• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    玉米紋枯病病菌y—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因克隆與表達分析

    2015-10-20 21:08:26劉博孔婷婷劉限高增貴姚遠唐琳
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:表達分析基因克隆

    劉博 孔婷婷 劉限 高增貴 姚遠 唐琳 何世道

    摘要:前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米紋枯病菌WF-9菌株的全長cDNA文庫,并進行EST分析。筆者在此基礎(chǔ)上,將EST片段進行聚類拼接,得到一個長944 bp的序列,根據(jù)所得序列開放閱讀框設(shè)計引物,克隆得到玉米紋枯病病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(GGT)cDNA序列,以生物信息學(xué)方法對其序列進行預(yù)測分析,并利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片不同時期的表達特性。結(jié)果表明,克隆所得617bp序列與EST序列完全相同,在GenBank進行Blastx同源比對,與gamma—glutamyhranspeptidase(Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。實時熒光定量PCR表明,GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時期均有表達,并存在明顯差異,其中在病菌侵染玉米葉片24 h時表達量最高。

    關(guān)鍵詞:立枯絲核菌;GGT;基因克隆;表達分析

    中圖分類號:S435.131.4+9 文獻標(biāo)志碼:A 文章編號:1002-1302(2015)05-0039-03

    玉米紋枯病是世界玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴重的世界性病害之一。近年來,隨著玉米栽培密度的提高,氮肥用量增加,形成有利于玉米紋枯病發(fā)生的小氣候條件,該病在某些地區(qū)危害日益嚴重,有逐年加重的趨勢。玉米紋枯病現(xiàn)已成為制約我國玉米持續(xù)增產(chǎn)的主要病害。

    目前,關(guān)于真菌病害相關(guān)基因研究較多,杜欣可克隆了玉米紋枯病菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的基因,用該基因構(gòu)建了酵母工程菌株,接種玉米葉片出現(xiàn)水浸狀病斑。崔福浩成功克隆了β-1,4-內(nèi)切纖維素酶基因,用該基因構(gòu)建了酵母工程菌株,接種試驗表明,該基因可以殺死植物細胞。還有一些與代謝有關(guān)的基因已被克隆,Bowyer等發(fā)現(xiàn)引起禾谷類全蝕病的禾頂囊殼菌(Gaeuman-nomyces gramins)產(chǎn)生燕麥素酶分解燕麥根表皮細胞內(nèi)的皂角苷燕麥素,編碼該酶的基因突變后禾頂囊殼菌也就失去了對燕麥的致病力。關(guān)于玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(Gamma一對utamyltranspeptida-se,GGT)未見報道,y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是一種催化肽基轉(zhuǎn)移作用的酶,在H pylori誘導(dǎo)的線粒體介導(dǎo)的程序性細胞死亡中,主要是通過誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素c進入細胞質(zhì)和激活Caspase家族成員起作用,H pylori y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(y—glutamyl transpeptidase,GGT)在分泌和成熟后通過離子鍵與細胞膜結(jié)合,將細菌和宿主細胞直接連接起來。y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶廣泛存在于原核和真核細胞中,在動物體內(nèi)主要存在于腎、肝、胰等臟器,在谷胱苷肽的新陳代謝中起到了重要作用。

    筆者所在實驗室構(gòu)建了立枯絲核菌cDNA文庫,獲得了329個高質(zhì)量ESTs序列。為了明確GGT在病菌侵染過程中的表達情況,通過對EST數(shù)據(jù)進行分析,根據(jù)所得序列設(shè)計引物,克隆了立枯絲核菌GGT,驗證了前期EST序列測序結(jié)果。在此基礎(chǔ)上,通過測定該基因在病原菌侵染過程中的表達量,探明該病原菌與寄主互作過程中的基因表達規(guī)律,為下一步研究侵染機制奠定基礎(chǔ)。

    1.材料與方法

    1.1材料

    玉米立枯絲核菌(Rhizoctonia solani AG-IlA)菌株WF-9,沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所保存。立枯絲核菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3d,刮取菌絲50~100mg,用于RNA提取、克隆。用離體葉片接種法,將培養(yǎng)3d的立枯絲核菌菌餅,放在玉米3葉1心期苗的葉片上進行接菌,分別取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片(水漬狀發(fā)病處)100mg,用于各個侵染時期基因表達量分析。所有樣品經(jīng)液氮速凍,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

    提取菌株WF-9生長第3天樣品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片總RNA,參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明提取,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量,使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度計測定濃度,使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

