貴州本地山羊STAT5A基因第10外顯子SNP研究

謝海強 孫巖巖 盤道興 錢成 康建兵 胡玲玲 龔俞 焦仁剛 劉若余

摘要：利用黔北麻羊、貴州黑山羊和貴州白山羊構建DNA池，設計1對引物擴增其STAT5A基因第10外顯子及部分內含子序列。PCR產物純化后進行雙向測序。DNAStar和BLAST分析確定多態(tài)性位點。利用生物信息學軟件分析SNPs位點對STAT5A基因RNA二級結構、STAT5A蛋白二級及三級結構的影響。結果表明：在擴增的STAT5A基因中篩選到3個SNPs：C-32A、G+71A和G+158A，其中G+71A為錯義突變，導致編碼的丙氨酸（Ala）變?yōu)樘K氨酸（Thr）；C-32A和G+158A均在內含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。SNPs位點對STAT5A基因RNA二級結構和STAT5A蛋白結構均有一定影響。

關鍵詞：STAT5A基因；SNPs；外顯子；貴州本地山羊

中圖分類號： S827.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0030-03

收稿日期：2014-07-24

基金項目：貴州省重大科技專項計劃（編號：黔科合重大專項字[2011]6009號）；黔西南州種草養(yǎng)羊產業(yè)發(fā)展省州科技合作專項（編號：黔西南科合字[2011]5-3號）；貴州大學研究生創(chuàng)新基金（編號：研農2014012）。

作者簡介：謝海強（1989— ），男，江蘇常州人，碩士研究生，研究方向為分子遺傳與動物育種。E-mail：xiehaiqiang1115@163.com。

通信作者：劉若余，博士，教授，主要從事分子遺傳與動物育種研究。E-mail：liury04@163.com。

STAT5是信號轉導和轉錄激活子蛋白（signal transduction and activator of transcription，STAT）家族中的重要成員之一，它包括STAT5A和STAT5B這2個亞型，其STAT同源性家族成員共有7個，分別為STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B及STAT6[1]。 在眾多家族成員中，STAT5肩負著眾多功能，它不僅參與細胞增殖、分化與凋亡的過程，調控細胞周期，還對生物體生長和免疫應答起重要調控作用。STAT5能夠實現(xiàn)如此多功能，主要是通過其信號傳導機制來完成，主要有JAK2-STAT5[2]、JAK3-STAT5[3]、STAT5-Foxp3[4]等信號通路 。

STAT5A和STAT5B在結構與功能相近，序列具有很高的同源性，它們都擁有高度保守的N端結構域，促進蛋白間相互作用的蜷曲螺旋結構域，能與DNA直接結合的DNA結合結構域，還都具有最具保守性的SH2結構域[5]。但2者在C端的轉錄激活結構域略有不同，具體表現(xiàn)為STAT5A和STAT5B在C端分別擁有20個和8個獨特氨基酸序列[6]。STAT5的2個亞型蛋白不僅在結構上同源性極高，而且在功能上有許多相同點。STAT5A和STAT5B同時扮演著信號分子和轉錄因子的角色，它們能被生長激素（growth hormone，GH）、干擾素（interferon，IFN）、催乳素（prolactin）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及白細胞介素（interleukin，IL）等多種因子激活，進而調控相應基因的表達。

STAT5A最早作為調控乳蛋白的一個乳腺因子（mammary gland factor，MGF）而被發(fā)現(xiàn)，在隨后的研究中，發(fā)現(xiàn)STAT5A不僅對調控乳腺正常發(fā)育具有重要作用，還在肝細胞活性水平、免疫系統(tǒng)以及腫瘤調控機制[7-9]等方面都有十分重要作用。近年來，還發(fā)現(xiàn)STAT5A與生物生長性能有著密切聯(lián)系。如Yu等在小鼠上證明了STAT5A和STAT5B通過激活 Cdkn2b 和Cdkn1a表達來負調控細胞增殖[10]；方瓊等在研究家豬STAT5時同樣發(fā)現(xiàn)其介導生長激素進而影響生長性狀[11]；此外，在研究嶗山奶羊時，劉園峰等發(fā)現(xiàn)STAT5A第9內含子上存在2個連鎖突變位點，這2個突變位點顯著影響著嶗山奶羊的體質量、體長和胸圍等生長性狀[12]。

