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    桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因的獲取與結(jié)構(gòu)分析

    2015-08-20 21:09:43楊金宏
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)分析

    楊金宏

    摘要:GspF是細(xì)菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的內(nèi)膜平臺的重要蛋白,利用PCR擴(kuò)增技術(shù),獲得了桑青枯雷爾氏菌MR111的含有該類基因功能性結(jié)構(gòu)域的GspF基因。NCBI在線BLASTP分析發(fā)現(xiàn),該基因與雷爾氏菌屬來源的同源基因的一致性在90%以上;在聚類分析中,首先所有雷爾氏菌屬同源基因聚合在同一分支,后與皮氏羅爾斯頓菌的同源基因聚合?;蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,該基因有2個(gè)由α螺旋組成的具有高度相似性的、跨膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域,揭示該基因可能參與細(xì)菌的跨膜分泌。

    關(guān)鍵詞:桑青枯雷爾氏菌;Ⅱ型分泌系統(tǒng);GspF基因;結(jié)構(gòu)分析

    中圖分類號:S888.71+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0038-03

    植物致病細(xì)菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)(T2SS)是由12~15個(gè)分泌途徑轉(zhuǎn)膜蛋白(GSP)基因簇為中心組成的復(fù)合體,向細(xì)胞外分泌毒性因子、胞外酶、毒素等許多重要的蛋白質(zhì),通過2步將蛋白從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外[1]。GspF、GspL、GspM、GspE等共同組成T2SS的內(nèi)膜平臺,組裝其他分泌元件,控制分泌通道的開啟[2]。GspF是內(nèi)膜平臺中具有重要作用、并具有廣泛分布的胞質(zhì)膜蛋白,Thomas等通過分析GspF的氨基酸序列,結(jié)合歐文氏桿菌(Erwinia carotovora)的GspF與BlaM融合試驗(yàn)證實(shí)GspF穿過內(nèi)膜3次,其N末端和C末端分別位于細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)[3]。2007年Arts等進(jìn)一步通過堿性磷酸酶融合試驗(yàn)證實(shí)了綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)中GspF的同源物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),證實(shí)了GspF是一個(gè)質(zhì)膜蛋白[4]。2009年,Abendroth等對來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的EpsF(GspF的同源基因)的N末端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,其由6個(gè)反向平行α螺旋組成。2個(gè)分子EpsF蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域形成1個(gè)緊密的二聚體并具有保守的結(jié)合界面[5]。Peabody等對大量來自細(xì)菌的GspF基因序列的分析表明,所有基因類似,且其2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是內(nèi)部重復(fù)序列[6]。

    植物青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的是一種具有嚴(yán)重危害的土傳性病害[7],本研究以桑青枯雷爾氏菌為研究對象,獲得了桑青枯雷爾式菌的GspF基因的序列,并分析了其結(jié)構(gòu)特征,為進(jìn)一步研究桑青枯雷爾氏菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的基因功能和泌出機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    桑青枯雷爾氏菌MR111由陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)并保存。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司。dNTPs、EX Taq DNA聚合酶等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。培養(yǎng)桑青枯雷爾氏菌用的TTC固體培養(yǎng)基和SPA液體培養(yǎng)基等相關(guān)試劑均為分析純,自行配制。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的活化與培養(yǎng) 超低溫冰箱取出保存的桑青枯雷爾氏菌,劃線于高壓滅菌的TTC培養(yǎng)基,于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,活化菌株。挑取TTC培養(yǎng)基生長的單菌落于SPA培養(yǎng)基,繼續(xù)置于26 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。

    1.2.2 桑青枯雷爾氏菌基因組DNA的提取與GspF基因的PCR擴(kuò)增 收集培養(yǎng)過夜的桑青枯雷爾氏菌MR111,按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA,并以此為模板,以設(shè)計(jì)的GspF基因的PCR擴(kuò)增引物(F:5′-CGATATGCCAGCCTTCC-3′;R:5′-CGTGACCTGTTGT-TTGA-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng),由于Gsp基因簇的GC含量相對較高(約70%),擴(kuò)增體系中同時(shí)加入5%二甲基亞砜(DMSO),擴(kuò)增桑青枯雷爾氏菌的GspF基因。使用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工武漢測序部進(jìn)行測序。

    1.2.3 GspF基因序列的分析 NCBI在線BLAST比對桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列[8],結(jié)合Rost等的方法[9],分析基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域,并下載其他同源基因序列,進(jìn)行序列的比對和結(jié)構(gòu)的分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 桑青枯雷爾氏菌MR111的GspF基因序列的獲取