    1.3立枯絲核菌GGT的克隆

    筆者所在實驗室已經(jīng)構(gòu)建了玉米立枯絲核菌AG-1-IA的全長cDNA文庫,并進行了全長cDNA的隨機測序。在隨機測序中,分離出GGT EST片段,通過軟件拼接,得到長944 bp的基因,包含完整開放閱讀框。本試驗根據(jù)所得序列開放閱讀框,利用軟件primer premier 5.0設(shè)計特異性引物c06-f:5'-CACGCATACTCCCGACTACT-3和c06-r:5-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA為模板進行PCR擴增,程序為95℃ 4min;95℃45s,54℃ 45s,72℃ 1min,35個循環(huán);72℃ 10min,4℃永久保存。PCR產(chǎn)物用天根切膠回收試劑盒回收,并與pMDl9-T載體(TaKaRa,日本)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

    1.4GGT序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

    利用軟件包DNASTAR識別可讀框、推測氨基酸序列、預(yù)測等電點和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的網(wǎng)頁(http://www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/)上完成,用Mega 4.0軟件構(gòu)建GGT氨基酸系統(tǒng)進化樹。

    1.5GGT表達分析

    根據(jù)獲得的GGT核酸序列設(shè)計熒光定量PCR引物C060fr-F:5'-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3',C060fr-R:5'-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3';以立枯絲核菌GAPDH(基因登錄號AF339928)為內(nèi)參基因,設(shè)計內(nèi)參引物GAPDH—F:5'-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3',GAPDH-R:5'-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3'。反應(yīng)在BIO-RADCFX96熒光定量PCR儀(BIO—RAD,美國)上進行,反應(yīng)體系為cDNA模板(50mg/uL)2.0uL、上下游引物(10umol/L)各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL,每個樣品3個重復(fù)。反應(yīng)程序為95℃ 30s;95 qC 5 s,60 qC 30 s(single),共40個循環(huán);95℃ 1s,65℃15s,95℃(continuous),溶解曲線測定;40℃ 30s。

    2.結(jié)果與分析

    2.1GGT的cDNA克隆

    根據(jù)cDNA文庫所獲得序列開放閱讀框設(shè)計特異性引物,以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,通過PCR擴增到600bp左右GGT的cDNA(圖1)。經(jīng)測序驗證與EST片段序列一致,說明EST拼接序列結(jié)果正確。EST拼接測序得到一個長944 bp的序列,在NCBI進行BLASTx對測序結(jié)果進行同源性分析,與ganlnla-glutanlyhranspeptidase(Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。利用NCBI站點的ORF finder進行6種可能的框架分析,發(fā)現(xiàn)該cDNA片段有一個完整的開放閱讀框,最長的閱讀框為110-802,長度為693bp,編碼230個氨基酸(圖2)。

    2.2同源性分析

    根據(jù)GGT氨基酸序列,采用BLASTX在NCBI上進行比對,下載了17條GGT同源序列,運用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示克隆GGT與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近(圖3)。

    2.3GGT在侵染各個時期表達差異分析

    利用實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù),以立枯絲核菌GAPDH為內(nèi)參,分析了GGT在立枯絲核菌不同侵染時間點(O、12、18、24、30、42、54、72 h)的表達情況。結(jié)果表明,GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點均有表達,但表達量存在明顯差異,在侵染12、18h時可能由于玉米自身防衛(wèi)反應(yīng),GGT表達量明顯下調(diào);而在24 h,GGT的表達量達到最高,可能是立枯絲核菌在寄主組織內(nèi)迅速擴展,導(dǎo)致玉米葉片細胞開始程序性死亡,GGT的表達量達到最大;侵染54、72h表達量下降到相對平穩(wěn)狀態(tài),可能是由于寄主大面積凋亡,病原與寄主互作概率減少造成的(圖4)。

    3.討論

    GGT是谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶,可特異性催化y-谷氨?;霓D(zhuǎn)移反應(yīng)。GGT具有誘導(dǎo)細胞凋亡的活性,目前被廣泛接受的觀點是線粒體在凋亡的調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵的作用。GGT對細胞的基本功能是線粒體結(jié)構(gòu)的維護,對膜的完整性及細胞分化和發(fā)育具有影響。GGT在真菌、植物細胞中代謝作用一直被忽略。在哺乳動物系統(tǒng)中,該酶已被反復(fù)使用,涉及谷胱甘肽重要的抗氧化響應(yīng)功能,并與半胱氨酸輸送到組織中。敲除GGT活性基因的小鼠有異常發(fā)育和早期死亡。為了進一步弄清Rhizoctonia solani GGT在細胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染機制。本試驗采用RT—PCR、基因克隆和核酸測序技術(shù)首次獲得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列,驗證了前期EST序列測序的結(jié)果,EST拼接測序得到一個長944bp的序列,開放閱讀框為110~802,長度為693 bp,編碼230個氨基酸。相對分子量24.7ku,理論等電點4.68。為后續(xù)的功能研究、蛋白制備及其抗體研制提供了良好的試驗材料。

