山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達

傅江燕+徐晟+夏冰+汪仁

摘要：以山桃葉片為材料提取RNA，反轉錄后得到cDNA，通過PCR擴增得到1個山桃醇腈酶基因全長編碼序列，并命名為[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]。[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的開放閱讀框為1 737 bp，預測編碼蛋白包含539個氨基酸。氨基酸序列比對結果表明，[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]編碼的蛋白具有葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶的序列特征，與黑櫻桃醇腈酶PsHNL4蛋白相似度為92%，與桃假定的HNL蛋白相似度為77%。通過將[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因連接到原核表達載體pET28（a）上，并轉化大腸桿菌BL21 （DE3）后，成功構建了原核表達重組菌株。SDS-PAGE電泳結果顯示，重組蛋白受IPTG誘導表達，分子量大小約為62.4 ku，與已報道的其他薔薇科植物的醇腈酶蛋白大小基本一致。

關鍵詞：山桃；醇腈酶；基因克??；原核表達

中圖分類號：S662.101；Q786 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0020-05

利用酶作為催化劑用于合成單一對映體或直接分離特定手性異構體，被廣泛應用于不對稱合成領域。醇腈酶作為一種不對稱催化手性反應的酶，自20世紀初在扁桃中發(fā)現(xiàn)以來，受到愈來愈多的關注[1]。它可逆地催化HCN和醛/酮類化合物反應生成手性氰醇[2]，進而轉化成為羥基化合物等多種手性中間體，并用于合成多種手性藥物，從而克服了為得到純手性化合物而采用光學拆分所帶來的生產(chǎn)工序復雜、成本高等一系列問題[3-4]。此外，在植物體內，醇腈酶可催化氰基糖苷類化合物，反應生成羰基化合物和HCN，而后者在植物防御草食類動物攝食或其他致病菌感染中起到作用，即植物的生氰作用[5-6]。

HNL在自然界中是廣泛存在的。據(jù)統(tǒng)計，有3 000～12 000 種植物內含有HNL。HNL主要分為兩大類：R構型和S構型。目前，已分離純化并進行酶活分析的R型HNL多來自于薔薇科植物[7]，如扁桃、黑櫻桃、梅、枇杷、西番蓮等[8-13]；而S型HNL多來自于木薯、橡膠樹、海檀木與高粱[14-17]。筆者所在研究組根據(jù)前期公布的桃的基因組數(shù)據(jù)[18]，通過序列同源比對分析，發(fā)現(xiàn)其中有3條序列為編碼推測的HNL蛋白。此外，山桃、桃與扁桃同屬于薔薇科桃屬，目前有關山桃中HNL的研究并未報道。因此，本研究采用生物信息學結合PCR的方法，克隆得到1個山桃HNL基因，并對其進行了相關的生物信息學分析與原核表達研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山桃[Prunus davidiana （Carr.） C.]葉片取自江蘇省中國科學院植物研究所，采集后迅速放入液氮中冷凍，于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

高純總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，表達載體pET28（a）購自Novagen公司，rTaq DNA聚合酶、克隆載體pMD19-T、Oligo （dT）18、DNA Markers、限制性內切酶和反轉錄酶M-MLV （RNase H—）等購自大連寶生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌DH5α、TOP10和BL21 （DE3）菌株為筆者所在實驗室保存，引物合成和測序工作分別委托北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司與上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 按照高純總RNA快速提取試劑盒的操作說明，提取山桃葉片的RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度與完整性，并以此為模板，根據(jù)TaKaRa公司的反轉錄試劑盒說明書反轉錄得到山桃cDNA。

1.2.2 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的克隆及生物信息學分析 根據(jù)桃基因組測序組公布的序列，通過比對搜索出編碼假定醇腈酶蛋白的基因序列，并根據(jù)這些序列設計特異引物，上游引物為 F0：5′-ATGGTGAAATCAACAATGTC-3′，下游引物為 R0：5′-AGTATCAAACGCAAAGGAT-3′。以反轉錄得到的 cDNA 為模板進行 PCR擴增，擴增反應程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，純化后的產(chǎn)物連接到 pMD19T載體上，轉入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，挑取克隆進行PCR與質粒酶切檢測，鑒定結果均為陽性的重組子送交公司測序。

