级片'在线观看视频| 午夜爱爱视频在线播放| 国产探花在线观看一区二区| 七月丁香在线播放| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲自拍偷在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 麻豆久久精品国产亚洲av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人免费观看视频高清| 久久精品久久精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区激情| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产男人的电影天堂91| 在线免费观看不下载黄p国产| 特级一级黄色大片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲综合精品二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品国产三级普通话版| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品自拍成人| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品一区二区性色av| 97热精品久久久久久| 特级一级黄色大片| 一级二级三级毛片免费看| 久久这里有精品视频免费| 97超视频在线观看视频| 丝袜喷水一区| 亚洲美女视频黄频| 高清毛片免费看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 少妇熟女欧美另类| 亚洲av国产av综合av卡| 99热6这里只有精品| 国产免费福利视频在线观看| 99久国产av精品国产电影| 免费av不卡在线播放| 国产av国产精品国产| 熟女av电影| 久久精品综合一区二区三区| 久热这里只有精品99| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久成人免费电影| 国产精品蜜桃在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产午夜精品一二区理论片| 一级a做视频免费观看| 日本一本二区三区精品| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日本一本二区三区精品| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲三级黄色毛片| 日韩av免费高清视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲精品成人久久久久久| 国产69精品久久久久777片| 91久久精品电影网| 亚洲成人久久爱视频| 两个人的视频大全免费| 国产亚洲精品久久久com| 熟女电影av网| 亚洲四区av| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 久久久亚洲精品成人影院| 老司机影院成人| 天堂中文最新版在线下载 | 看免费成人av毛片| 久久97久久精品| 久久久久久久久久成人| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品99久久久久久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 国产毛片在线视频| 观看美女的网站| 色5月婷婷丁香| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 久久久久精品久久久久真实原创| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 美女主播在线视频| 国产91av在线免费观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成年人精品一区二区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 最近最新中文字幕免费大全7| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产成人91sexporn| av黄色大香蕉| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产淫语在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 中国国产av一级| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 国产欧美亚洲国产| 久久午夜福利片| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久久末码| 免费观看在线日韩| 国产精品一区www在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产亚洲5aaaaa淫片| 99热全是精品| 成人黄色视频免费在线看| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产爽快片一区二区三区| 少妇人妻 视频| 99久久人妻综合| 亚洲av.av天堂| 观看免费一级毛片| 精品久久久久久久久av| 18+在线观看网站| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品99久久久久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 大码成人一级视频| 波多野结衣巨乳人妻| 舔av片在线| 特级一级黄色大片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲成人av在线免费| 99久久精品国产国产毛片| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜福利网站1000一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产精品国产精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99久久精品一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 简卡轻食公司| 蜜臀久久99精品久久宅男| 免费看日本二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 69av精品久久久久久| 国产老妇女一区| 久久久久网色| 一区二区三区精品91| 久热久热在线精品观看| 久久久成人免费电影| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 十八禁网站网址无遮挡 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产一区二区在线观看日韩| 一级黄片播放器| 永久网站在线| 久久午夜福利片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲最大成人av| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲成色77777| 一级毛片 在线播放| 国产爽快片一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 午夜激情福利司机影院| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 美女cb高潮喷水在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久精品国产亚洲网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久久久亚洲中文字幕| 舔av片在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 高清欧美精品videossex| 在线观看av片永久免费下载| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩制服骚丝袜av| 成人欧美大片| 国产黄片视频在线免费观看| 国产有黄有色有爽视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产 一区精品| 99久久人妻综合| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲,欧美,日韩| 一区二区三区免费毛片| 中文天堂在线官网| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品一及| 另类亚洲欧美激情| 久久97久久精品| 欧美三级亚洲精品| 国产精品一二三区在线看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品一区在线观看国产| 精品酒店卫生间| 亚洲av免费高清在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产久久久一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 婷婷色综合www| 午夜福利在线在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 777米奇影视久久| 日韩成人伦理影院| 好男人视频免费观看在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美3d第一页| 日韩大片免费观看网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久午夜福利片| 日韩一本色道免费dvd| 免费看日本二区| 一本色道久久久久久精品综合| kizo精华| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久久久九九精品二区国产| 99热6这里只有精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 99热6这里只有精品| 久久精品人妻少妇| 国产中年淑女户外野战色| 日韩av在线免费看完整版不卡| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲av国产av综合av卡| 国产视频内射| 深夜a级毛片| 如何舔出高潮| 精品国产三级普通话版| 又爽又黄a免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| 久久精品国产自在天天线| 久久人人爽人人片av| 高清午夜精品一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 国国产精品蜜臀av免费| 晚上一个人看的免费电影| 免费观看在线日韩| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 男女无遮挡免费网站观看| 看非洲黑人一级黄片| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久午夜福利片| 人体艺术视频欧美日本| 毛片女人毛片| av在线蜜桃| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一级黄片播放器| 国产探花极品一区二区| 天美传媒精品一区二区| 免费av观看视频| 大码成人一级视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产免费福利视频在线观看| 在现免费观看毛片| 久久热精品热| 一级av片app| 看非洲黑人一级黄片| videos熟女内射| 在线观看一区二区三区| 99热全是精品| 免费看a级黄色片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 人体艺术视频欧美日本| 国内精品宾馆在线| 真实男女啪啪啪动态图| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久网色| 99精国产麻豆久久婷婷| 插阴视频在线观看视频| 成人免费观看视频高清| av卡一久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一区二区三区免费毛片| 欧美精品一区二区大全| 精品人妻熟女av久视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产视频内射| 成人黄色视频免费在线看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 51国产日韩欧美| 久久久午夜欧美精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| 神马国产精品三级电影在线观看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 在线天堂最新版资源| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久午夜欧美精品| 秋霞在线观看毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 日日啪夜夜撸| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日日啪夜夜撸| 成年av动漫网址| 亚洲av男天堂| 联通29元200g的流量卡|