鄭偉+周濤+李軍+龍登凱+江維克+丁鈴
[摘要] 玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)在植物脫落酸(abscisic acid,ABA)生物合成間接途徑中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。該研究根據(jù)太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆獲得太子參的Pseudostellaria heterophylla玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因,命名PhZEP。對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明PhZEP的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)為1 263 bp,編碼420個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為47.34 kDa,等電點(diǎn)(theoretical pI)為6.64;具有脂質(zhì)蛋白附著點(diǎn)和黃素蛋白單加氧酶的特征性結(jié)構(gòu)域,且在N端含有分泌信號(hào)肽。實(shí)時(shí)熒光PCR分析發(fā)現(xiàn),PhZEP在葉片中表達(dá)量最高,其次是莖和須根;PhZEP在盛花期后10,40 d塊根中的表達(dá)量較高;ABA處理后PhZEP表達(dá)量與對(duì)照組相當(dāng),經(jīng)氟啶酮處理后PhZEP的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。該研究從太子參中分離鑒定了ZEP基因,對(duì)后續(xù)研究其基因的功能特點(diǎn)和解析ABA在太子參生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的遺傳調(diào)控提供研究基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞] 太子參; 玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶; 克?。?表達(dá)分析
[Abstract] Zeaxanthin epoxidase plays an important role in indirect pathway of plant abscisic acid biosynthesis. According to the data of Pseudostellaria heterophylla transcriptome, zeaxanthin epoxidase gene was isolated and named as PhZEP. The results of bioinformatics analysis showed that the coding sequence of PhZEP was 1 263 bp long and encoded 420 amino acids. The putative protein molecular weight was 47.34 kDa and its theoretical isoelectric point was 6.64. The characteristic structure domains were predicted, including binding site of lipoprotein and flavoprotein monooxyenase. A signal peptide was discovered at the N-terminal of amino acids. The Real-time PCR revealed that PhZEP had a higher expression level in leaves than other tissues of P.heterophylla. Highly expressed PhZEP was also observed at 10 d and 40 d tuberous root after flowering. PhZEP presented a different expression after treatment with ABA, fluridone and ABA +fluridone compared to the control. The expression of PhZEP in tuberous root after ABA treatment was close to that in control group, while PhZEP showed significant up-regulation in the fluridone treatment group. In this study, the PhZEP gene from P. heterophylla was cloned and this result has important significance for its functional identification. This research provides a basis for the further analysis on functional mechanism of ABA during development of P. heterophylla.
[Key words] Pseudostellaria heterophylla; zeaxanthin epoxidase; cloning; expression analysis
太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根,是我國(guó)傳統(tǒng)的常用補(bǔ)益中藥,具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺的功效。近年來(lái),太子參的開(kāi)發(fā)利用從臨床藥品不斷延伸到功能性食品和化妝品。太子參塊根的生長(zhǎng)發(fā)育情況是直接影響藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵因素[1],植物塊根的形成和發(fā)育受多種因素影響,其中內(nèi)源激素的調(diào)控是主要因素之一[2-3]。研究認(rèn)為,脫落酸(abscisic acid,ABA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin,CTK)、生長(zhǎng)素(indole-3-acetic acid,IAA)等激素均有利于塊根的膨大[4-6]。
