三色堇DFR基因的克隆及表達分析

孫海燕++安澤偉++李琴等

摘要：從三色堇花瓣中克隆了1個花色素合成結構基因的全長cDNA，命名為VwDFR。VwDFR cDNA全長為1 340 bp，編碼347個氨基酸組成的蛋白，與胡楊的DFR序列具有較高的序列一致性。VwDFR蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能結構域，屬于SDR超基因蛋白家族成員。VwDFR基因在三色堇不同組織中的表達存在明顯差異，在初花期的花瓣中表達量最高，且色斑區(qū)高于非色斑區(qū)。結果說明，VwDFR可能與三色堇花色形成有關。此結果為深入研究三色堇花色形成奠定了基礎。

關鍵詞：三色堇；DFR；基因克?。槐磉_分析；花色素合成

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0034-04

收稿日期：2015-05-19

基金項目：國家自然科學基金（編號：31060265、31260488）；海南大學中西部計劃學科建設（編號：ZXBJH-XK008）。

作者簡介：孫海燕（1986—），女，重慶開縣人，碩士，從事園林植物資源與遺傳改良。E-mail：shy0228@sina.com。

通信作者：王健，男，湖北宜昌人，博士，教授，碩士生導師，從事園林植物分子生物學。Tel：0898-66267907；E-mail：wjhnau@163.com?；ㄐ螒B(tài)的多樣性是大自然最美麗的禮物之一，總是令生物學家著迷。生物學家對產(chǎn)生花卉多樣性的發(fā)育遺傳機制進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)金魚草和矮牽牛是探索花對稱性[1]、花色[2-4]、花瓣紋理[5]的優(yōu)秀模式植物。隨著研究的深入，花斑的形成逐漸被學者關注。植物花斑是指在其花瓣大小、形態(tài)和位置上基本固定的色斑[6]，主要是由于花色素在特定區(qū)域積累形成的，如三色堇黃底紫斑品種Rhinegold和白底紫斑品種Mont Blanc的花斑部分的組成色素是飛燕草素和矢車菊素[7-8]。因而，花色素在花瓣上積累的分子機理是花斑形成原因的研究重點。

花青素又稱花色素，屬類黃酮化合物，是一類植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物細胞液泡中。自然界中主要有6類花色素，即天竺葵色素（pelargonidin）、芍藥花色素（peonidin）、矢車菊素（cyanidin）、牽牛花色素（petunidin）、飛燕草色素（delphinidin）和錦葵花色素（malvidin），其生物合成和調控已有較深入的研究?；ㄇ嗨厣锖铣赏緩降那绑w物質是 4-香豆酰CoA與3-丙二酰CoA，最后形成花的顏色涉及的一系列酶有：查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI），黃烷酮3-羥化酶（F3H）、二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）和UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶（UFGT）等[9-10]。

二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）是花青素生物合成中類黃酮途徑的第一個酶，負責將3種二氫黃酮醇（DHK、DHQ和DHM）還原為無色花色素苷，缺失DFR活性的突變體會產(chǎn)生白色。在一些植物中，DFR有嚴格的底物特異性，不能利用二氫堪非醇（DHK）生產(chǎn)天竺葵素，因而缺乏橙/磚紅色。Johnson等將蘭屬DFR基因轉入矮牽牛后，不能有效合成天竺葵素，而將非洲菊中能有效還原DHK的DFR導入到白色矮牽牛中，得到了磚紅色花朵[11]。可見，圍繞DFR基因進行基因操作也可以改造花色。

三色堇（Viola×wittrockiana Gams）是堇菜科堇菜屬的一種多年生常作二年生栽培的草本花卉。由于其花色豐富、明艷，花期長，是花壇、花境、盆花等常用早春花卉，有“花壇皇后”之美譽，在園林綠化方面有很高的應用價值。鑒于DFR基因對植物色彩的形成非常關鍵，分離三色堇花瓣中DFR基因并研究其表達調控特點，將有助于闡明DFR基因在三色堇花斑形成過程中的作用。本研究擬從三色堇花瓣中克隆DFR基因的cDNA全長序列，進一步對VwDFR進行生物信息學及系統(tǒng)進化分析，并采用實時熒光定量PCR技術研究VwDFR在三色堇不同組織中的表達情況。