貴州本地山羊具有繁殖力強、屠宰率高、耐粗飼、易管理等特點，且其肉質鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[13]。但貴州本地山羊存在生長速度慢、個體生產性能參差不齊等問題，導致養(yǎng)羊效益不佳，因此提高其生長性能是解決上述問題的關鍵。與傳統(tǒng)繁殖飼養(yǎng)方面提高山羊生長性能相比，從分子水平研究效果更明顯、周期更短、回報率更高。但能用于育種的有用基因或標記仍然十分緊缺，而STAT5A則是十分理想的提高家畜生長性能的候選基因。

本試驗利用黔北麻羊、貴州黑山羊和貴州白山羊進行DNA池構建[14]，進行STAT5A基因多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphism，SNP）篩選。測序結果由DNAStar軟件進行序列拼接、校正，BLAST分析其SNP，并估算等位基因頻率，生物信息學軟件研究多態(tài)性位點對STAT5A基因RNA二級結構及蛋白質二級、三級結構影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗材料為貴州本地的黔北麻羊、貴州白山羊和貴州黑山羊。其中貴州省遵義市習水縣富興牧業(yè)種羊場黔北麻羊103只，貴州省畢節(jié)市納雍縣鵬騰生態(tài)農牧綜合開發(fā)有限公司貴州黑山羊103只，貴州省銅仁市沿河縣貴州白山羊種羊場貴州白山羊146只。

1.2 試驗試劑

生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（血液），瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液。

1.3 DNA提取與DNA池構建

抽取黔北麻羊血樣103個，貴州黑山羊血樣103個，貴州白山羊血樣146個。用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（血液）提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，紫外分光光度計測定DNA樣品濃度。貴州黑山羊及貴州白山羊DNA樣品分別調整相同濃度至100 ng/μL，各取3 μL混合構建DNA池。

1.4 引物設計和DNA擴增

從NCBI數據庫中得到綿羊STAT5A基因DNA序列（GenBank登錄號：NC_019468.1），利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設計1對特異性引物。其上游引物序列（5′→3′）為TTTGCTCGGATGCTCTCAGG，下游引物序列（5′→3′）為AGCAAATAAGCACCAGCAGA，目標基因片段（包含STAT5A基因第10外顯子編碼區(qū)序列及部分3′UTR序列）長度 630 bp，最適退火溫度58.3 ℃。PCR反應體系為20 μL：2×Taq PCR Master Mix試劑10 μL，基因組DNA 2 μL，上、下游引物（濃度為10 pmol/μL）各1.5 μL，ddH2O 5 μL。采用 TC-512 PCR儀進行DNA擴增，PCR擴增條件：94 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s；58.3 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)后 72 ℃ 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠成像儀觀察電泳結果。

1.5 序列分析

PCR產物委托北京諾薩基因組研究中心有限公司純化后進行雙向測序，3次獨立測序。采用DNAstar軟件對測序結果進行校正，BLAST分析確定SNPs。

1.6 測序圖峰高測量及等位基因頻率估算

利用軟件Chromas.exe查看測序結果，并利用MWSnap測量各SNP位點等位基因的相應峰高。SNP常表示二等位多態(tài)性，可通過以下公式估算等位基因頻率[15]。

fi=hi/（hⅠ+hⅡ），i=Ⅰ，Ⅱ。

式中：fi表示SNP位點某等位基因頻率，hⅠ和hⅡ分別表示測序圖上該SNP等位基因Ⅰ、Ⅱ峰高度。

1.7 STAT5A的RNA二級結構預測及蛋白結構分析

將STAT5A基因突變前后不同DNA序列進行RNA二級結構變化分析，并將STAT5A基因突變前后不同蛋白氨基酸序列進行蛋白質二級結構和三級結構變化分析。phyre2構建蛋白質三維結構，將STAT5A與蛋白結構數據庫中蛋白質三維結構進行匹配，得到模擬的STAT5A蛋白三維結構。RNA二級結構在線分析軟件：http：//www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html。蛋白質二級結構在線分析軟件：http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_server.html。蛋白質三級結構在線分析軟件：http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index。

