三葉木通下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化

蘇慧慧　韓興杰　李同建　徐玲玲　徐小青　胡蘭英+廖亮

摘要：以三葉木通試管苗下胚軸為材料，研究不同激素配比對三葉木通下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)、分化的影響，比較光照及不同抗褐化劑對防止愈傷組織褐化的影響。結(jié)果表明，當(dāng)2，4-D濃度為2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)96.5%；黑暗處理比光照更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，0.6 g/L PVP對預(yù)防愈傷組織褐化具有較好的效果；TDZ的濃度對愈傷組織的分化有著重要的影響，適合愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L。

關(guān)鍵詞：三葉木通；愈傷組織；分化

中圖分類號：S567.904.3 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0050-03

三葉木通[Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz]是木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia）的一種果實營養(yǎng)價值較高的半落葉藤本野生果樹[1]，別稱八月瓜、八月扎、炸瓜。主要分布于中國甘肅南部、陜西南部，湖南、湖北、山西、河南等地也有少量分布[2]。研究發(fā)現(xiàn)，三葉木通種子脂肪酸含量較高，且主要以不飽和脂肪酸為主[3]；果實味美、營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶性糖、有機酸和礦物質(zhì)含量也很高，被譽為果中之王[4]，具有較高的經(jīng)濟價值和開發(fā)價值。三葉木通是中國傳統(tǒng)中藥，有清心火、利小便、通經(jīng)下乳作用[5]。近年來，國內(nèi)學(xué)者對三葉木通的研究主要集中在藥用成分分析以及扦插栽培等方面[6-7]，組織培養(yǎng)方面研究較少，目前，只有愈傷組織誘導(dǎo)的研究，且誘導(dǎo)率較低，尚無關(guān)于三葉木通愈傷組織分化成苗的相關(guān)報道。本試驗對三葉木通下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化進行了研究，研究不同生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度組合對三葉木通下胚軸再生的影響，以期建立三葉木通下胚軸高效離體再生體系，為其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

三葉木通種子由湖南懷化種植基地提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌外植體的獲取 挑選富有光澤、飽滿的種子，置于超凈工作臺內(nèi)，無菌水浸泡24 h，使其充分膨脹。75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，0.1%的氯化汞浸泡10 min，無菌水沖洗3次，置于無菌濾紙上吸干多余水分，用解剖針劃開種皮，將胚取出，分別接種于MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)種子萌發(fā)，24 h光照培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 切取長度約為5 mm的三葉木通下胚軸，以MS為基本培養(yǎng)基，選用3因素3水平正交試驗設(shè)計L9（33）方案，觀察2，4-D、NAA、KT 3種植物激素的濃度及配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響（黑暗培養(yǎng)），每瓶接5個材料，每組處理10瓶，40 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果。

1.2.3 光照對愈傷組織誘導(dǎo)影響及抗褐化劑的篩選 切取長度約為5 mm的下胚軸，接種于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分別進行黑暗、光照、黑暗20 d再光照 20 d 3種處理方案培養(yǎng)，定期觀察并記錄生長情況，40 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果。將約5 mm大小的外植體接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分別添加維生素C 10、20、50 mg/L，AC（活性炭）0.5、0.8、1.0 g/L，PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6、0.8、1.0 g/L的抗氧化劑和吸附劑，以不添加任何抗褐化劑和吸附劑作為空白對照，黑暗處理，40 d后統(tǒng)計愈傷組織的褐化程度及生長狀態(tài)。

1.2.4 愈傷組織分化培養(yǎng)基的篩選 將長勢較好的愈傷組織轉(zhuǎn)移于培養(yǎng)基：（1） MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（2） MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（3） MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（4） MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，每瓶接5個材料，每個處理重復(fù)10瓶。黑暗處理 10 d 后，光照培養(yǎng)，50 d后分別觀察并記錄愈傷組織分化結(jié)果。

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基pH值為5.8～5.9，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，培養(yǎng)溫度（24±1） ℃，培養(yǎng)室濕度為60%～70%，光照時間為24 h/d（黑暗處理及光照試驗除外），光照度為1 200～1 500 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對無菌外植體獲得的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，3 d后接種在MS和1/2MS培養(yǎng)基中的種胚變綠且子葉張開，下胚軸開始伸長；另外2組培養(yǎng)基幾乎沒有變化。7 d后不同培養(yǎng)基中的下胚軸長度存在差異，子葉形態(tài)也不同（表1）。接種于MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中的種胚不能形成健壯幼苗，發(fā)育畸形。因此，將MS培養(yǎng)基作為獲得外植體的最佳培養(yǎng)基。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

