香蕉抗壞血酸過氧化物酶基因的克隆及表達分析

王卓+徐碧玉+賈彩紅+李健平

摘 要 抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase， APX）是植物重要的過氧化氫（Hydrogen peroxide， H2O2）清除酶之一。通過RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）方法從香蕉根系cDNA均一化全長文庫中獲得一個抗壞血酸過氧化物酶基因，命名為MaAPX2基因。MaAPX2基因是香蕉APX基因編碼框全長cDNA，包含一個750 bp的最大開放閱讀框（Open Reading Frame， ORF），編碼249個氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)域比對發(fā)現(xiàn)，在MaAPX2 N端具有典型的APX活性位點（APLMLPLAWHSA）和過氧化物酶近端血紅素配體序列（DIVALSGGHTL）的保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的APX蛋白。系統(tǒng)進化樹比對分析表明，MaAPX2與馬蹄蓮ZaAPX（AAC08576.1）的親緣關(guān)系較近。組織特異性研究表明，MaAPX2基因組成型表達于香蕉各個組織，在葉片中表達量最大。在耐病和感病品種中，MaAPX2基因均上調(diào)表達，但在耐病品種中MaAPX2基因在所有時間點相對于對照增加的倍數(shù)均高于感病品種，表明該基因在香蕉的抗病性中起著重要作用。MaAPX2基因可以作為一個新的響應(yīng)枯萎病侵染的標記基因。

關(guān)鍵詞 香蕉 ；抗壞血酸過氧化物酶 ；基因克隆 ；表達分析

分類號 S668.1

Molecular Cloning and Expression of Ascorbate Peroxidase Gene

from Banana（Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）

WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）

LIU Juhua1） ZHANG Jianbing1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）

（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；

2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102 China）

Abstract Ascorbate peroxidase （APX） is one of the key enzymes of hydrogen peroxide scavenging in plants. In this study，we reported the molecular characteristics of APX gene cloned from banana （Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish） using a RACE-PCR-based strategy. MaAPX2 contained an open reading frame （ORF） of 750 bp which encoded a polypeptide of 249 amino acids. Protein alignment showed that MaAPX2 contain the complete typical conserved APX active-site signature and proximal heme-ligand motif， which belongs to a typical APX protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaAPX2 also have high similarity to ZaAPX （AAC08576.1） from Zantedeschia aethiopica. Tissue-specific studies showed that the expression of MaAPX2 was constitutively expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaAPX2 was decreased. While in resistant varieties the time point of MaAPX2， compared to control， increased higher than that in susceptible varieties at time points，indicated that this gene played an important role in banana resistance. MaAPX2 could be a new marker gene in banana seedling under the infection of Foc TR4.

Keywords banana ； ascorbate peroxidase ； gene clone ； expression analysis

在正常生理活動時，活性氧（Reactive oxygen species， ROS）含量處于一定的動態(tài)平衡。低濃度的ROS可作為胞內(nèi)信號分子，調(diào)控相關(guān)基因的表達；然而過量的ROS則會引起胞內(nèi)膜脂過氧化、膜蛋白聚合等反應(yīng)，損傷植物細胞膜[1]。過氧化氫（Hydrogen peroxide， H2O2）是ROS的一種[2]，參與植物對病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)[3]，是植物與病原菌互作時形成的產(chǎn)物[4-5]?？箟难徇^氧化物酶（Ascorbate peroxidase， APX）（EC 1.11.1.11）屬于Ⅲ類過氧化物酶，以抗壞血酸（Ascorbic acid， AsA）為底物將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，進而維持植物體內(nèi)H2O2含量處于正常水平[6]。在植物中，APX基因編碼的蛋白根據(jù)在細胞中分布的位置可分為細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和過氧化物酶體四種類型[7]。在植物-病原菌互作中，如煙草和煙草花葉病毒[8]、水稻和稻瘟菌[9]、葡萄和白粉病菌[10]、甜瓜和白粉菌[11]，APX基因的表達均受病原菌侵染的誘導(dǎo)，表明APX基因在植物-病原菌互作中起著重要作用。到目前為止，MaAPX1基因參與香蕉果實采后成熟，受乙烯和ABA的調(diào)控[12]。在香蕉A基因組中預(yù)測出12個APX基因[13]，表明香蕉APX基因的克隆及功能分析還需進一步完善。然而到目前為止，還沒有進一步研究APX基因與枯萎病關(guān)系的相關(guān)報道。