測序結果通過NCBI的ORF finder在線軟件查找該序列的開放閱讀框，得到其編碼的氨基酸序列，將該序列使用BlastP進行比對，選擇與PdHNL同源的其他植物的醇腈酶蛋白序列，進一步利用DNAman軟件進行多重序列比對并使用MEGA5構建系統(tǒng)進化樹；使用ExPASy的Compute pI/MW計算蛋白的等電點與分子量；用TMHMM預測跨膜結構；用SignalP 4.1預測信號肽；用PROSITE數(shù)據(jù)庫進行功能結構預測；用SWISS-MODEL預測三級結構并建模。

1.2.3 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的載體構建與原核表達 根據(jù)獲得的[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因與pET28（a）載體圖譜，分析并設計帶有酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ的引物PdHNL1-pETF和PdHNL1-pETR （表1），使用rTaq DNA聚合酶進行PCR擴增。

將pMD19T-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]重組質粒與pET28（a）載體質粒同時進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收并純化目的片段，并使用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，隨后轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，重組質粒經(jīng)卡那霉素篩選，PCR擴增并進行質粒雙酶切驗證后，最后挑去陽性克隆子進行測序。將測序正確的重組質粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]和空載體pET28（a）分別轉入表達宿主菌BL21（DE3）中，挑取克隆并使用 T7通用引物進行PCR，篩選陽性菌株。

1.2.4 原核表達及SDS-PAGE電泳檢測 將PCR驗證正確的重組菌株與對照菌株分別接種于50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm約為0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG于16 ℃進行低溫誘導；分別在誘導后的0、3、6、18、24 h時取菌液1 mL，10 000 r/min離心1 min收集菌體，制備SDS-PAGE電泳樣品；按照《蛋白質技術手冊》配制蛋白膠，并進行SDS-PAGE電泳分析。

2 結果與分析

2.1 提取的RNA質量

取提取的山桃葉片總RNA 2.5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，其28S rRNA和18S rRNA條帶清晰可見，5S rRNA呈現(xiàn)一條較弱的條帶（圖1），表明提取的RNA濃度比較高且完整性較好，可以用于進一步的基因克隆試驗。

2.2 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的克隆與生物信息學分析

通過PCR方法擴增[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]目標基因的全長cDNA的ORF序列，將其命名為[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]，軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)（CDS）長度為1 737 bp，編碼579個氨基酸，理論分子量為624 ku，理論等電點為4.98，預測的半衰期為30 h，不穩(wěn)定系

數(shù)為29.36，屬于穩(wěn)定蛋白，不含跨膜區(qū)。疏水性分析結果顯示PdHNL1屬于親水性蛋白（圖2）；信號肽預測分析結果顯示，該蛋白N端有一段信號肽序列。PdHNL1蛋白序列的二級結構預測結果顯示，無規(guī)則卷曲是山桃 PdHNL1的主要結構元件；統(tǒng)計結果表明，PdHNL1蛋白的二級結構包含 1672% α-螺旋、17.55%β-折疊和 65.73%無規(guī)則卷曲。此外，結構功能分析結果還表明，PdHNL1蛋白有類似葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶的序列特征 （圖3）。氨基酸多重序列比對結果顯示PdHNL1與黑櫻桃PsHNL4同源性較高（圖4）。

從GenBank上獲得多個植物HNL同源基因編碼蛋白的氨基酸序列。利用進化分析MEGA 5.0，采用中鄰位相接算法構建系統(tǒng)進化樹（圖5）。分析結果顯示，山桃PdHNL1與同[CM（25]為薔薇科的黑櫻桃PsHNL4進化關系最近；與其他薔薇科[CM）]植物的HNL蛋白遺傳距離也比較接近，同在一個進化分支上。

使用SWISS-MODEL對PdHNL1蛋白的三級結構進行預測，軟件自動選擇PDB數(shù)據(jù)庫中的梅的 PmHNL isozyme-1蛋白為模板 （同源性為77.65%），對 PdHNL1蛋白進行建模（圖6）。結果表明，PdHNL1結構主要為無規(guī)則卷曲，這與二級結構預測結果相符。

2.3 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的原核表達[JP2]