ABA不僅在植物根的生長(zhǎng)、塊根類作物的物質(zhì)運(yùn)輸以及種子休眠、果實(shí)成熟等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)對(duì)植物干旱、低溫等脅迫環(huán)境下的生理活動(dòng)同樣起著重要作用[7-8]。植物體內(nèi)ABA的生物合成途徑一般包括2種:C15直接途徑和C40間接途徑,高等植物主要以C40間接途徑為主。在C40間接途徑合成ABA的過(guò)程中,首先是C40類胡蘿卜素的玉米黃素經(jīng)過(guò)2次環(huán)氧化作用形成紫黃質(zhì),參與該步反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控酶基因是玉米黃素環(huán)氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)基因[9]。ZEP基因除了在ABA生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用外,還在葉片、莖等葉綠體含量比較豐富的組織中參與植物的葉黃素循環(huán)[10]。Audran等[11]研究發(fā)現(xiàn)ZEP基因在植物的各組織均存在表達(dá),但在不同組織中的表達(dá)具有顯著性差異,當(dāng)受到干旱脅迫誘導(dǎo)時(shí),葉片和根中的ABA含量出現(xiàn)同時(shí)增加,對(duì)應(yīng)的ZEP基因的轉(zhuǎn)錄水平只在根中增加,而葉片中轉(zhuǎn)錄水平受晝夜節(jié)律的調(diào)控呈周期性變化。因此,陶均等[12]認(rèn)為ZEP基因可能不是參與ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。
本研究根據(jù)課題組前期構(gòu)建的太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)分析,檢索ABA合成相關(guān)的ZEP基因,采用PCR方法擴(kuò)增ZEP基因的全長(zhǎng)CDS序列,對(duì)所獲得基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時(shí)對(duì)ZEP基因在太子參的不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期以及ABA和氟啶酮(fluridone)處理后塊根中的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)。為研究ZEP基因在藥用植物太子參中ABA的合成途徑中扮演著怎樣的功能對(duì)進(jìn)一步研究太子參塊根發(fā)育過(guò)程的調(diào)控機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 樣品 研究所用材料有2類,一是貴州施秉本地種源采收期的太子參的莖、葉、塊根和須根,樣品采集后存于自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室,將樣品表面泥土沖洗干凈,及時(shí)將塊根分成韌皮部和木質(zhì)部,分別置于10 mL離心管中,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。二是選取長(zhǎng)勢(shì)健壯一致的太子參幼苗采挖后帶回實(shí)驗(yàn)室,盆栽置混合土中(普通土-營(yíng)養(yǎng)土-珍珠巖-蛭石 3∶3∶1∶1),實(shí)驗(yàn)組分別采用200 mL的15 mg·L-1ABA,30 mg·L-1氟啶酮和ABA+氟啶酮溶液(等體積混合溶液)對(duì)不同盆栽太子參進(jìn)行灌根,對(duì)照組噴施等量的清水,其中對(duì)照組分別采收盛花期后10,20,30,40,50,60 d(成熟期)的太子參塊根,實(shí)驗(yàn)組則在60 d(成熟期)采收太子參塊根。每次取大小均勻的塊根經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 太子參總RNA提取、純化與cDNA合成 取-80 ℃保存的太子參樣品適量,于預(yù)冷的研缽中,加液氮,迅速研磨成粉末狀,按RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa,大連)操作說(shuō)明提取總RNA。經(jīng)DNase I(TaKaRa,大連)純化后,用50 μL DEPC水溶解RNA,通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,Nanodrop 2000核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA的濃度和純度。再按反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒(TaKaRa,大連)操作,將已純化的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 PhZEP基因的分離鑒定與克隆 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)下載擬南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa等模式植物的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因,構(gòu)建本地Blast檢索太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),期望值為E-20。將獲得的候選基因在NCBI中進(jìn)行比對(duì)分析,得到1條太子參的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ORF Finder查找太子參ZEP基因的開(kāi)放閱讀框(open readingframe,ORF),根據(jù)所得ZEP基因的CDS序列的信息,利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)CDS序列的全長(zhǎng)引物PhZEP-F:5′-ATAGTAGGAGGGAGTATAGCTGGTG-3′,PhZEP-R:5′-TTAACTCATCAGCAACTCGGGTTTG-3′。以太子參塊根木質(zhì)部總RNA的反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為0.125 μL TaKaRa Ex Taq (5 U·μL-1),2.5 μL 10×Ex Taq Buffer (Mg2+Plus),2 μL dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1),PhZEP-F/R (10 μmol·L-1)各1 μL,1 μL cDNA模板,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min,4 ℃保溫。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,切膠目的條帶,采用Omega膠回收試劑盒回收。取4 μL回收的PCR產(chǎn)物,5 μL連接緩沖液,與1 μL克隆載體pMD19-T(TaKaRa,大連)進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑選陽(yáng)性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。