香蕉是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國家重要的農(nóng)作物之一。其果實由于富含豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物，是部分熱區(qū)的主要糧食和國民收入的主要來源[14]。然而香蕉枯萎病嚴重威脅香蕉的正常生產(chǎn)[15]。抗病育種是克服香蕉枯萎病的方法之一[16]，目前生產(chǎn)上主栽的品種‘巴西蕉由于是三倍體且生長周期長，雜交育種方法很難開展抗病育種，因此篩選及鑒定基于射線誘變、化學(xué)誘變及自然突變體抗枯萎病株系是有效的途徑。目前在香蕉中參與香蕉抗病的重要的標記基因報道較少。本研究從香蕉中分離并克隆一個MaAPX基因，利用生物信息學(xué)網(wǎng)站分析了該基因的結(jié)構(gòu)特性，采用熒光定量技術(shù)分析了該基因的表達模式，進一步了解MaAPX基因參與香蕉抗枯萎病過程的調(diào)控機理，開發(fā)可供進一步使用的香蕉抗枯萎病種質(zhì)鑒定的標記基因，具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香蕉品種為‘巴西蕉（cv. Cavendish）和‘農(nóng)科1號（cv. Nongke No.1），購自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培中心，苗齡為移栽大棚后約60 d的健康杯苗，其中‘巴西蕉為枯萎病菌感病品種，‘農(nóng)科1號為耐病品種。香蕉枯萎病菌4號生理小種[Fusarium Oxysporum f specialis （f. Sp） cubense Tropical Race 4， Foc TR4]，為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所張欣博士饋贈。

1.2 方法

1.2.1 MaAPX2基因克隆及分析

在香蕉根系cDNA全長均一化文庫隨機測序的克隆中[17]，獲得一條APX基因序列，設(shè)計5'RACE引物，按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）說明書進行RACE反應(yīng)，獲得完整的ORF。將該基因序列在經(jīng)過NCBI核酸數(shù)據(jù)庫B進行同源檢索、分析其核酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點；并利用MEGA4.0軟件分析該基因編碼的蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）和香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中相應(yīng)蛋白序列的進化關(guān)系。

1.2.2 MaAPX2基因在香蕉不同器官的表達分析

選取生長8個月的香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實，參照略作修改的Wan和Wilkins[18]報道的方法提取上述各組織總RNA。利用Invitrogen SuperScript TMⅢ Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA。在MaAPX2基因5′端非保守區(qū)域設(shè)計引物，引物為P1（5′-GAGAAGGGAGAACGGAGTC-3′）和P2（5′-TCCCACCTTGAAGTTGCT-3′）。MaActin1引物為NP1（5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′）和NP2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）。以MaActin1基因片段為內(nèi)參，采用熒光定量PCR方法對其進行組織特異性表達分析，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性7 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次。實時定量PCR采用SYBR Green染料，在吉泰生物科技公司Mx 3005P熒光定量PCR儀上進行。

1.2.3 MaAPX2基因在香蕉接種Foc TR4后的表達分析

將Foc TR4孢子懸浮液，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，28 ℃培養(yǎng)7 d，收集Foc TR4孢子。將‘巴西蕉（cv. Cavendish AAA）和‘農(nóng)科1號（cv. Nongke No.1）分為2組，每組60株幼苗。以蘸根接菌法接種Foc TR4，接種濃度為每毫升為1×106個孢子。接種后2、4、6 d取樣，以未接種的0 d為對照。以接種后不同時間點的香蕉根系cDNA第一鏈為模板，引物同“1.2.2”，采用實時熒光定量PCR檢測MaAPX2基因的表達，反應(yīng)程序同“1.2.2”。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗組均做3次生物重復(fù)，利用SAS軟件（SAS 9.0 for Windows）進行顯著性分析，“**”、“*”分別表示差異達到極顯著（p<0.01）和顯著水平（p<0.05）。結(jié)果用KyPlot軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaAPX2基因克隆與序列分析