對PdHNL1進行信號肽預測分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N端具有1段信號肽序列。因此，設計去除該信號肽的引物，對PdHNL1的成熟蛋白進行原核表達。將[WTBX][STBX]pMD19T-PdHNL1與pET28（a）[WTBZ][STBZ]質粒使用EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切（圖7-A、圖7-B），分別純化回收后，使用T4 DNA連接酶進行連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。菌液PCR和質粒雙酶切試驗結果顯示，[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]成功連接到原核表達載體pET28（a） （圖7-C、圖7-D）。提取重組質粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]并轉入大腸桿菌表達菌株BL21（DE3），菌液PCR檢測結果表明獲得了用于原核標的重組菌 （圖7-E）。

將含有重組質粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的陽性菌株和含空載體pET28（a）的對照菌株培養(yǎng)至D600 nm為0.5，隨后加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG進行誘導表達；分別于IPTG誘導后[CM（25]的0、3、6、18、24[KG*3]h 取樣，并制備SDS-PAGE檢測樣品。[CM）]

SDS-PAGE電泳結果顯示，含pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的宿主菌經(jīng)IPTG誘導后，在62 ku左右有1條清晰的目的條帶，且隨著時間的延長，該目的條帶表達量增加（圖8）。這與[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]預測的分子量相一致，表明山桃 pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]重組質粒在大腸桿菌中成功表達。

3 結論與討論

HNLs是合成純光學氰醇類化合物的重要的酶催化劑，其在植物體內催化分解氰基糖苷類化合物生成氰化物，從而起到保護植物的作用[19]。自1997年就已經(jīng)有研究者在植物體內篩選可能的HNL[20]；此后，Asano等采用HPLC方法檢測[FL）]

了163種產(chǎn)氰植物的HNL活性及其催化產(chǎn)生手性醇氰的能力，發(fā)現(xiàn)桃HNL具有R型HNL活性[5]。桃與山桃同屬于薔薇科李亞科桃屬，親緣關系相近。本研究通過篩選桃基因組數(shù)據(jù)庫，PCR擴增得到山桃中克隆得到醇腈酶cDNA序列，生物信息學與分析發(fā)現(xiàn)其核苷酸長度、編碼蛋白的分子量等與已報道的薔薇科HNL蛋白相似；進一步的二級結構預測也發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有大量無規(guī)則卷曲和少量 α-螺旋與β-折疊，除N端信號肽外，無明顯跨膜螺旋區(qū)域，表明同科的HNL具有較高的保守性。

先前的研究表明，R型HNL主要具有氧化還原酶活性，而S型HNL具有α/β水解酶活性。擬南芥HNL則是第1個從非產(chǎn)氰植物中發(fā)現(xiàn)的具有α/β水解酶活性的R型HNL[21]。另一方面，HNL蛋白依據(jù)是否含有FAD輔基分為FAD-HNLs與非FAD-HNLs。本研究中對包括PdHNL1在內的11種植物的17個HNL蛋白進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)薔薇科R型HNL在一個進化分支，且均為FAD-HNLs， 推測薔薇科

HNL在進化過程中具有高度的保守性。山桃同屬薔薇科且PdHNL1與薔薇科其他物種的HNL在同一個進化分支上，暗示其可能屬于R型HNL。蛋白比對分析結果同樣顯示，PdHNL1與同屬于的薔薇科的梅、黑櫻桃、扁桃的HNL蛋白序列相似度較高，均達75%以上。結構功能分析結果顯示，PdHNL1屬于葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶家族，且PdHNL1氨基酸序列中具有薔薇科植物HNL推測的保守氨基酸序列YWHYHGG。此外，擬南芥和亞麻HNL雖屬于R型HNL，但與S型醇腈酶親緣關系較近，歸為一個進化分支。

本研究還將[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因連接到原核表達載體pET28（a） 上，通過轉化大腸桿菌BL21（DE3）進行融合蛋白的誘導表達，成功獲得了重組菌種。上述結果為進一步純化目標蛋白，并進行PdHNL1催化活性研究奠定了基礎。另外，本研究對山桃醇腈酶[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因進行的序列分析與原核表達，還豐富了植物HNL基因的來源，并為推進手性醇腈的酶法制備奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Andexer J N，Langermann J V，Kragl U，et al. How to overcome limitations in biotechnological processes-examples from hydroxynitrile lyase applications[J]. Trends Biotechnol，2009，27 （10）：599-607.

