紅花生育酚環(huán)化酶基因的克隆及表達(dá)分析

官麗莉+崔琪+韓雨彤+武云云+胡人閣+顧天瑤+李海燕+李校堃

[摘要]生育酚環(huán)化酶（tocopherol cyclase， TC）是植物Vit E生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一。該研究根據(jù)紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RT-PCR（reverse transcription-PCR）方法從藥用植物紅花種子中克隆得到生育酚環(huán)化酶基因序列，命名為CtTC， 對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該基因開放閱讀框（ORF）為1 524 bp，編碼507個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為62.9 kDa，等電點(diǎn)（theoretical pI）為5.01?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明TC存在跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白糖基化位點(diǎn)分析表明TC蛋白含有1個(gè)絲氨酸糖基化位點(diǎn)以及1個(gè)蘇氨酸糖基化位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位表明其定位于葉綠體中。利用熒光定量PCR檢測紅花不同發(fā)育時(shí)期種子以及干旱脅迫不同時(shí)間的紅花葉片中TC基因的表達(dá)量，結(jié)果表明TC基因在紅花的開花后50 d的種子中表達(dá)量最高，干旱脅迫6 d時(shí)TC基因的表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后下降，為TC基因在紅花Vit E合成以及抵抗逆境脅迫中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]紅花；生育酚環(huán)化酶；克?。槐磉_(dá)分析

[Abstract]The tocopherol cyclase was one of the key enzymes in plant vitamin E biosynthesis pathway. According to the study of Carthamus tinctorius transcriptome data，the Tocopherol cyclase gene was obtained using RT-PCR techniques and named CtTC . Bioinformatics analysis showed theopen reading frame （ORF）of CtTC was 1 524 bp. The putative protein contained 507 amino acids with a predicted molecular mass of 62.9 kDa and theoretically isoelectric point was 5.01.Signal peptide analysis showed that it was a non secretory protein， and there was no signal peptide. The subcellular localization showed that the CtTC protein was located in the chloroplast. The expression of CtTC gene in safflower seeds at different development stages was determined by quantitative real-time PCR， it was found that the highest expression level of CtTC gene was detected in 50 DAF.Quantitative RT-PCR analysis suggested that expression of CtTC is induced and strengthened by drought stresses. This research provided a candidate gene for metabolic engineering of vitamin E and resisting stress.

[Key words]Carthamus tinctorius； tocopherol cyclase； clone； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20162005

紅花Carthamus tinctorius L， 又稱草紅花或刺紅花， 為一年生或兩年生菊科植物^[1]， 在中國大部分地方均有栽培， 主要分布于河南、 四川、 新疆、 浙江等地。紅花籽，又稱“白平子”，是傳統(tǒng)中藥紅花的種子，李時(shí)珍在《本草綱目》中稱其“功能與花同”^[2]。紅花籽中富含Vit E、不飽和脂肪酸等，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域。

紅花中有效成分有黃酮類物質(zhì)、不飽和脂肪酸、Vit E等，紅花有效成分種類以及藥理作用的研究已有大量報(bào)道^[3-4]。近年來，隨著新一代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們從基因組、轉(zhuǎn)錄組角度對(duì)紅花進(jìn)行研究。劉秀明等^[5]應(yīng)用454測序技術(shù)對(duì)紅花C. tinctorius初花期和盛花期2個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序， 獲得黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶基因包括查爾酮合酶（chalcone synthase， CHS；EC2.3.1.74）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase， CHI；EC 5.5.1.6）和花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS；EC 1.14.11.19）。Li等^[6]以紅花種子、花瓣、葉片為材料，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共注釋了153 769條 unigene其中23 條unigene參與黃酮類化合物的合成8條unigene參與油體蛋白的合成。本課題組前期從紅花C. tinctorius中克隆到一個(gè)紅花Vit E 合成相關(guān)關(guān)鍵酶 2-甲基-6-葉綠基-1，4-苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶（MPBQ MT）基因^[7]。