1材料與方法

1.1植物材料

本試驗材料為花色黃底黑斑的三色堇（Viola × wittrockiana Gams）品種，種植于海南大學園藝園林學院基地。

1.2菌株與試劑

大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株購自天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒（K1642）購自Fementas公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Sigma公司；LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體和實時熒光定量PCR試劑SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ購自大連寶生物公司；引物合成和測序由上海英俊生物技術有限公司完成。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取與cDNA第一鏈合成三色堇花瓣總RNA的提取采用改良Trizol法[12]，其他組織的RNA提取方法按照常規(guī)方法進行。cDNA第一鏈合成使用Fementas公司逆轉錄試劑盒，操作步驟參照產(chǎn)品說明書。

1.3.2三色堇ANS、DFR基因全長cDNA克隆比對 GenBank 上登錄的不同物種的DFR基因，依據(jù)其保守區(qū)域序列設計特異性引物，擴增得到其保守區(qū)片段，然后根據(jù)擴增得到的序列分別設計3′-RACE和5′-RACE引物（表1）擴增3′和5′端片段，具體方法參照文獻[13]。根據(jù)測序所得DFR基因的3′和5′端序列，利用DNAMAN軟件進行序列拼接，獲得其全長cDNA拼接序列。根據(jù)所得的全長拼接序列設計特異性引物（表1），使用Taq plus DNA polymerase進行全長cDNA擴增，引物終濃度為0.5 μmol/L，擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶，克隆至pMD8-T載體上，測序確認。

1.3.3生物信息學分析利用NCBI在線Blast工具和DNAMAN軟件對全長cDNA序列進行比對分析和開放閱讀框預測；利用在線軟件Expasy進行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等分析；利用MEGA 5.10軟件，以鄰近法構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.4實時熒光定量PCR分析（qRT-PCR）采用羅氏公司的LightCycler 2.0系統(tǒng)進行熒光定量PCR，分析VwDFR基因在初花期根、莖、葉、花不同組織中的表達情況。以actin基因作為內參基因同時進行定量分析，對樣品進行均一化。反應總體系為20 μL，包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和上下游混合引物0.6 μL及ddH2O 7.4 μL；反應程序95 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)。靶基因和內參基因的引物設計見表1，數(shù)據(jù)處理采用系統(tǒng)自帶軟件。

2結果與分析

2.1VwDFR的克隆

搜索比對其他植物DFR基因序列并找出保守區(qū)域，利用PCR擴增得到這個基因片段的特異性條帶，長度為241 bp（圖1-A）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)它們均缺失5′和3′端，利用5′和3′RACE技術分別經(jīng)過2輪擴增，得到DFR的3′末端片段約793 bp（圖1-B）及5′末端序列約246 bp（圖1-C）。上述片段進行Blast分析，確認與其他植物DFR同源。根據(jù)測序結果拼接后，設計引物擴增得到1 340 bp全長cDNA片段（圖1-D）。

2.2序列分析

序列分析發(fā)現(xiàn)，三色堇VwDFR基因含有1個完整的開放閱讀框，起始密碼子在85位，終止密碼子在1 128位。其開放閱讀框為1 044 bp，編碼347個氨基酸（圖2）。經(jīng)氨基酸序列保守結構域分析發(fā)現(xiàn)該基因蛋白屬于SDR蛋白家族，是SDR superfamily超基因家族中的一個，該基因家族有2個高度保守功能結構域，NADP 的結合功能域和底物特異結合功能域。如圖3所示，VwDFR基因在這2個功能域上是高度保守的。利用在線軟件Expasy分析該基因所編碼蛋白的理化性質，結果表明，VwDFR蛋白的分子量為8.61 ku，等電點為5.08，不穩(wěn)定系數(shù)為40.29，平均親水系數(shù)為0.731，屬于不穩(wěn)定型的疏水蛋白。此外，跨膜結構區(qū)預測結果表明，VwDFR是跨膜蛋白。