測序后經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該序列與其他植物APX基因序列具有較高的同源性，表明該序列是香蕉APX基因編碼框全長cDNA，命名為MaAPX2。MaAPX2基因序列全長為990 bp，其中5′非翻譯區(qū)48 bp，3′非翻譯區(qū)181 bp，含有一個750 bp的ORF，編碼249個氨基酸殘基（圖1）。MaAPX2基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為27.37 ku，等電點為5.31。在推導(dǎo)的蛋白序列方面，MaAPX2與其他植物的APX的蛋白序列具有較高的相似性（圖2）。MaAPX2基因在香蕉A基因組[13]進行比對，找到與其高度同源的GSMUA_Achr5P07280_001基因，二者僅有2個核苷酸存在差異，分別位于第455、521號位點；進一步比較發(fā)現(xiàn)，二者氨基酸序列一致。在GenBank中對MaAPX2蛋白質(zhì)進行保守結(jié)構(gòu)域搜索和同源性分析，它的氨基酸序列在N端具有典型的APX活性位點（APLMLPLAWHSA）（圖2 A區(qū)域）和一個過氧化物酶近端血紅素配體序列（DIVALSGGHTL）（圖2 H區(qū)域），表明MaAPX2蛋白屬于APX家族成員。為了研究MaAPX2與其它各物種間的進化關(guān)系，將MaAPX2的氨基酸序列和其它植物的APX氨基酸序列利用軟件MEGA4.0中的N-J的方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，由圖3可見，所有APX蛋白可以分為4個類型。MaAPX2分屬于細胞質(zhì)型APX蛋白，它與馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）的ZaAPX（AAC08576.1）同源關(guān)系最近（圖3）。

2.2 MaAPX2基因組織特異性表達分析

MaAPX2在根中表達量最低；葉中表達量最高，是根中的4.7倍；花、球莖和果實中表達量較高，其表達量是根系中相對表達量的3.2和2.1倍（圖4）。

2.3 MaAPX2基因在不同抗性的香蕉品種接種Foc TR4后的表達分析

在感病品種中，MaAPX2基因的相對表達量在接種Foc TR4后1和2 d變化不大，在接種后3 d，其相對表達量是對照的1.6倍（圖5）。在耐病品種中MaAPX2基因的相對表達量在接種Foc TR4后顯著增加，在1 d達到最大，是對照的6.6倍；雖然在接種2和3 d有所降，但其表達量還是高于對照，同樣其相對表達量也高于感病品種。因此，從相對表達量的變化上看，MaAPX2基因在感病品種中變化不顯著，而在耐病品種中被顯著激活，而且耐感品種中表達模式與抗性相關(guān)，表明該基因可能參與香蕉抗枯萎病的過程。

