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    2個淀粉含量不同木薯品種SSⅡ基因序列及不同生育期淀粉含量比較

    2015-10-20 21:05:49曾文丹羅興錄
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2015年5期
    關鍵詞:木薯淀粉基因

    曾文丹 羅興錄

    摘要:以高淀粉木薯品種FX 01和低淀粉木薯品種sc 124為材料,探討可溶性淀粉合成酶基因SSⅡ序列以及在不同生育期其淀粉特性的差異。結果表明:在SSⅡ,,的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個差異位點,這2個位點的突變導致了基因編碼的蛋白發(fā)生了改變,分別由谷氨酰胺變成精氨酸和亮氨酸變成苯丙氨酸。在淀粉積累的各個時期,高淀粉木薯品種FX 01的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量均顯著高于低淀粉木薯品種SC124。

    關鍵詞:木薯;可溶性淀粉合成酶;基因;淀粉

    中圖分類號:S533.01 文獻標志碼:A 文章編號:1002-1302(2015)05-0035-04

    木薯(Manihot esculenta Crantz)別稱樹薯、木番薯,是一種富含淀粉的塊根作物,因而有“淀粉之王”“地下糧倉”等美稱,與馬鈴薯、甘薯并稱為世界三大薯類作物。近年來,由于全球環(huán)境、糧食、能源危機的不斷加劇,新興綠色能源產(chǎn)業(yè)越來越受到人們的重視。木薯作為清潔、可再生的新興生物質(zhì)能源的代表,已成為中國綠色能源發(fā)展戰(zhàn)略的新焦點。木薯淀粉中直鏈淀粉約占17%,支鏈淀粉約占83%,而高比例的支鏈淀粉可轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃缘矸?,是生產(chǎn)加工的重要原料。因此如何提高木薯支鏈淀粉的含量是研究的主要目標之一。

    已有研究表明,可溶性淀粉合成酶(SSS)在α-1,4-糖苷鍵的作用下,將ADPG中的葡萄糖加到側(cè)鏈的非還原端,使支鏈淀粉的分支鏈進一步延伸和加長,因此可溶性淀粉合成酶(sss)的主要作用是參與支鏈淀粉的合成。可溶性淀粉合成酶基因(SSⅡ)負責中等長度支鏈淀粉的合成,該基因在淀粉構成中發(fā)揮著重要作用,是支鏈淀粉積累過程中的關鍵因子。本試驗中高淀粉木薯品種FX 0l是以低淀粉木薯品種SC 124為材料,經(jīng)過輻射誘變而獲得的高淀粉突變體。2個品種之間除塊根淀粉含量有較大差異外,其他農(nóng)藝性狀相似。本試驗探討高低木薯淀粉品種SSⅡ,基因序列和淀粉特性的差異,以期為木薯支鏈淀粉生物合成和分子調(diào)控的機理提供一定的理論依據(jù)。

    1.材料與方法

    1.1試驗材料

    供試材料為高淀粉木薯品種FX 01和低淀粉木薯品種SC 124,種植于廣西大學農(nóng)學院科研教學基地。于2012年4月下種。2個品種設3次重復,隨機排列,田間管理與常規(guī)大田生產(chǎn)管理相同。

    1.2取樣時間與方法

    指標采樣時間于木薯塊根形成期(下種后120d)、塊根膨大期(下種岳180d)、塊根成熟期(下種岳240d)、收獲期(下種后300d)采樣。采集鮮樣后,105℃殺青30min左右,75℃烘干至恒質(zhì)量后粉樣過篩。

    1.3SSⅡ基因克隆

    1.3.1RNA的提取參照參照潘華清等的異硫氰酸胍一過柱法略有修改。

    1.3.2引物設計根據(jù)GenkBank中木薯SSⅡ,基因(登錄號為EF667961.1)序列,設計引物。SSⅡ上游引物(p1):5一ATGGCATTTATAGGATCACTTCCT-3;SSⅡ下游引物(p2):5‘-TCACCACTGGTACTTGGCTGCA-3。

    1.3.3 RT-PCR擴增cDNA第一鏈的合成按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的操作說明進行,引物使用隨機引物olig(dT)18;PCR反應體系:cDNA模板1uL、p1和p2各1uL、2×Gold-Star Best Master Mix 10uL、加RNase free的ddH2O至20uL;PCR反應程序:95℃預變性10min;94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 60s,35個循環(huán);再在72℃下延伸10min。擴增產(chǎn)物加核苷染料后在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。用凝皎回收試劑盒回收目的條帶。

    1.3.4 PCR擴增產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化

    將回收的目的條帶與PUC-TA進行連接載體。連接體系:回收產(chǎn)物1uL、PUC-T載體1uL、Solution Buffer 5uL、ddHzO 3uL。將上述組分振蕩混勻,22℃連接2h。將上述連接產(chǎn)物加入到50uL的大腸桿菌DH50z感受態(tài)細胞中,隨機挑取菌液經(jīng)鑒定后送上海生物工程有限公司測序。