Vit E又名“生育酚”（tocopherol），是植物和光合微生物合成的一類脂溶性維生素，在人類和動(dòng)物的日常膳食中起著不可或缺的作用Vit E包括生育酚和生育三烯酚2類共8種化合物，即α，β，γ，δ-生育酚（tocopherol）和α，β，γ，δ-生育三烯酚（tocotrinol），具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、預(yù)防心血管疾病、提高免疫力等多種功能^[7]。獲取Vit E所需的油料作物種子中雖然Vit E含量較多，但提取困難成本很大，市場上對(duì)天然Vit E的需求越來越大，并且植物的種子中主要的Vit E成分是δ-生育酚，但δ-生育酚生物活性很低，且不易于被人體吸收；生物活性高的Vit E成分為α-生育酚和γ-生育酚。因此，利用基因工程的方法提高作物中Vit E的含量，改進(jìn)天然Vit E提取方法，成為目前植物Vit E代謝研究的熱點(diǎn)。隨著生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆，生物工程已經(jīng)成為提高植物Vit E含量的有效途徑。生育酚環(huán)化酶（tocopherol cyclase，TC）是生育酚合成途徑中的倒數(shù)第2個(gè)酶，它可以以MPBQ，DMPBQ為底物，分別生成易被人體吸收的α-生育酚和γ-生育酚；也可以以MGGBQ，DMGGBQ為底物^[8]，分別生成α-生育三烯酚和γ-生育三烯酚，是Vit E生物合成下游的關(guān)鍵酶之一。目前，TC的cDNA序列已在擬南芥Arobidopsis thalina L.、油菜Brassica campestris L.、大豆Glycine max等多種植物中得到克隆^[9-15]。因此，TC基因的表達(dá)及活性對(duì)決定植物Vit E的組成起著重要作用，對(duì)培育高γ-生育酚和α-生育酚的新品系具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究以紅花種子為材料，利用課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序文庫中高表達(dá)的Uingene700為基礎(chǔ)^[6]，利用RT-PCR技術(shù)克隆紅花CtTC基因的cDNA序列，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，為人們深入了解TC基因在植物Vit E代謝途徑的表達(dá)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品 紅花C. tinctorius樣品采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)種植基地，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)胡全德教授進(jìn)行物種鑒定。取開花后5，15，30，50 d的新鮮種子用于表達(dá)分析，用開花后50 d種子（成熟種子）用于TC基因克隆。剪取花苞，取新鮮種子，迅速放于液氮中，錫箔紙包好后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?5% PEG 8000模擬干旱條件，對(duì)四葉期紅花進(jìn)行干旱脅迫，分別取脅迫0，2，4，6，8，10 d后的葉片，迅速放于液氮中，錫箔紙包好后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 限制性內(nèi)切酶、RNAiso Plus試劑、LA Taq 酶、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、 DNA 連接試劑盒、 DNA 純化回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 SYBR@Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司，pEASY-T1載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Trans-T1）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)。

2 方法

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 根據(jù)紅花種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果，依據(jù)基因注釋尋找TC基因?qū)?yīng)的2個(gè)unigene（Unigene700l和Unigene54146）。通過NCBI ORF Finder在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Unigene700_All對(duì)應(yīng)的序列具有完整的開放閱讀框。

2.2 RNA提取和cDNA合成 取紅花各組織置于液氮中研碎，總RNA提取方法按照RNAiso Plus試劑說明書進(jìn)行，提取后進(jìn)行純度及濃度測定；并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。cDNA合成根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分離純化后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 紅花TC基因的克隆 根據(jù)具有完整ORF的TC基因序列設(shè)計(jì)引物TC-F和TC-R。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行TC基因ORF克隆。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應(yīng)。獲得目的基因的全長cDNA。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pEASY-T1 Vector，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選后，挑取白色菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR、雙酶切鑒定重組子，然后測序（由上海生工生物工程公司完成）。