2 結果與分析

2.1 DNA池的PCR產物測序

設計1對特異性引物擴增出貴州本地3種山羊STAT5A基因目的序列共630 bp，見圖1。擴增產物經膠回收純化后進行雙向測序，測序結果與綿羊STAT5A基因DNA序列（GenBank登錄號：NC_019468.1）DNA序列基本吻合，可以確定為山羊STAT5A基因序列。BLAST分析共發(fā)現(xiàn)3個SNPs，以STAT5A基因第10外顯子第1位堿基計數為1，SNPs位點分別為C-32A、G+71A和G+158A，均為新發(fā)現(xiàn)位點，詳見圖2。這些SNPs可能在不同山羊中普遍存在，需要擴大山羊個體數進一步驗證。突變位點是否造成其生長性能差異也需后續(xù)試驗進一步研究。

2.2 SNPs等位基因頻率估算

利用MWSnap軟件分別測量3種山羊各SNPs等位基因峰高，并估算SNPs等位基因頻率，結果見表1。由表1可看出，不同品種山羊同一突變位點突變頻率近似，不同突變位點突變頻率相差較大。

2.3 STAT5A的RNA二級結構分析

突變前后STAT5A基因RNA二級結構預測結果表明，SNP位點突變導致RNA二級結構顯著改變，詳見圖3。該突變導致RNA二級結構最小自由能發(fā)生改變，由-914.4 kJ/mol變?yōu)?937.7 kJ/mol，影響RNA二級結構穩(wěn)定性，可能影響后續(xù)蛋白質翻譯過程。

2.4 突變前后STAT5A蛋白二級、三級結構分析

利用在線SOPMA服務器預測黔北麻羊、貴州黑山羊和貴州白山羊STAT5A基因突變前后蛋白質二級結構變化。結果顯示，突變前后，β轉角由1.76%增至2.02%，α螺旋由52.64%減少到52.27%，自由卷曲由34.51%上升到3501%，延伸鏈由11.08%下降為10.71%（表2）。

蛋白質三維結構的預測及突變分析對理解蛋白質結構與功能的相關性有重要作用，采用同源比較建模原理，將突變前后氨基酸序列提交Phyre2三級結構預測服務器，結果詳見圖4。由圖4可以看出，多態(tài)性位點突變導致STAT5A蛋白三維結構構象發(fā)生改變。其中β折疊鏈保持11%未變化，α螺旋保持50%未發(fā)生變化，混亂度則由27%上升到28%。

3 討論

STAT5A作為STAT家族中重要成員，具有多種生物學功能。STAT5A能夠顯著影響生物體乳腺發(fā)育功能、肝功能、妊娠反應、免疫系統(tǒng)及腫瘤發(fā)生機制[16]，STAT5A與STAT5B共同影響了細胞增殖、生長、分化、凋亡，以及細胞周期的調控[17]。提高肉質性能與生長性能一直是畜牧業(yè)品種選育的最終目標，在家豬、小鼠、奶牛和嶗山奶羊上的研究都表明，STAT5A擁有影響動物生長性能的能力[18-19]。因此，對STAT5A的深入研究有望改善貴州本地山羊個體生長性能較差的現(xiàn)狀，同時對加快品種選育有著十分重要的現(xiàn)實意義。

本試驗首次在貴州本地山羊STAT5A基因中鑒定得到SNP位點。其中G+71A突變，將丙氨酸（Ala）錯義編碼為蘇氨酸（Thr）；C-32A和G+158A均在內含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。比較3個多態(tài)性位點等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)不同山羊品種同一突變位點突變頻率近似，不同突變位點突變頻率相差較大，這一發(fā)現(xiàn)是否在其他山羊中也有不同，需要進一步擴大山羊的品種及數量進行研究。突變前后STAT5A基因RNA二級結構發(fā)生改變，并影響到蛋白質二級、三級結構。為深入探究STAT5A基因對山羊生長性能的調控作用，有必要擴大山羊數量，并分析上述多態(tài)性位點與山羊各項生長指標關聯(lián)性，從而為山羊的選育工作以及整個STAT家族在山羊中的調控研究奠定基礎。

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