    1.4淀粉含量的測定

    淀粉含量測定參照何照范的雙波長法。支鏈淀粉、直鏈淀粉含量測定的波長參照閔義等的方法,直鏈淀粉含量測定波長為570nm,參比波長為486nm;支鏈淀粉含量測定波長為532nm,參比波長為766nm。用UV-2501型紫外分光光度計測定吸光度。

    1.5數(shù)據(jù)分析

    采用SPSS 18.0和Excel 2003進行數(shù)據(jù)分析。

    2.結果與分析

    2.1總RNA的檢測

    以木薯的葉、莖、根混合樣為材料提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳(圖1),檢測RNA的質(zhì)量。本試驗提取的總RNA的28S、18S條帶清楚完整,無拖尾,且28s條帶亮度大約是18s條帶的2倍,點樣孔及附近無亮斑,表明RNA完整性好,無蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染。核酸蛋白檢測儀測定RNA的純度和濃度,D260nm/D280nm的平均值為1.87,濃度為3100ng/uL。數(shù)據(jù)表明所提取的RNA純度較高,能夠滿足后續(xù)試驗的要求。

    2.2RT-PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

    以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板,加引物p1、p2進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,如圖2所示。PCR產(chǎn)物大小約為2 200bp,PCR產(chǎn)物大小與預期目的片段大小符合。

    將擴增獲得的SSⅡ基因與T載體連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。從轉(zhuǎn)化后的平板隨機挑選單菌落震蕩培養(yǎng)3~4 h后進行菌液PCR檢測。如圖3、圖4所示菌液擴增片段大小為2200bp,與RT-PCR結果一致,表明為陽性克隆。將陽性菌液送往上海生物工程技術服務有限公司進行測序比對。

    2.3 FX 01和SC 124中SSⅡ序列的差異分析

    在引物和PCR條件不變的情況下,以cDNA為模板,進行PCR擴增。凝膠電泳結果顯示,從FX 01和SC 124中擴增的條帶大小相同,表明SSII在FX 01和sc 124中大小相同。通過測序分析,發(fā)現(xiàn)在SSII的編碼區(qū)存在2個位點差異,分別在+272和+1800處,其中+272處SC 124為A,而FX 01則突變?yōu)镚;在+1800上,SC 124為G,而FX 01突變?yōu)門(圖5),這2個位點的突變導致了基因編碼的蛋白也發(fā)生了改變,分別由谷氨酰胺變成精氨酸、由亮氨酸變成苯丙氨酸(圖6),蛋白由極性變成非極性。

    2.4木薯塊根淀粉含量的變化

    FX 01和SC 124直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量的變化均是隨著生育期的推移而不斷增加(表1)。整個生育期內(nèi),F(xiàn)X 01塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均高于SC124。在木薯塊根形成期,高低木薯品種FX 01與SC 124塊根的直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量差異均不顯著,而在木薯的塊根快速膨大期、塊根成熟期及收獲期,F(xiàn)X 01塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均極顯著高于SC 124。

    3.討論與結論

    SS基因在支鏈淀粉合成中起著重要的作用,研究表明,如果SS基因發(fā)生突變或通過轉(zhuǎn)入反義SS基因,該基因的結構將發(fā)生改變,從而引起可溶性淀粉合成酶的活性降低,最終導致支鏈淀粉含量也隨之變化。譚彩霞等通過RNAi技術轉(zhuǎn)化馬鈴薯,其結果表明馬鈴薯中淀粉粒的結構和形態(tài)也隨之發(fā)生了改變,與此同時馬鈴薯中SSN基因的表達量減少,從而使SSS酶活性也受到影響,最終造成直鏈淀粉含量上升而支鏈淀粉含量卻迅速下降。對擬南芥SSIV突變體的研究發(fā)現(xiàn)其淀粉含量有所減少但支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例并未發(fā)生變化,鏈長分布也未發(fā)生改變。王平榮等用EMS誘變獲得的突變體植株中,有3個突變體的OsDVR堿基突變位點和數(shù)目不同,從而導致編碼蛋白的氨基酸發(fā)生突變,造成了它們在葉綠素含量、葉綠素組成、植株表型以及主要農(nóng)藝性狀和單株產(chǎn)量極顯著差異。

    本試驗中,在SSⅡ的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個位點差異,在+272上,SC 124為A,而FX 01則突變?yōu)镚;在+1800上,SC124為G,而FX01突變?yōu)門,這2個位點的突變導致了密碼子發(fā)生改變從而導致其編碼的氨基酸發(fā)生變化,分別由谷氨酰胺變成精氨酸、由亮氨酸變成苯丙氨酸,最終導致蛋白由極性變成非極性。這可能是導致從塊根形成期到收獲期,高淀粉木薯品種FX 01的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量均顯著高于低淀粉品種SCl24的原因之一。至于其他淀粉合成關鍵酶基因有何變化還有待進一步研究。

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