2.3系統(tǒng)進化分析

利用DNAman軟件，根據(jù)VwDFR基因編碼的氨基酸序列，在NCBI蛋白序列庫中進行同源檢索和比較得知，該蛋白與胡楊（Populus euphratica）、可可（Theobroma cacao）、甜橙（Citrus sinensis）、蘋果（Malus domestica）等15種其他植物DFR蛋白有73%～83%的同源性，其中與胡楊DFR蛋白同源性最高，為83%。將VwDFR與這15條DFR蛋白序列進行多重比對并利用Mega 5.10構建系統(tǒng)進化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)VwDFR 與楊柳科胡楊的 DFR 親緣關系最近。從進化樹還可

以看出，16條DFR蛋白序列明顯地聚為2個類簇，其中 VwDFR 與甜橙、可可、胡楊等雙子葉植物的DFR聚為一支，而其他單子葉植物的DFR聚為一支?？偟膩砜?，同為雙子葉的三色堇DFR基因，與雙子葉植物的親緣關系更近一些，因此DFR蛋白序列的進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律。

2.4三色堇VwDFR基因熒光定量表達分析

在三色堇開花期進行取樣，從同一株植株的根、莖、葉、花中分別提取總RNA，反轉錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR分析三色堇DFR基因在根、莖、葉、花中的表達情況。結果（圖5）表明，VwDFR在三色堇的根、莖、葉和花中均有表達，但表達水平具有明顯差異。其中，在花色素大量積累的初花期花瓣中表達量最高，在莖中的表達量最低，說明VwDFR主要在花瓣中表達，且色斑區(qū)的表達水平高于非色斑區(qū)。

3討論與結論

本研究中利用RT-PCR同源克隆和RACE技術相結合的方法，從三色堇的花瓣中克隆得到花青素合成結構基因VwDFR全長cDNA序列。通過對其編碼的氨基酸序列保守結構域分析表明，三色堇VwDFR編碼蛋白N端存在2個高度保守功能結構域-NADP 的結合功能域和底物特異結合功能域，是植物SDR superfamily超基因家族蛋白的典型特征。本研究得到的VwDFR基因與其他植物DFR氨基酸序列的一致性較高，其中與楊柳科的胡楊DFR氨基酸序列一致性最高，為83%。且系統(tǒng)進化分析表明，VwDFR和胡楊的DFR親緣關系較近，而與單子葉植物的鳶尾、百合和小麥等的親緣關系較遠，表明VwDFR基因的進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律。

本研究中對三色堇不同組織器官的VwDFR熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，在初花期的花瓣中表達量最高，這與李琴等的研究結果[14]一致，說明VwDFR是三色堇花色素合成的關鍵基因。此外，VwDFR在根中的表達量也較高，這可能與DFR基因的表達存在組織特異性有關[15]。

花色素結構基因是花色素生物合成的基礎，現(xiàn)有的研究表明，植物花瓣上的花斑是由于花色素基因的差異性表達而形成的[16]。DFR基因首次從玉米（Zea mays）和金魚草（Antirrhinum majus）中分離得到，后來相繼從其他多種植物（如擬南芥、三葉草、玫瑰、蘭花、非洲菊等）中克隆出DFR[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)一些植物花瓣上花斑的形成與DFR基因的差異性表達相關，如蝴蝶蘭小丑型品種中其花瓣上大塊的紫色色斑，主要由于是DFR基因在色斑區(qū)特異性表達導致[20]；在文心蘭的花瓣和萼片中，其色斑形成的基礎是因為OgCHI 和OgDFR基因表達被遏制[21]；而在百合品種Sorbonne中，LhDFR在無色斑的邊緣區(qū)域表達水平很低，但在花被片的色點部位以及有色斑的中心部位高度表達[22]。

綜上所述，筆者初步推測本試驗所克隆得到的VwDFR基因可能在三色堇花瓣中存在差異性表達，三色堇花瓣花色及色斑的形成可能與VwDFR的表達有關。本研究結果為深入揭示三色堇花色及色斑形成奠定了基礎，進而為創(chuàng)新花色奠定基礎。

參考文獻：

[1]Luo D，Carpenter R，Vincent C，et al. Origin of floral asymmetry in Antirrhinum[J]. Nature，1996，383（663）：794-799.