1.4 PhZEP編碼蛋白的生物信息學(xué)分析測(cè)序結(jié)果 用Genetyx version 7軟件去掉載體序列,通過(guò)Sequencher 4.2軟件與PhZEP的預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)分析后采用DNAman軟件翻譯為氨基酸序列。使用在線工具ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找ORF。用NCBI中Blastp工具對(duì)所獲得的編碼區(qū)序列進(jìn)行初步同源比對(duì)分析,并通過(guò)Conserved Domains (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。運(yùn)用在線工具Protparam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html),SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),TMHMM Server v2.0 (http://www.Cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),TargetP1.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)依次對(duì)PhZEP蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。采用Muscle 3.6軟件對(duì)PhZEP與其他13種植物的ZEP氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)分析,比對(duì)結(jié)果通過(guò)MEGA 6.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR) 根據(jù)獲得的PhZEP基因的全長(zhǎng)CDS序列,利用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物PhqZEP-F:5′-AGCACATTGACAAGGGATGA-3′,PhqZEP-R:5′-TGATGAGCCCACATGAAGAT-3′,以1.2項(xiàng)下獲得的cDNA為模板,太子參PhACT2 (gi: KT363848)為內(nèi)參基因,在ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)PhZEP基因在太子參的不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期以及ABA和氟啶酮處理后塊根中的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量分析試劑盒為GoTaq qPCRMaster Mix(TaKaRa,大連)。PCR擴(kuò)增體系為2 × GoTaq qPCR Master Mix 10 μL,PhqZEP-F/R (5 μmol·L-1)各0.8 μL,cDNA模板2 μL,加Nuclease-Free Water 補(bǔ)足至終體積20 μL。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),溶解曲線為95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。根據(jù)ABI 7500 Real Time PCR System自帶軟件的分析方法,用2–ΔΔCt法對(duì)PhZEP基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 太子參PhZEP基因的克隆 通過(guò)太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)得到1條ZEP基因的轉(zhuǎn)錄本序列,長(zhǎng)1 833 bp,包含1個(gè)1 263 bp的ORF,編碼420個(gè)氨基酸,1~104 bp為5′非編碼序列(5′UTR),1 368~1 833 bp為3′UTR。利用其全長(zhǎng)CDS序列的特異引物PhZEP-F與PhZEP-R,以太子參塊根木質(zhì)部cDNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序分析得到1條大小為1 263 bp的片段,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致,見(jiàn)圖1。
2.2 太子參PhZEP基因的序列分析 通過(guò)Protparam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示PhZEP蛋白的分子式為C2107H3305N581O624S18,相對(duì)分子質(zhì)量為47.34 kDa,等電點(diǎn)pI 6.64。不穩(wěn)定系數(shù)為44.87,脂肪系數(shù)為84.95,平均親水性系數(shù)為0.329,說(shuō)明PhZEP基因編碼蛋白是親水性蛋白。同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),該基因與甜菜(Beta vulgaris subsp. vulgaris,XP_010670730.1)的ZEP序列相似性最高,達(dá)73%。PhZEP基因的結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜ADB_Rossmann超家族成員,含有玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶的特征性結(jié)構(gòu)域,分別是1個(gè)脂質(zhì)蛋白附著點(diǎn)區(qū)域(prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site profile,PS51257)位于1~19個(gè)氨基酸,4個(gè)黃素蛋白單加氧酶區(qū)域(flavoprotein monooxyenase,PR00420)位于6~28,158~173,307~338,357~373個(gè)氨基酸,F(xiàn)AD結(jié)合區(qū)域(FAD binding domain,PF01494)位于6~373個(gè)氨基酸,見(jiàn)圖2。
黑色框.脂質(zhì)蛋白附著點(diǎn)區(qū)域;紅色框.起始密碼子和終止密碼子;黑色線.黃素蛋白單加氧酶區(qū)域;紅色線.FAD結(jié)合區(qū)域。
運(yùn)用SignalP4.1檢測(cè)到第1~29個(gè)氨基酸存在1段信號(hào)肽,序列為MKREKKAIIVGGSIAGVSCAHALTTAGWQ,且S平均值大于0.5,推測(cè)PhZEP蛋白為分泌蛋白,這與TargetP1.1的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致,見(jiàn)圖3。SOPMA預(yù)測(cè)顯示,PhZEP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)占36.67%,α-螺旋(alpha helix)占30%,延伸鏈(extended strand)占23.33%,β-轉(zhuǎn)角(beta turn)占10%,可見(jiàn)無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件,散布于整個(gè)PhZEP蛋白中,見(jiàn)圖4。