3 討論

活性氧物質(zhì)的生成是植物防御反應(yīng)重要步驟[1，19]，APX是與H2O2親和力最強的過氧化物酶，在植物響應(yīng)病原菌侵染過程中具有重要的作用[8]。本研究獲得一個全長香蕉APX基因。在序列分析方面，該基因與其他植物的APX基因具有較高的同源性。MaAPX2基因編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸的數(shù)目、分子量和等電點等方面，與已報道的MaAPX1相似[12]，同樣也與其它植物APX蛋白特征相似[9-11]。MaAPX2基因推導(dǎo)氨基酸序列中包含一個APX活性位點（AP-LMLPLAWHSA，圖2A區(qū)域）和一個過氧化物酶近端血紅素配體序列（DIVALSGGHTL）[20]。同時MaAPX2基因與香蕉A基因組中預(yù)測出的chr5T07280_001高度同源，表明栽培的巴西蕉品種（AAA group）與測序的DH-Pahang品種（AA group）親緣關(guān)系很近，同樣結(jié)果也表明，2個品種的APX基因是同源基因，其差異主要是序列間的SNP形成的（結(jié)果未列出），這些SNP可以作為潛在的分子標記為后續(xù)的香蕉育種服務(wù)。植物APX基因家族由4個亞家族組成，分別為細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和過氧化物酶體基因亞家族[7]。在擬南芥中包含8個APX基因成員[21-23]，APX1、APX2和APX6基因編碼的蛋白位于細胞質(zhì)，sAPX基因編碼的蛋白存在于葉綠體基質(zhì)，結(jié)合在類囊體膜上的tAPX基因編碼的蛋白位于葉綠體，APX3、APX4和APX5基因編碼的蛋白存在于過氧化物酶體。聚類分析結(jié)果顯示，MaAPX2與其他植物的細胞質(zhì)型APX親緣關(guān)系相近，表明MaAPX2是一個典型的香蕉細胞質(zhì)型抗壞血酸過氧化物酶。

在多種植物如蝴蝶蘭[24]、茶樹[25]、黃芩[26]和甘蔗[27]中，APX基因在根、莖、葉和花等組織中均有表達，同樣在本研究中供試的根、球莖、假莖、葉、花和果實中均檢測到MaAPX2基因的表達，表明MaAPX2基因在香蕉組織中屬于組成型表達，推測MaAPX2基因可能在香蕉的生長和發(fā)育過程中起著重要作用。APX基因與植物抗病密切相關(guān)[8-11]，APX對H2O2高度親和[6]，因此在植物和病原菌互作時，APX酶活性對H2O2的含量起著重要的調(diào)控作用，進而影響植物的抗病性。在香蕉與枯萎病菌互作中APX酶活作為一個抗病指標水平，參與香蕉抗枯萎病的過程[28]。MaAPX2基因在感病品種中的基因表達被抑制，而在耐病品種中被激活，MaAPX2基因表達與香蕉抗病性正相關(guān)，說明該基因可能參與香蕉響應(yīng)Foc TR4侵染的過程。目前，香蕉抗病種質(zhì)的創(chuàng)制與篩選是解決香蕉枯萎病的有效方法之一，然而缺乏有效的抗病種質(zhì)的鑒定方法。MaAPX2基因在耐病品種中表達趨勢與感病品種相反且相對表達量的倍數(shù)高于感病品種，因此該基因可以當(dāng)作一個新的檢測枯萎病菌侵染的標記基因。今后將深入研究MaAPX基因參與香蕉抗枯萎病的內(nèi)在機制，以期揭示APX在香蕉抗枯萎病中的生理作用。

參考文獻

[1] Dat J， Vandenabeele S， Vranova E， et al. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2000， 57（5）： 779-795.

[2] Slesak I， Libik M， Karpinska B， et al. The role of hydrogen peroxide in regulation of plant metabolism and cellular signalling in response to environmental stresses[J]. ACTA BIOCHIMICA POLONICA-ENGLISH EDITION， 2007， 54（1）： 39.

[3] Walters， D. Resistance to plant pathogens：possible roles for free polyamines and polyamine catabolism[J]. New Phytologist， 2003， 159（1）： 109-115.

[4] Shetty N， Kristensen B， Newman M， et al. Association of hydrogen peroxide with restriction of Septoria tritici in resistant wheat[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2003， 62（6）： 333-346.

[5] Unger C， Kleta S， Jandl G， et al. Suppression of the defence-related oxidative burst in bean leaf tissue and bean suspension cells by the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea[J]. Journal of Phytopathology， 2005， 153（1）： 15-26.

[6] Asada K. Ascorbate peroxidase-a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants[J]. Physiologia Plantarum， 1992， 85（2）： 235-241.