[2]Quattrocchio F，Wing J F，van Der Woude K，et al. Analysis of bHLH and MYB domain proteins：species-specific regulatory differences are caused by divergent evolution of target anthocyanin genes[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，1998，13（4）：475-488.

[3]Quattrocchio F，Wing J，van Der Woude K，et al. Molecular analysis of the anthocyanin2 gene of petunia and its role in the evolution of flower color[J]. The Plant Cell，1999，11（8）：1433-1444.

[4]Albert N W，Lewis D H，Zhang H，et al. Members of an R2R3-MYB transcription factor family in Petunia are developmentally and environmentally regulated to control complex floral and vegetative pigmentation patterning[J]. The Plant Journal，2011，65（5）：771-784.

[5]Perez-Rodriguez M，Jaffe F W，Butelli E，et al. Development of three different cell types is associated with the activity of a specific MYB transcription factor in the ventral petal of Antirrhinum majus flowers[J]. Development，2005，132（2）：359-370.

[6]程金水. 園林植物遺傳育種學[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2000：36-40.

[7] Endo T. Biochemical and genetical investigations of flower color in Swiss Giant Pansy，Viola × Wittrockiana Gams Ⅰ Inter-relationships of pigment constituents occurring in ten varieties [J]. Jap J Bot，1954，14：187-193.

[8]Biochemical E T. Genetical investigations of flower color in Swiss Giant Pansy. Viola×wittrockiana Gams Ⅲ：dominance relations in F1 hybrids，with special reference to flower color and anthocyanin pigment constituents[J]. The Japanese Journal of Genetics，1959，34（4）：116-124.

[9] Tanaka Y，Sasaki N，Ohmiya A. Plant pigments for coloration：anthocyanins，betalains and carotenoids [J]. Plant J，2008，54，733-749.

[10] Griesbach，R.J. Biochemistry and genetics of flower color [J]. Plant Breed，2005，25：89-114.

[11]Johnson E T，Ryu S，Yi H，et al. Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase[J]. The Plant Journal，2001，25（3）：325-333.

[12]李琴，王健，趙鐘鑫，等. 三色堇花瓣總RNA 3種提取方法的比較[J]. 江蘇農業(yè)科學，2013，41（5）：24-26.

[13]祁銀燕，劉雅莉，李莉，等. 風信子DFR基因全長cDNA的克隆及序列分析[J]. 中國農學通報，2009，25（24）：62-67.

[14]Li Q，Wang J，Sun H Y，et al. Flower color patterning in pansy （Viola×wittrockiana Gams.） is caused by the differential expression of three genes from the anthocyanin pathway in acyanic and cyanic flower areas[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2014，84：134-141.

[15]Liu M S，Wang F，Dong Y X，et al. Expression analysis of dihydroflavonol 4-reductase genes involved in anthocyanin biosynthesis in purple grains of wheat[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2005，47（9）：1107-1114.

[16]尚嘯，王健，李琴，等. 植物花斑形成分子機理研究進展[J]. 園藝學報，2014，41（7）：1485-1494.

[17]陶吉寒，招雪晴，苑兆和，等. 石榴DFR基因的同源克隆及分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2013，41（4）：22-24.

[18]Viljoen C D，Snyman M C，Spies J J. Identification and expression analysis of chalcone synthase and dihydroflavonol 4-reductase in Clivia miniata[J]. South African Journal of Botany，2013，87：18-21.

[19]尚潔，趙海燕，朱武政. 構杞DFR基因cDNA片段的克隆及生物信息學分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2013，41（10）：33-37.

[20]Ma H，Pooler M. Anthocyanin regulatory/structural gene expression in Phalaenopsis[J]. Amer Soc Hort Sci，2009，134（1）：88-96.

[21]Chiou C Y，Yeh K W. Differential expression of MYB gene （OgMYB1） determines color patterning in floral tissue of Oncidium Gower Ramsey[J]. Plant Molecular Biology，2008，66（4）：379-388.

[22]Yamagishi M. Oriental hybrid lily Sorbonne homologue of LhMYB12 regulates anthocyanin biosyntheses in flower tepals and tepal spots[J]. Molecular Breeding，2011，28（3）：381-389.楊紅，張勇，田啟培，等. 高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞GH基因多態(tài)性及生物信息學分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（11）：38-41.