觀察發(fā)現(xiàn)，接種7 d左右下胚軸兩端切口處開始膨大，40 d 后愈傷組織形成，愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表2。當(dāng)激素配比為2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L時，愈傷誘導(dǎo)率最高，為96.5%。為進一步觀察各控制變量是否對觀測變量產(chǎn)生影響，利用SPSS軟件進行多因素多水平的方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，2，4-D、NAA 2個因素對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響都極為顯著，KT則不顯著。即2，4-D、NAA 2種激素的3種濃度處理間差異均為顯著；KT的3種濃度處理間差異不顯著。為了篩選2，4-D、NAA的最佳濃度，對2因素進行Duncan檢驗，結(jié)果見表4、表5。

2.2.1 2，4-D 3個濃度水平的Duncan檢驗 多重分析比較結(jié)果見表4，2，4-D 3個濃度間差異顯著；2.4-D 3.0 mg/L與 4.0 mg/L 差異極顯著，就平均值來看2，4-D 2.0 mg/L的誘導(dǎo)平均值最高，因此，確定三葉木通下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)適宜的2，4-D濃度為2.0 mg/L。

2.2.2 NAA 3個濃度水平的Duncan檢驗 多重分析比較結(jié)果見表5，NAA的3個濃度間差異顯著；而NAA 0.2 mg/L與 06 mg/L 間差異極顯著。 就平均值來看， NAA 0.2 mg/L 平

均值最高，因此，確定三葉木通下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)適宜的NAA濃度為0.2 mg/L。

試驗結(jié)果表明，2，4-D、NAA 2種植物激素及其配比對愈傷組織的誘導(dǎo)率有極顯著影響，當(dāng)2，4-D濃度為2.0 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

2.3 光照時間及不同抗褐化劑對愈傷組織的影響

試驗結(jié)果表明，黑暗處理條件下愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且生長狀態(tài)好，呈淺黃色；光照條件下的愈傷組織褐化率高達(dá)100%，愈傷組織呈深褐色；黑暗20 d再光照20 d培養(yǎng)的愈傷組織開始時呈淺黃色，當(dāng)進行光照培養(yǎng)5 d后觀察到約40%愈傷組織開始慢慢變成褐色，20 d后愈傷組織的褐化率高達(dá)60%。表明黑暗條件下培養(yǎng)可很大程度上降低三葉木通的褐化。不同抗褐化劑對愈傷組織的影響見表6。

常用抗氧化劑維生素C 及吸附劑AC 并沒有起到很好的抗褐化作用，而PVP 0.6 g/L對防止褐化有相對較好作用，本結(jié)果與劉香在超聲對三葉木通葉片愈傷組織生長及代謝影響得出的結(jié)論[8]一致。

2.4 愈傷組織分化培養(yǎng)基的篩選

將愈傷組織接種于培養(yǎng)基后，定期觀察分化情況。培養(yǎng)30 d后觀察到2號和4號培養(yǎng)基仍未分化且愈傷組織呈黑褐色，35 d后愈傷組織表面有芽點冒出。接種到1號和3號培養(yǎng)基的愈傷組織也有少量呈黑褐色，但已明顯分化，呈團簇狀。50 d后愈傷分化情況見表7。由表7可以看出，3號培養(yǎng)基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L的長勢最好，芽分化程度最高，為適宜分化培養(yǎng)基，分化情況見圖1。

3 結(jié)論與討論

本試驗中種胚接種于不同的培養(yǎng)基時下胚軸長度存在很大差異，在添加植物激素的培養(yǎng)基中下胚軸的長度較短，可能是由于外源激素與種胚本身內(nèi)源激素相互作用抑制了生長。種胚接種于1/2 MS培養(yǎng)基中下胚軸長度也較短，可能是大量元素減半而導(dǎo)致種胚在萌發(fā)過程中大量元素不足的原因。

三葉木通中含有豐富的酚類物質(zhì)，因此在愈傷組織培養(yǎng)過程中易發(fā)生褐化現(xiàn)象，從而影響培養(yǎng)的效果[9-11]，豐富的酚類物質(zhì)還會在三葉木通果汁飲料的加工過程導(dǎo)致果汁色澤褐變[12]。光照對愈傷組織誘導(dǎo)過程中的褐化現(xiàn)象有著很強的誘導(dǎo)作用[13]。試驗結(jié)果，PVP 0.6 g/L對防止褐化有著較好的作用，褐化程度明顯降低，可能是與PVP吸附了酚類氧化物質(zhì)有關(guān)。李然紅等在甘藍(lán)組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)PVP對褐化抑制作用明顯[14]。

在組織培養(yǎng)中，外植體的類型以及適當(dāng)濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長素都對愈傷組織形成有著很重要的影響[15-16]，本試驗以下胚軸為外植體，通過正交設(shè)計篩選出適宜誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為：MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。沈國林等以三葉木通葉片為外植體，篩選出最適宜誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+2，4-D 4.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L[5]，但愈傷誘導(dǎo)率只有87.5%，低于本研究的96.5%，且沒有進行分化研究。

本試驗在解決了三葉木通愈傷誘導(dǎo)及褐化問題后，利用得到的愈傷組織進行了分化的初步研究，篩選出適宜的分化培養(yǎng)基為MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，為后續(xù)快繁體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

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