2.4 生物信息學(xué)分析 ORF Finder在線軟件MPBQ MT基因cDNA的開放閱讀框（ORF）與相應(yīng)的氨基酸序列。將獲得TC基因全長序列通過BLAST搜索NCBI的蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫，并通過DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件對(duì)來源于各種植物的生育酚環(huán)化酶（tocopherol cyclase， TC）的相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)。使用ChloroP服務(wù)器v1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/ChloroP）進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測。相對(duì)分子質(zhì)量與理論等電點(diǎn)（pI）預(yù)測采用ExPASy 在線服務(wù)器的Compute Pi/Mw 工具，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測使用 Dublin 大學(xué)的Porter 服務(wù)器，結(jié)構(gòu)功能域分析采用ExPASy在線務(wù)器Prosite Scanprosite。

2.5 紅花CtTC基因表達(dá)分析 提取開花后5，15，30，50 d的新鮮種子及干旱處理的紅花葉片的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于Real-time PCR分析。定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL；上下游引物（表1）各0.4 μL；ROX Reference Dye Ⅱ（50×）；DNA模板2 μL；ddH₂O 6.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s， 60 ℃退火30 s， 40個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果分析

3.1 RNA提取 對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的紅花種子的總RNA進(jìn)行濃度和純度檢測，得到的RNA質(zhì)量濃度分別為150～210 mg·L^-1，A₂₆₀ /A₂₈₀的比值為1.8～2.0，表明所提取的總RNA 完整性和純度較好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)（圖1）。

3.2 紅花TC基因的克隆 根據(jù)CtTC基因編碼區(qū)序列特異引物（TC-F，TC-R），以紅花種子cDNA為模板擴(kuò)增出一條1 524 bp的條帶（圖2A）。經(jīng)回收

純化后，PCR 產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接， 通過菌液PCR驗(yàn)證（圖2B） 和質(zhì)粒的SpeⅠ和EcoRⅤ雙酶切驗(yàn)證（圖2C），測序結(jié)果正確，命名該基因?yàn)镃tTC （Genbank登陸號(hào) KX501215）。

3.3 CtTC蛋白理化性質(zhì)分析 TC基因ORF長1 524 bp，利用 ExPASy Proteomics Server的在線軟件 Protparam預(yù)測 CtTC編碼蛋白的理化性質(zhì)。CtTC蛋白包含507個(gè)氨基酸， 分子式為C₄₆₀₆H₇₆₉₀N₁₅₂₄O₁₉₄₄S₂₉₈，總原子數(shù)為16 062。相對(duì)分子質(zhì)量為62.905 kDa；理論等電點(diǎn)pI 5.01，帶正電殘基（Arg+Lys）為0，帶負(fù)電殘基 （Asp+Glu）為0。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為43.08，表明CtTC編碼蛋白不穩(wěn)定。

3.4 CtTC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、糖基化位點(diǎn)預(yù)測分析 采用SWISS-MODEL（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl） SOPMA 進(jìn)行CtTC基因的編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）。CtTC的編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋 （alpha helix） 占20.9%、延伸鏈 （extended strand）占24.26%、β-折疊（beta turn）占14.4%、無規(guī)卷曲 （random coil）占40.43%（圖3）。

跨膜螺旋分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）表明該蛋白為膜外蛋白。在線工具WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/）預(yù)測該蛋白的亞細(xì)胞定位情況如下：chlo：8.0， cyto：3.0， nucl：2.0；表明該蛋白可能定位于葉綠體。使用ChloroP在線軟件對(duì)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明CtTC蛋白含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，為第1～57個(gè)氨基酸，推測該蛋白合成后運(yùn)送到葉綠體并在此行使功能。

3.5 CtTC蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用DNAMAN軟件，將紅花TC蛋白與Genbank中已公布的白梨（XP 009367482.1）、蘋果（XP 008393882.1）、野草莓（XP 0094291189.1）、大豆（XP 003526485.1）、苜蓿（XP 013462012.1）、荷花（XP 010254049.1）、胡桃（AHH29648.1）、巨桉（XP 010049096.1）、古尼桉（AAP97931.1）、麻瘋樹（XP 012077416.1）、可可（XP 007012099.1）、木本棉（XP