[2]Andexer J N，Staunig N，Eggert T，et al. Hydroxynitrile lyases with α/β-hydrolase fold：two enzymes with almost identical 3D structures but opposite enantioselectivities and different reaction mechanisms[J]. Chembiochem，2012，13（13）：1932-1939.

[3]邢曉夏，李偉偉，劉均洪. 醇腈酶：生物與化學的結合點[J]. 化工科技，2006，14（2）：46-50.

[4]徐軍偉，劉均洪. 脂肪酶和醇腈酶在有機合成中的應用[J]. 化工生產(chǎn)與技術，2003，10（4）：15-19.

[5]Asano Y，Tamura K，Doi N，et al. Screening for new hydroxynitrilases from plants[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2005，69（12）：2349-2357.

[6]Krammer B，Rumbold K，Tschemmernegg M，et al. A novel screening assay for hydroxynitrile lyases suitable for high-throughput screening[J]. J Biotechnol，2007，129（1）：151-161.

[7]趙冠杰，白鍇凱，鄭允權，等. 枇杷醇腈酶基因的克隆及結構分析[J]. 福州大學學報：自然科學版，2011，39（6）：960-964.

[8]Suelves M，Puigdomènech P. Molecular cloning of the cDNA coding for the （R）-（+）-mandelonitrile lyase of Prunus amygdalus：temporal and spatial expression patterns in flowers and mature seeds[J]. Planta，1998，206 （3）：388-393.

[9]Weis R，Poechlauer P，Bona R，et al. Biocatalytic conversion of unnatural substrates by recombinant almond R-HNL isoenzyme 5[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2004，29（1/2/3/4/5/6）：211-218.

[10]Hu Z，Poulton J E. Molecular analysis of （R）-（+）-mandelonitrile lyase microheterogeneity in black cherry[J]. Plant Physiol，1999，119（4）：1535-1546.

[11]Nanda S，Kato Y，Asano Y. A new （R）-hydroxynitrile lyase from Prunus mume：asymmetric synthesis of cyanohydrins[J]. Tetrahedron，2005，61（46）：10908-10916.

[12]Zhao G J，Yang Z Q，Guo Y H. Cloning and expression of hydroxynitrile lyase gene from Eriobotrya japonica in Pichia pastoris[J]. J Biosci Bioeng，2011，112（4）：321-325.

[13]Ueatrongchit T，Tamura K，Ohmiya T，et al. Hydroxynitrile lyase from passiflora edulis：Purification，characteristics and application in asymmetric synthesis of （R）-mandelonitrile[J]. Enzyme and Microbial Technology，2010，46（6）：456-465.

[14]Narayanan N N，Ihemere U，Ellery C，et al. Overexpression of hydroxynitrile lyase in cassava roots elevates protein and free amino acids while reducing residual cyanogen levels[J]. PLoS One，2011，6（7）：e21996.[HJ1.65mm]

[15]Hasslacher M，Schall M，Hayn M，et al. Molecular cloning of the full-length cDNA of （S）-hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis：functional expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae and identification of an active site residue[J]. J Biol Chem，1996，271（10）：5884-5891.

[16]Kuroki G W，Conn E E. Mandelonitrile lyase from Ximenia americana L.：stereospecificity and lack of flavin prosthetic group[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1989，86（18）：6978-6981.

[17]Wajant H，Mundry K W，Pfizenmaier K. Molecular cloning of hydroxynitrile lyase from Sorghum bicolor （L.） homologies to serine carboxypeptidases[J]. Plant Mol Biol，1994，26（2）：735-746.

[18]International Peach Genome Initiative，Verde I，Abbott A G，et al. The high-quality draft genome of peach（Prunus persica） identifies unique patterns of genetic diversity，domestication and genome evolution[J]. Nat Genet，2013，45（5）：487-494.

[19]Krammer B，Rumbold K，Tschemmernegg M，et al. A novel screening assay for hydroxynitrile lyases suitable for high-throughput screening[J]. J Biotechnol，2007，129（1）：151-161.

[20]Hickel A，Heinrich G，Schwab H，et al. Screening for hydroxynitrile lyasea in plants[J]. Biotechnology Techniques，1997，11（1）：55-58.

[21]Andexer J，von Langermann J，Mell A，et al. An R-selective hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana with an α/β-hydrolase fold[J]. Angewandte Chemie International Edition，2007，46（45）：8679-8681.