[7] Shigeoka S， Ishikawa T， Tamoi M， et al. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[8] Mittler R， Lam E， Shulaev V， et al. Signals controlling the expression of cytosolic ascorbate peroxidase during pathogen-induced programmed cell death in tobacco[J]. Plant molecular biology， 1999， 39（5）： 1 025-1 035.

[9] Agrawal G， Jwa N， Iwahashi H， et al. Importance of ascorbate peroxidases OsAPX1 and OsAPX2 in the rice pathogen response pathways and growth and reproduction revealed by their transcriptional profiling[J].Gene， 2003， 322： 93-103.

[10] Lin L， Wang X， Wang Y. cDNA clone， fusion expression and purification of the novel gene related to ascorbate peroxidase from Chinese wild Vitis pseudoreticulata in E. coli[J]. Molecular biology reports， 2006， 33（3）： 197-206.

[11] Cheng H， He Q， Huo Y， et al. Molecular cloning， characterization and expression analysis of CmAPX[J]. Molecular biology reports， 2009， 36（6）：1 531-1 537.

[12] Wang Z， Jin Z， Wang J， et al. Cloning and characterization of an ascorbate peroxidase gene regulated by ethylene and abscisic acid during banana fruit ripening[J]. African Journal of Biotechnology， 2012， 11（43）：10 089.

[13] D'Hont A， Denoeud F， Aury JM， et al. The banana （Musa acuminata） genome and the evolution of monocotyledonous plants[J]. Nature， 2012， 488（7410）：213-217.

[14] Aurore G， Parfait B， Fahrasmane L. Bananas， raw materials for making processed food products[J]. Trends in Food Science & Technology， 2009， 20（2）：78-91.

[15] Hwang SC， Ko WH. Cavendish banana cultivars resistant to Fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan[J]. Plant disease， 2004， 88（6）：580-588.

[16] 魏岳榮，黃秉智，楊 護，等. 香蕉鐮刀菌枯萎病研究進展[J].果樹學(xué)報，2005，22（2）：154-159.

[17] 王 卓，殷曉敏，王家保，等. 香蕉根系均一化全長cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定[J]. 園藝學(xué)報，2011，38（9）：1 667-1 674.

[18] Wan CY， Wilkins T A. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Analytical biochemistry， 1994， 223（1）：7-12.

[19] Mittler R， Vanderauwera S， Suzuki N， et al. ROS signaling：the new wave？[J]. Trends in plant science， 2011， 16（6）：300-309.

[20] Bairoch A. PROSITE：a dictionary of sites and patterns in proteins[J]. Nucleic Acids Research， 1991， 19（Suppl）：2241.

[21] Mittler R， Vanderauwera S， Gollery M， et al. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in plant science， 2004， 9（10）：490-498.

[22] Panchuk I， Volkov R， Schoffl F. Heat stress-and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2002， 129（2）：838-853.

[23] Narendra S， Venkataramani S， Shen G， et al. The Arabidopsis ascorbate peroxidase 3 is a peroxisomal membrane-bound antioxidant enzyme and is dispensable for Arabidopsis growth and development[J]. Journal of experimental botany， 2006， 57（12）：3033-3042.

[24] 許傳俊，孫敘卓，李 玲，等. 蝴蝶蘭抗壞血酸過氧化物酶基因克隆及其表達研究[J]. 園藝學(xué)報，2012，39（4）：769-776.

[25] 孫 云，江春柳，賴鐘雄，等. 茶樹鮮葉抗壞血酸過氧化物酶活性的變化規(guī)律及測定方法[J]. 熱帶作物學(xué)報，2009，29（5）：562-566.

[26] 謝小群，高山林. 黃芩過氧化酶同工酶電泳和抗壞血酸過氧化物酶活性分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，2002，11（1）：5-8.

[27] 王竹青，陳 云，楊玉婷，等. 甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因（ScAPX）的克隆及表達分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2015，23（2）：170-180.

[28] Borges A， Borges-Perez A， Fernandez-Falcon M. Induced resistance to Fusarial wilt of banana by menadione sodium bisulphite treatments[J]. Crop Protection， 2004， 23（12）：1 245-1 247.