KHF98490.1）、陸地棉（XP 012436528.1）、向日葵（ABB52812.1）、生菜（ADC91914.1）、芝麻（NP 001291340.1）、煙草（AIC85301.1）、林煙草（XP 009770568.1）的TC氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆到的紅花TC基因與生菜Lactuca sativa的同源性最高，高達(dá)83%。從NCBI上搜索到其他19個(gè)物種的TC蛋白序列，利用MEGA5.1軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)， 并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖4）。結(jié)果表明，結(jié)果顯示紅花與向日葵、生菜的親緣關(guān)系相對(duì)較近，而與芝麻、煙草親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3.6 紅花TC基因的表達(dá)分析 分別取開花后5，15，30，50 d的新鮮種子提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以18s rRNA為內(nèi)參基因，采用Real-time PCR方法分析TC基因在紅花種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量。結(jié)果表明（圖5），TC基因的表達(dá)量隨著種子的發(fā)育逐漸升高，在開花后50 d（成熟種子）中達(dá)到最高。干旱脅迫條件下，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫6 d時(shí)TC基因的表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后下降（圖6）。

4 結(jié)論

生育酚環(huán)化酶是Vit E生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。本研究成功從紅花中克隆得到一個(gè)TC基因，ORF長長度為1 524 bp，編碼蛋白由507個(gè)氨基酸組成， 并且與其他植物TC蛋白具有較高的相似

性，所有的生物信息學(xué)分析表明CtTC屬于生育酚環(huán)化酶家族。CtTC基因的分離鑒定為分子水平上深入了解該基因在Vit E生物合成途徑中的作用奠定基礎(chǔ)，為培育富含高活性Vit E轉(zhuǎn)基因植物提供優(yōu)質(zhì)候選基因。

目前，大量的TC蛋白已在多種植物中發(fā)現(xiàn)。CtTC蛋白中的N端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測說明TC合成后運(yùn)送到葉綠體并在此行使功能，這與Vidi等發(fā)現(xiàn)的生育酚是在植物的葉綠體中合成是一致的^[16]。將不同植物的TC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，CtTC與同為菊科的生菜、向日葵TC蛋白聚為一類。研究表明，TC能夠通過提高的α-生育酚含量和降低脂質(zhì)過氧化水平，增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受性^[17]。大量的證據(jù)表明生育酚含量與植物對(duì)低溫、干旱、鹽脅迫呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系^[18-20]。脅迫條件下誘導(dǎo)Vit E合成途徑基因的表達(dá)能夠增強(qiáng)生育酚的積累，而這些基因包括TC基因?qū)τ诓煌拿{迫可能引起不同的反應(yīng)^[21-22]。熒光定量PCR結(jié)果表明，CtTC基因的表達(dá)量隨著種子的發(fā)育逐漸升高，在紅花開花后50 d的種子中表達(dá)豐度最高；干旱脅迫6 d時(shí)TC基因的表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后下降，說明更多的生育酚環(huán)化酶積累并參與Vit E的合成，Vit E可做為一種抗氧化劑，有效減弱干旱脅迫等條下件植物細(xì)胞膜與蛋白的氧化損傷。本研究對(duì)CtTC基因在氧化應(yīng)激條件下的表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)合上述蛋白序列的生物信息學(xué)分析，結(jié)果揭示CtTC在一定程度上應(yīng)答氧化應(yīng)激的潛在功能。

然而，有關(guān)CtTC參與Vit E生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。在后續(xù)研究中，通過原核表達(dá)、超表達(dá)或抑制CtTC基因在植物中的表達(dá)，結(jié)合Vit E含量變化、紅花抗逆性的研究等對(duì)該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，為后續(xù)紅花Vit E的代謝調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]