    經(jīng)序列比對結(jié)果顯示,本研究克隆得到的GGT與Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高,達到85%;系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果顯示與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時間點的表達特性,表明GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點均有表達,但表達量存在明顯差異,其中在病菌侵染玉米葉片24h時表達量最高。本研究只對玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(GGT)進行了克隆,對病菌侵染玉米葉片不同時期的表達量進行了分析。GGT是否參與致病,還需進一步研究。

    猜你喜歡
    表達分析基因克隆
    雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因的全長cDNA克隆與表達分析
    三個小麥防御素基因的克隆及序列分析
    紅花生育酚環(huán)化酶基因的克隆及表達分析
    三色堇DFR基因的克隆及表達分析
    巴什拜羊BPI基因的克隆與真核表達
    膠孢炭疽菌漆酶基因Lac2的序列特征與表達分析
    信號分子與葉銹菌誘導(dǎo)下小麥病程相關(guān)蛋白1基因的表達分析
    水稻OsCATA基因相互作用蛋白的篩選和表達分析
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達
    鵝PRL基因克隆及在繁殖相關(guān)組織中的表達規(guī)律
    国产真实伦视频高清在线观看| 日韩欧美在线乱码| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 91狼人影院| 久99久视频精品免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 少妇高潮的动态图| 美女高潮的动态| 亚洲最大成人av| 2022亚洲国产成人精品| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 丰满乱子伦码专区| 久久热精品热| 99久久成人亚洲精品观看| 能在线免费看毛片的网站| 国产亚洲91精品色在线| 日韩人妻高清精品专区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩 亚洲 欧美在线| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人午夜高清在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 白带黄色成豆腐渣| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 好男人视频免费观看在线| 99久久精品热视频| av天堂中文字幕网| 国产在视频线在精品| 一本久久精品| 日本wwww免费看| 国产熟女欧美一区二区| 高清毛片免费看| 久久午夜福利片| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲欧美精品自产自拍| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 99热这里只有是精品在线观看| 嫩草影院新地址| 亚洲av男天堂| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 精品久久久久久久末码| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产午夜精品论理片| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av成人av| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费看光身美女| 国产av一区在线观看免费| 1024手机看黄色片| 欧美性感艳星| 亚洲美女视频黄频| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久久久久成人av| 精品欧美国产一区二区三| 色综合站精品国产| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品91蜜桃| 日韩欧美在线乱码| 国产久久久一区二区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美一区二区亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 日本免费一区二区三区高清不卡| 搞女人的毛片| 男女那种视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 在现免费观看毛片| 成人午夜高清在线视频| 国产男人的电影天堂91| 亚洲成人中文字幕在线播放| 三级国产精品欧美在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 黄色欧美视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| 好男人在线观看高清免费视频| 最后的刺客免费高清国语| 视频中文字幕在线观看| 久久国产乱子免费精品| 精品熟女少妇av免费看| 天天一区二区日本电影三级| 成人欧美大片| 色尼玛亚洲综合影院| 三级毛片av免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产男人的电影天堂91| 深夜a级毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 九草在线视频观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧洲日产国产| 欧美日韩综合久久久久久| 午夜久久久久精精品| 好男人在线观看高清免费视频| 国产视频首页在线观看| 草草在线视频免费看| 中文天堂在线官网| 三级经典国产精品| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产精品国产精品| 精品人妻熟女av久视频| av视频在线观看入口| a级毛片免费高清观看在线播放| www日本黄色视频网| 亚洲精品自拍成人| 不卡视频在线观看欧美| 一级毛片aaaaaa免费看小| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 神马国产精品三级电影在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久人人爽人人片av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费大片18禁| 97在线视频观看| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 身体一侧抽搐| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 能在线免费看毛片的网站| or卡值多少钱| 久久久久久伊人网av| 久久精品国产自在天天线| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲av二区三区四区| 尾随美女入室| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一级av片app| 最近的中文字幕免费完整| 国内精品宾馆在线| av视频在线观看入口| 18禁在线播放成人免费| 国产黄a三级三级三级人| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 男人的好看免费观看在线视频| 免费大片18禁| 欧美性猛交黑人性爽| 国产亚洲91精品色在线| 国产不卡一卡二| 国产三级中文精品| 日韩欧美 国产精品| 精品国产露脸久久av麻豆 | 男人和女人高潮做爰伦理| 午夜福利在线观看吧| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 深爱激情五月婷婷| 色综合站精品国产| 日韩大片免费观看网站 | 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲欧美精品专区久久| 免费观看在线日韩| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美不卡视频在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲美女搞黄在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久99热6这里只有精品| 在线免费十八禁| 