    以提取的桑青枯雷爾氏菌的基因組DNA為模板,GspF基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果在1 000 bp上方獲得單一擴(kuò)增條帶(圖1)。回收該條帶并進(jìn)行測序,獲得GspF基因121 bp 至終止密碼子后49個(gè)堿基共1 138 bp的序列(GenBank登錄號:KM115545)。

    NCBI在線分析基因編碼氨基酸,結(jié)果表明同其他基因一樣,GspF編碼的氨基酸有2個(gè)具有高度保守性的T2SF

    (pfam00482)結(jié)構(gòu)、GspF(TIGR02120)結(jié)構(gòu)以及T2SS系統(tǒng)的組分GspF的典型結(jié)構(gòu)PulF(COG1459)(圖2)。

    2.2 GspF基因的比對與聚類分析

    NCBI在線BLASTP比對分析,GspF基因與其他來源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌(Ralstonia pickettii)等雷爾氏菌屬(Ralstonia sp.)的其他菌株的同源區(qū)域的一致性在90%以上,與伯克氏菌屬(Cupriavidus sp.)、伯克霍爾氏菌(Burkholderia sp.)等的相似性在均在80%以上。MEGA 5.0軟件[10]構(gòu)

    建GspF基因的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖3所示。所有青枯雷爾氏菌的GspF基因聚合后與雷爾氏菌屬和羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合在一起,而伯克霍爾氏菌單獨(dú)位于樹的最遠(yuǎn)分支,這與傳統(tǒng)分類一致。

    2.3 GspF基因結(jié)構(gòu)的分析

    V. cholerae的EpsF基因的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已通過晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,本研究結(jié)合BLAST比對和Rost等的方法[8-9]分析基因結(jié)構(gòu),結(jié)果2個(gè)基因的2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相似性均在80%以上(圖4-A、B),GspF的前后2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間的相似性也在50%以上(圖4-C),基因的C端、N端都具有6個(gè)α螺旋,Met(171)、 Val(192)之間具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。這與Peabody等分析的2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是內(nèi)部重復(fù)序列一致[6]。

    3 討論與結(jié)論

    革蘭氏陰性菌中,細(xì)菌的跨膜分泌蛋白占細(xì)胞總蛋白的20%,與細(xì)菌毒素分泌到胞、表達(dá)細(xì)胞表面的膜蛋白等生命活動有關(guān)[11]。目前已經(jīng)在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)7種蛋白分泌機(jī)制,其中Ⅱ型分泌系統(tǒng)在革蘭氏陰性細(xì)菌中廣泛存在,該分泌系統(tǒng)以轉(zhuǎn)膜蛋白GSP基因簇為中心,突變會造成許多蛋白分泌的缺乏[12-13]。本研究獲得的桑青枯雷爾氏菌的GspF是具有廣泛分布的胞質(zhì)膜蛋白,BLAST軟件分析GspF(EspF)基因間具有高度的相似性,MR111的GspF基因與其他來源青枯雷爾氏菌、皮氏羅爾斯頓氏菌以及雷爾氏菌屬的其他菌株的同源區(qū)域的一致性在90%以上?;谠摶蜻M(jìn)行聚類分析,所有雷爾氏菌屬聚合后再與羅爾斯頓氏菌的同源基因聚合,伯克霍爾氏菌單獨(dú)位于樹的最遠(yuǎn)分支,說明GspF基因的進(jìn)化與細(xì)菌的進(jìn)化是一致的,沒有經(jīng)歷基因的水平轉(zhuǎn)移[14]。

    作為組成T2SS內(nèi)膜平臺的蛋白之一,GspF基因存在于所有的T2SS分泌系統(tǒng)中[1,15],V. cholerae的基因EspF的二級結(jié)構(gòu)中存在6個(gè)反向平行螺旋,形成具有多個(gè)α螺旋構(gòu)成的跨膜區(qū),把疏水基團(tuán)放在骨架外側(cè),而親水基團(tuán)位于螺旋內(nèi)側(cè),與有疏水性的脂雙層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜融合,實(shí)現(xiàn)穿過細(xì)胞膜的分泌[5]。EspF與GspF形成α螺旋的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相似性在80%以上,GspF的2個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域也具有50%以上相似性,均體現(xiàn)了作為分泌系統(tǒng)的重要組成基因在基因序列和結(jié)構(gòu)上的保守性。

    本研究通過PCR技術(shù)獲得了桑青枯雷爾式菌MR111的GspF基因,并分析了基因間的相似性和結(jié)構(gòu)特征,為進(jìn)一步研究該菌的分泌機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?!?/p>

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