2.3 太子參PhZEP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析 為分析PhZEP蛋白的進(jìn)化情況,從NCBI中下載具有代表性的擬南芥A. thaliana、玉米Zea mays、煙草N. plumbaginifaolia、水稻O. sativa、甜菜B. vulgaris subsp. vulgaris等13種植物的ZEP氨基酸序列。將以上ZEP蛋白序列與PhZEP蛋白的氨基酸序列應(yīng)用Clustal W軟件比對(duì)分析,再采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建ZEP進(jìn)化樹,進(jìn)行聚類分析。結(jié)果
顯示,太子參PhZEP只與甜菜ZEP聚為一類,同時(shí)在NCBI Blastp同源比對(duì)分析中親緣關(guān)系也最近??赡苁翘訁⑴c甜菜均為石竹目植物,說(shuō)明石竹目植物的ZEP與其他物種類群的ZEP可能存在功能差異,見(jiàn)圖5。
2.4 太子參PhZEP基因在不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期以及ABA和氟啶酮(fluridone)處理后塊根中的表達(dá)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,PhZEP基因在太子參5個(gè)組織中的表達(dá)存在差異,葉片中表達(dá)水平最高,莖與須根的表達(dá)量次之,塊根的木質(zhì)部和韌皮部最低,見(jiàn)圖6;PhZEP基因在太子參不同生長(zhǎng)發(fā)育的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升,再下降,其中盛花期后10,40 d的表達(dá)量較高,見(jiàn)圖7;外源ABA、氟啶酮和ABA+氟啶酮處理后,太子參PhZEP基因的表達(dá)量為氟啶酮組>ABA+氟啶酮組>ABA組>對(duì)照組,見(jiàn)圖8。
3 討論
ABA合成途徑中存在3個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn),對(duì)應(yīng)3個(gè)調(diào)控酶,其中的ZEP是ABA合成途徑中第一步反應(yīng)的調(diào)控酶,也是一種雙功能單加氧酶,屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族,定位于葉綠體內(nèi)囊體膜上,具有保護(hù)葉綠體的作用[9,13]。本研究從太子參中成功克隆的1個(gè)PhZEP基因,編碼420個(gè)
氨基酸的蛋白質(zhì),其中1~19個(gè)氨基酸是脂質(zhì)蛋白附著點(diǎn),表明PhZEP蛋白也是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員,并且具有4個(gè)單加氧酶的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是ZEP特有,是重要的催化位點(diǎn)[13],因此推測(cè)太子參PhZEP基因?qū)儆赯EP基因家族的成員。
植物的基因表達(dá)具有組織特異性,這種特性與基因的功能特點(diǎn)等密切相關(guān)。本研究表明,太子參PhZEP基因在葉片、莖、須根、塊根木質(zhì)部和韌皮部均有表達(dá),并具有特異性,與煙草ABA2[11]、番茄NpZEP[14]的表達(dá)模式相似,均在葉片中的表達(dá)水平最高,在莖次之,根等部位的表達(dá)量較少。葉片和莖是含葉綠體比較豐富的部位,ZEP基因在這2個(gè)部分的表達(dá)量顯著高于其他部位,可能與ZEP定位于葉綠體中有關(guān),也可能是ZEP基因具有保護(hù)葉綠體免受光氧化破壞的作用。蛋白質(zhì)N端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列有助于蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體[15]。但本研究顯示太子參ZEP蛋白N端不具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列,而是分泌通路信號(hào)肽序列,與PhZEP基因在葉片等器官中高量表達(dá)矛盾,說(shuō)明PhZEP基因可能并未參與太子參葉黃素循環(huán),葉黃素循環(huán)可能由ZEP基因家族的其他成員完成。
ABA是調(diào)控植物塊根或塊莖生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵激素,在不定根的形成、塊根的膨大等過(guò)程具有重要作用[16]。本研究表明PhZEP基因在太子參生長(zhǎng)過(guò)程的盛花期后10,40 d的表達(dá)量較高,與大黃塊根中ABA生物合成相關(guān)基因9-順式-環(huán)氧加氧酶基因、醛氧化醜基因和ABA 8'羥化酶基因的表達(dá)情況相似[17],即在塊根生長(zhǎng)過(guò)程的初期和中后期的表達(dá)上調(diào)。說(shuō)明PhZEP基因可能對(duì)太子參塊根生長(zhǎng)發(fā)育的初期和中后期發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。此外,經(jīng)外源ABA處理后太子參塊根中PhZEP的表達(dá)量與對(duì)照組相當(dāng),表明外源ABA可能不影響PhZEP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。生物合成抑制劑氟啶酮可通過(guò)抑制參與ABA合成的八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)的活性來(lái)阻斷內(nèi)源ABA的生物合成,但氟啶酮處理后PhZEP的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,類似結(jié)果在桑樹研究中也有出現(xiàn)[18],表明PhZEP的表達(dá)可能還受其他因素的影響。
大米ZEP基因的突變,導(dǎo)致ABA的含量比較低[19],在擬南芥處于鹽和干旱的逆境時(shí),ZEP基因的過(guò)量表達(dá),不僅增加了ABA含量,還上調(diào)了ABA與逆境響應(yīng)相關(guān)的基因的表達(dá)水平[20]。此外,在植物的特定生長(zhǎng)發(fā)育階段以及種子等非光合器官中,ZEP基因的表達(dá)水平同樣限制著ABA的合成[11,21]。本研究表明PhZEP基因在太子參不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以葉片最高,塊根最低,但在塊根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,PhZEP基因的高表達(dá)又主要在初期和中后期。因此,作者推測(cè)PhZEP基因的表達(dá)特性可能對(duì)太子參中ABA的生物合成起著關(guān)鍵性的作用。
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