99久国产av精品国产电影| 最后的刺客免费高清国语| 91久久精品国产一区二区成人| 久久99热这里只频精品6学生 | 99国产精品一区二区蜜桃av| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人精品婷婷| 免费电影在线观看免费观看| 永久网站在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲五月天丁香| av在线播放精品| 听说在线观看完整版免费高清| 国产一区二区在线av高清观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲av成人精品一二三区| 国产不卡一卡二| 男人舔女人下体高潮全视频| 91av网一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 看十八女毛片水多多多| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美一区二区亚洲| 免费观看性生交大片5| 嫩草影院精品99| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美一区二区亚洲| av在线天堂中文字幕| 偷拍熟女少妇极品色| 舔av片在线| 日本av手机在线免费观看| av视频在线观看入口| 狠狠狠狠99中文字幕| 观看美女的网站| 91久久精品国产一区二区成人| 日日干狠狠操夜夜爽| 好男人视频免费观看在线| 日韩欧美精品免费久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲综合精品二区| 一区二区三区乱码不卡18| 国产在视频线精品| 国产精华一区二区三区| 久久久色成人| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品一二三区在线看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产乱人偷精品视频| 国产乱人偷精品视频| 亚洲在线观看片| 国产激情偷乱视频一区二区| 97超碰精品成人国产| 1024手机看黄色片| 能在线免费观看的黄片| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩av在线大香蕉| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美成人a在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜免费激情av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 1024手机看黄色片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 女人被狂操c到高潮| 久久精品国产亚洲av天美| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产高清三级在线| a级一级毛片免费在线观看| 国产午夜精品论理片| 亚洲在久久综合| 小说图片视频综合网站| 国产高潮美女av| 亚洲精品,欧美精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人福利小说| 一级毛片电影观看 | 亚洲精品国产成人久久av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美一区二区亚洲| 欧美zozozo另类| 最近手机中文字幕大全| 最近2019中文字幕mv第一页| 成年免费大片在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产一区有黄有色的免费视频 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美成人a在线观看| 国内精品宾馆在线| 青春草国产在线视频| 欧美极品一区二区三区四区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 人人妻人人看人人澡| 伊人久久精品亚洲午夜| 全区人妻精品视频| 免费看a级黄色片| 精品久久久久久电影网 | 99热这里只有精品一区| av在线老鸭窝| 免费av观看视频| 亚洲经典国产精华液单| 中文字幕av成人在线电影| av免费观看日本| 美女国产视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩av在线大香蕉| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品456在线播放app| 99热这里只有是精品50| 欧美日本视频| 亚洲色图av天堂| 22中文网久久字幕| 国产一区二区在线观看日韩| 亚州av有码| 国产精品精品国产色婷婷| 成人无遮挡网站| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品久久久久久久久免| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品永久免费网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 三级经典国产精品| ponron亚洲| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品综合一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人| 精品人妻熟女av久视频| 成人二区视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| www.av在线官网国产| 中文天堂在线官网| 亚洲av成人精品一二三区| 嫩草影院精品99| 亚洲国产最新在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 国产 一区 欧美 日韩| 国产成人一区二区在线| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久国产a免费观看| av视频在线观看入口| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产av一区在线观看免费| 欧美+日韩+精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 简卡轻食公司| 亚洲国产精品国产精品| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费大片18禁| 老司机影院成人| 日本三级黄在线观看| 欧美日本视频| 国产精品一区二区性色av| 成人国产麻豆网| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 看非洲黑人一级黄片| 国国产精品蜜臀av免费| 久久久久九九精品影院| 久久99热6这里只有精品| 国产色婷婷99| 小说图片视频综合网站| 婷婷色综合大香蕉| 综合色av麻豆| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产av一区在线观看免费| 欧美日本视频| 国产精品一区二区性色av| 国产成人91sexporn| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品一区二区三区视频在线| 欧美高清性xxxxhd video| 国产午夜精品论理片| 久久热精品热| 亚洲18禁久久av| videossex国产| 午夜精品国产一区二区电影 | 成人特级av手机在线观看| videossex国产| 中文字幕制服av| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久久久九九精品二区国产| 国产成人免费观看mmmm| 欧美激情在线99| 亚洲一区高清亚洲精品| 联通29元200g的流量卡| 中文亚洲av片在线观看爽| 最新中文字幕久久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久久国产成人免费| 国产在视频线在精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩欧美精品v在线| 国产高清国产精品国产三级 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人综合一区亚洲| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品国产高清国产av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 五月伊人婷婷丁香| 嫩草影院新地址| 桃色一区二区三区在线观看| 97超碰精品成人国产| 日韩精品青青久久久久久| 久久久久久国产a免费观看| 欧美色视频一区免费| 男女那种视频在线观看| 色网站视频免费| 久久久成人免费电影| 亚洲精品影视一区二区三区av| 午夜福利成人在线免费观看| 九草在线视频观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产毛片a区久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产高清有码在线观看视频| 免费看av在线观看网站| 高清视频免费观看一区二区 | 国产精品综合久久久久久久免费| 国产成人精品婷婷| av女优亚洲男人天堂| 可以在线观看毛片的网站| 久久热精品热| 91久久精品国产一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 国产伦在线观看视频一区| 久久国产乱子免费精品| 欧美zozozo另类| 晚上一个人看的免费电影| 国内精品一区二区在线观看| 在线观看一区二区三区| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久国产电影| av天堂中文字幕网| 黑人高潮一二区| 简卡轻食公司| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品人妻视频免费看| 成人午夜高清在线视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| av天堂中文字幕网| 黑人高潮一二区| 国产成人aa在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 久久国产乱子免费精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产大屁股一区二区在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品不卡视频一区二区| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产人妻一区二区三区在| 欧美高清成人免费视频www| 国产三级在线视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产91av在线免费观看| 人体艺术视频欧美日本| 国产亚洲91精品色在线| 热99re8久久精品国产| 可以在线观看毛片的网站| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久久久久丰满| 成人特级av手机在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产视频首页在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产在视频线在精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产三级在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久精品夜色国产| 亚洲,欧美,日韩| www.色视频.com| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 不卡视频在线观看欧美| 精品人妻偷拍中文字幕| 九九热线精品视视频播放| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美日韩综合久久久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 久久人人爽人人片av| 特级一级黄色大片| 欧美bdsm另类| 国产精华一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| av黄色大香蕉| 久久热精品热| 岛国在线免费视频观看| 亚洲av成人精品一区久久| 大话2 男鬼变身卡| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品一区蜜桃| 中文字幕av成人在线电影| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲高清免费不卡视频| 国产综合懂色| 国产三级中文精品| 亚洲欧洲日产国产| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产成人freesex在线| 黄片wwwwww| 男女视频在线观看网站免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 永久网站在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | www.av在线官网国产| 久久久久久伊人网av| 亚洲人与动物交配视频| 欧美高清成人免费视频www| 黄片wwwwww| 麻豆成人午夜福利视频| 免费看光身美女| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 丰满少妇做爰视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 嫩草影院精品99| 日韩亚洲欧美综合| 中文资源天堂在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产精品合色在线| 成人特级av手机在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一区二区三区高清视频在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 在线播放国产精品三级| 在线观看av片永久免费下载| 免费观看性生交大片5| 国产高清三级在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜福利在线观看吧| 波多野结衣巨乳人妻| av国产免费在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产成人一区二区在线| 少妇的逼好多水| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩强制内射视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久热精品热| 国产精品久久久久久av不卡| 高清视频免费观看一区二区 | 国产国语露脸激情在线看| 午夜激情av网站| 五月开心婷婷网| 精品少妇久久久久久888优播| 人妻 亚洲 视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 精品亚洲成a人片在线观看| 99香蕉大伊视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产在线一区二区三区精| 久久99蜜桃精品久久| 国产精品熟女久久久久浪| 免费看光身美女| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产高清不卡午夜福利| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲国产av影院在线观看| 久久99热6这里只有精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本wwww免费看| 人妻系列 视频| 亚洲成人av在线免费| 国产男女内射视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品久久久精品久久久| 亚洲,欧美精品.| 中国三级夫妇交换| 少妇 在线观看| av.在线天堂| 免费观看性生交大片5| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜av观看不卡| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品国产乱码久久久久久小说| 春色校园在线视频观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品熟女久久久久浪| 伦精品一区二区三区| 成人国语在线视频| a级毛色黄片| 久久久久久久久久人人人人人人| 日韩av免费高清视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 在线观看国产h片| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩制服骚丝袜av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久女婷五月综合色啪小说| www.熟女人妻精品国产 | 伊人亚洲综合成人网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧洲国产日韩| 天堂俺去俺来也www色官网| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲成人手机| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁|