長期施氮對(duì)甘蔗根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

關(guān)鍵詞：甘蔗；氮肥；根際土壤真菌；根系內(nèi)生真菌；高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S566.1；S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

甘蔗（Saccharum officinarum L.）作為一種重要的糖料和能源作物，消耗養(yǎng)分多，對(duì)肥料和水分的需求量非常大[1]。中國是世界第三大甘蔗生產(chǎn)國，大約90%的甘蔗種植在華南和西南地區(qū)，包括廣西、廣東和云南[2]。自1993年以來，廣西一直是中國最大的甘蔗生產(chǎn)和制糖地區(qū)，占全國食糖產(chǎn)量的65%以上[3]。然而，我國甘蔗單產(chǎn)偏低仍是制約我國蔗糖產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的重大問題[4]。為了提高甘蔗產(chǎn)量，生產(chǎn)中常存在盲目施用化肥的現(xiàn)象[2]，引發(fā)諸多土壤和環(huán)境問題。土壤肥力平衡對(duì)甘蔗生長起著至關(guān)重要的作用，過量施用化肥則會(huì)嚴(yán)重消耗土壤中的養(yǎng)分，顯著降低耕地質(zhì)量[5]。

氮素是一種影響作物生長的重要必需營養(yǎng)元素，同時(shí)也是全球糧食安全的關(guān)鍵支柱[6]。已有研究證實(shí)[7]，過量施用氮肥非但不利于提高甘蔗產(chǎn)量而且還會(huì)降低肥料利用率，導(dǎo)致甘蔗的糖分、視純度和重力純度下降，影響甘蔗的品質(zhì)[8]；同時(shí)，長期過量施用氮肥不僅會(huì)浪費(fèi)農(nóng)業(yè)資源，還會(huì)造成養(yǎng)分流失，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境[9-10]。周晶[11]研究發(fā)現(xiàn)，氮肥水平能顯著影響土壤真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成。此外，過量施氮還會(huì)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，降低土壤中細(xì)菌/真菌的比值，導(dǎo)致土壤微生物從“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)化成“真菌型”，促使土壤微生物區(qū)系失衡[12]。鄧德雷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，過量施氮會(huì)引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，使土壤從“抑病型”向“導(dǎo)病型”方向轉(zhuǎn)變，滋生土傳病害，抑制植株長勢(shì)并降低經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，且大部分土傳病害為“真菌型”。另一方面，陳薇等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同氮素供應(yīng)水平對(duì)內(nèi)生真菌的豐度產(chǎn)生不同影響。李瑞霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，低氮（189 kg/hm²）和高氮（270 kg/hm²）施肥均顯著改變玉米根系內(nèi)生球囊菌門真菌的豐度。由于根系與土壤密切接觸，其定殖的內(nèi)生真菌主要來自于土壤微生物的遷移。

土壤真菌與土傳病害的發(fā)生密切相關(guān)，而內(nèi)生真菌通過調(diào)節(jié)植物激素和次生代謝產(chǎn)物協(xié)助寄主植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，對(duì)植物生長發(fā)揮著積極作用[15]。以森林生態(tài)系統(tǒng)為例，林木根內(nèi)真菌群落組成已作為指示森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的一個(gè)微生物視角[16]。我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用氮肥過量和不足均會(huì)嚴(yán)重阻礙我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[12]。單一施氮易導(dǎo)致土傳病害發(fā)生和植株抗性下降[17-18]，但其發(fā)生機(jī)制仍鮮見報(bào)道。解析單一施氮對(duì)蔗田土壤生態(tài)及植株抗性的影響機(jī)制，探究甘蔗合理的氮肥施用量，旨在構(gòu)建甘蔗科學(xué)的氮肥施用技術(shù)體系及為甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。為此，本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，分析長期不同施氮處理對(duì)甘蔗根際土壤和根系真菌群落組成的影響，從生物學(xué)角度解析氮肥施用對(duì)蔗田土壤生態(tài)系統(tǒng)和甘蔗植株抗性的影響，探究甘蔗氮肥合理的施用量，旨在為廣西甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試甘蔗品種為桂糖49 號(hào)，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供。供試氮源為安陽中盈化肥有限公司生產(chǎn)的總氮含量≥46.0%的眾盈牌尿素[CO（NH₂）₂]。

1.1.2 試驗(yàn)地概況 本試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所的隆安丁當(dāng)試驗(yàn)基地（22°37′02″N，107°52′36″E）進(jìn)行。土壤類型為黃壤土，地勢(shì)平坦，排灌條件良好，前茬作物為甘蔗。供試土壤基本理化性質(zhì)如下：pH 5.1，有機(jī)質(zhì)含量為17.60 g/kg，全氮含量為0.92 g/kg，全磷含量為0.92 g/kg，全鉀含量為0.56 g/kg，堿解氮含量為85.00 mg/kg，速效磷含量為35.30 mg/kg，速效鉀含量為125.00 mg/kg。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)于2018 年開始進(jìn)行。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，參照廣西甘蔗產(chǎn)區(qū)常規(guī)施肥水平，共設(shè)置4 種施氮水平，一次性施用，分別為：不施氮處理（CK，對(duì)照）；低氮處理（L）：尿素96 kg/hm²；中氮處理（M）：尿素482 kg/hm²；高氮處理（H，常規(guī)施肥）：尿素964 kg/hm²。上述處理除施氮水平不同外，其余田間管理措施（如灌溉和除草等）均相同。每種施氮模式作為1 個(gè)試驗(yàn)處理，共4 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共12 個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)5 行，長7.0 m，寬1.2 m，每個(gè)小區(qū)面積42 m²。此外，下種量為90000 芽/hm²，選擇無病蟲害、蔗莖均勻、蔗芽飽滿的莖種按雙行品字形進(jìn)行擺種，蓋3～5 cm 厚細(xì)泥、覆蓋地膜。為避免水分和養(yǎng)分在各小區(qū)處理間流動(dòng)，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)（6 m×7 m）均用聚乙烯薄膜覆蓋的壟（寬30cm、高15cm）隔離開。每年3 月上旬種植甘蔗，翌年1—2月采收。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 試驗(yàn)處理的第4 年（2021 年），待甘蔗越過分蘗期，進(jìn)入伸長期，根系發(fā)育基本定型后，于6 月下旬隨機(jī)采集不同施氮處理下甘蔗根系和根際土壤樣品。參照YANG 等[3]的方法采集樣品，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取6 株長勢(shì)一致的健康甘蔗植株，使用經(jīng)75%乙醇噴灑消毒后的鐵鏟，以蔗莖為中心挖開，形成疏松、環(huán)形、深度約40cm、直徑約60cm 的根際圈。然后手握植株莖基部用力將整個(gè)植株連根帶土拔起，抖落附著在根部的土壤，并將隨機(jī)選取的6 份甘蔗根際土壤混合均勻。標(biāo)記后裝入無菌密封袋，置于有冰袋的冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。根際土壤使用2mm 孔不銹鋼篩過篩，保存于?80 ℃冰箱，用于測(cè)定土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

參照肖健等[19]的方法對(duì)甘蔗根系進(jìn)行消毒處理，具體操作方法簡述如下：使用流動(dòng)無菌水持續(xù)沖洗根系表面，用軟毛刷輕輕擦拭2 min，去除表面雜質(zhì)和附著物，用無菌紙擦干，去除水分；然后用經(jīng)75%乙醇噴灑消毒后的剪刀采集植株根系樣品，用無菌水洗滌樣品0.5 min，接著在75%乙醇中洗滌1 min，再用1%的NaClO 溶液洗滌3 min，最后使用無菌水洗滌植物組織0.5 min 并用無菌濾紙吸干，即視為對(duì)植物組織表面進(jìn)行無菌化處理。為確定根系表面殺菌的成功與否，將洗凈根系的100 μL 水置于Luria-Bertani（LB）瓊脂平板（g/L）（NaCl：10 g；胰蛋白胨：5 g；酵母提取物：5 g；瓊脂：20 g）上，25 ℃培養(yǎng)7d。平板中未見菌落，證實(shí)已徹底消毒。將表面無菌化的甘蔗根系樣品用于根系內(nèi)生真菌檢測(cè)分析。

1.2.2 甘蔗土壤理化性質(zhì)分析 參照肖健等[20]的方法對(duì)甘蔗根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析。

1.2.3 真菌高通量測(cè)序分析 土壤和根系樣品總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)序流程簡述如下：使用FastDNA Spin Kit 試劑盒（MP Biomedicals，U.S.）對(duì)甘蔗根際土壤和根系樣品進(jìn)行總DNA 抽提，并使用NanoDrop2000 分光光度計(jì)（ThermoFisher Scientific， U.S.）檢測(cè)DNA 濃度和純度，選用ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）為引物對(duì)真菌ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；然后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （ AxygenBiosci-ences， Union City， CA， USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusFluorometer（Promega， U.S.）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)；使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫；最后利用Illumina 公司的MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。參照肖健等[7]的處理方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Mothur（v.1.30.2）軟件計(jì)算真菌群落的Alpha 多樣性。選擇相似度為97%的OTU 表，使用R 語言（v.3.3.1）工具進(jìn)行真菌群落組成分析、PCoA 分析和維恩圖分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖。以Shannon 指數(shù)表示真菌的多樣性，Chao 1 指數(shù)表示真菌的豐富度。Shannon 和Chao 1 指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性和豐富度越高[20]。使用LEfSe 軟件對(duì)樣品按照基于分類學(xué)組成的不同分組條件進(jìn)行線性判別分析（LDA），以確定對(duì)樣品劃分有明顯差異影響的群組。

使用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用IBM SPSS Statistics 21 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s 法、秩和檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05），數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的生信云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https：//cloud.majorbio.com/）進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮處理下甘蔗根際土壤理化性質(zhì)

結(jié)果表明，與不施氮（CK）處理相比，不同施氮處理并未顯著改變甘蔗根際土壤中的pH、全磷（TP）、全鉀（TK）、速效磷（AP）、速效鉀（AK）含量等土壤理化性狀指標(biāo)。高氮（H）和中氮（M）處理均顯著提高甘蔗根際土壤中有機(jī)質(zhì)（SOM）和全氮（TN）含量，而低氮處理和CK 之間差異不顯著。高氮（H）處理顯著提高甘蔗根際土壤中堿解氮（AN）含量，而中氮（M）、低氮（L）處理和CK 之間同樣差異不顯著（表1）。

2.2 不同施氮處理下甘蔗根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌多樣性分析

不同施氮處理下甘蔗根際土壤真菌測(cè)序處理數(shù)據(jù)如下：質(zhì)控后樣本序列數(shù)（clean reads）為61 618.67～71 633.00，樣本有效序列數(shù)（effectivereads）為60 396.67～69 926.67，序列平均長度（mean length）為228.91～241.55 bp，質(zhì)量值≥20的堿基占總堿基數(shù)的百分比（Q20）為99.56%～99.65%，質(zhì)量值≥30 的堿基占總堿基數(shù)的百分比（Q30）為99.01%～99.21%，樣本有效序列占質(zhì)控后樣本序列的百分比（ effective） 為97.55%～98.01%（圖1A）。根系內(nèi)生真菌測(cè)序處理數(shù)據(jù)如下：clean reads 為57 394.67～68 877.67，effectivereads 為57 045.00～68 601.67，mean length 為258.55～272.32 bp，Q20 為99.53%～99.78%，Q30為98.93%～99.43%，effective 為99.01%～99.70%。根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌的香農(nóng)稀釋曲線（圖1B）和覆蓋率（表2）全部達(dá)到數(shù)據(jù)分析要求，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。由表2 可知，與CK 相比，雖然不同施氮處理并未顯著改變甘蔗根際土壤真菌的多樣性（Shannon）指數(shù)，但顯著提高了甘蔗根際土壤真菌的豐富度（Chao 1）指數(shù)。不同施氮處理之間，甘蔗根際土壤真菌的豐富度指數(shù)并無顯著差異。雖然不同施氮處理均未顯著改變甘蔗根際土壤真菌的多樣性，但均顯著提高了甘蔗根際土壤真菌的豐富度。對(duì)內(nèi)生真菌而言，與CK相比，不同施氮處理亦未顯著改變甘蔗根系內(nèi)生真菌的多樣性和豐富度，且各施氮處理間均無顯著差異?；贠TU 水平的主坐標(biāo)分析（principalCo-ordinates analysis， PCoA）發(fā)現(xiàn)，不同施氮處理下，雖然甘蔗根際土壤真菌（圖1C）和根系內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著差異，但每組樣品聚類在一起，組間群落結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較小（圖1D）。

2.3 真菌群落組成分析

2.3.1 不同施氮處理下甘蔗根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌門分類水平組成 門分類水平，4 種不同施氮處理下，甘蔗根際土壤中相對(duì)豐度占比大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌門分類水平數(shù)量均為4 個(gè)。其中，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和unclassified_k__Fungi 是4 種處理所共有的甘蔗根際土壤優(yōu)勢(shì)真菌門類（圖2A）。CK 處理甘蔗根際土壤優(yōu)勢(shì)真菌門分類相對(duì)豐度占比大小排序依次分別為：子囊菌門（78.86%）、擔(dān)子菌門（ 16.23% ）， unclassified_k__Fungi（ 3.71% ） 和被孢霉門（ Mortierellomycota ，1.14%）；低氮處理下甘蔗根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度占比大小排序依次為： 子囊菌門（79.97%）、擔(dān)子菌門（16.26%）、unclassified_k__Fungi（1.97%）和被孢霉門（1.71%）；中氮處理下甘蔗根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度占比大小排序依次為：子囊菌門（59.24%）、擔(dān)子菌門（28.82%）、unclassified_k__Fungi（9.09%）和羅茲菌門（Rozellomycota，1.86%）；高氮處理下甘蔗根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分類相對(duì)豐度占比大小排序依次分別為：子囊菌門（67.78%），擔(dān)子菌門（20.86%），unclassified_k__Fungi（9.43%）和被孢霉門（1.59%）。上述結(jié)果表明，隨著施氮水平的提升，子囊菌門真菌豐度占比差異較大。低氮處理中占比最高，達(dá)79.97%，而在中氮處理中占比最低，僅為59.24%，高氮處理中又上升至67.78% 。此外。甘蔗根際土壤中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）真菌豐度占比同樣隨著施氮量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。

另一方面，4 種不同施氮處理下，甘蔗植株根系中相對(duì)豐度占比大于1%的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門分類水平數(shù)量均為3 個(gè)。其中，子囊菌門、擔(dān)子菌門和unclassified_k__Fungi 是4 種施氮處理所共有的甘蔗根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門類（圖2B）。CK處理甘蔗植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門類相對(duì)豐度占比大小排序依次為：子囊菌門（73.84%）、擔(dān)子菌門（25.01%）和unclassified_k__Fungi（1.14%）；低氮處理甘蔗植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門類相對(duì)豐度占比大小排序依次為：擔(dān)子菌門（63.90%）、子囊菌門（ 34.39% ） 和unclassified_ k__Fungi（1.69%）；中氮處理甘蔗植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門類相對(duì)豐度占比大小排序依次為：unclassified_k__Fungi（47.46%）、擔(dān)子菌門（39.19%）和子囊菌門（13.31%）；高氮處理甘蔗植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門類相對(duì)豐度占比大小排序依次為：擔(dān)子菌門（ 48.77% ）、子囊菌門（ 48.40% ） 和unclassified_k__Fungi（2.59%）。

2.3.2 不同施氮處理下甘蔗根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌屬分類水平組成 屬分類水平，不同施氮處理下，甘蔗根際土壤中相對(duì)豐度占比大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌屬分類數(shù)量及豐度占比如圖3A 所示，共35 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，其中，高氮、中氮、低氮、CK 處理中，甘蔗根際土壤中優(yōu)勢(shì)真菌屬數(shù)量分別為17、17、15、26 個(gè)。

與不施氮（CK）處理相比，不同施氮處理均不同程度地提高了沙蜥屬（Saitozyma）、木霉屬（Trichoderma）、unclassified_p__Ascomycota、鐮刀菌屬（Fusarium）等優(yōu)勢(shì)真菌屬的相對(duì)豐度占比； 同時(shí)， 亦不同程度地降低了籃狀菌屬（ Talaromyces ）、unclassified_f__Herpotrichiellaceae、梨孢霉屬（ Coniosporium ）、青霉屬（Penicillium）、刺球菌屬（Chaetosphaeria）、毛殼菌屬（ Chaetomium ）、unclassified_o__Hypocreales等優(yōu)勢(shì)真菌屬的相對(duì)豐度占比。其中，粗糙孔菌屬（Trechispora）、Myrmecridium、柱霉屬（Scytalidium）、油脂酵母屬（Lipomyces）、肯氏霉屬（Kendrickiella）、Echria、Acidomelania、unclassified_o__Tremellales、unclassified_f__Chaetothyriaceae、unclassified_f__Strophariaceae 是CK處理下甘蔗根際土壤特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬；Dokmaia、鏈孢霉屬（Neurospora）是低氮處理下甘蔗根際土壤特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬；unclassified_o__Agaricales、unclassified_o__GS11 是中氮處理下甘蔗根際土壤特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬；支孢瓶霉屬（Cladophialophora）、Purpureocillium、曲霉屬（Aspergillus）、unclassified_f__Trichomeriaceae、擬棘殼孢屬（Pyrenochaetopsis）是高氮處理下甘蔗根際土壤特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬。

另一方面，不同施氮處理下，甘蔗根系中相對(duì)豐度占比大于1%的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬分類數(shù)量及豐度占比如圖3B 所示，共20 個(gè)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬。其中，高氮、中氮和低氮及CK 處理中，優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬數(shù)量分別為12、7、8、13 個(gè)。

與CK 處理相比，不同施氮處理均不同程度地提高了unclassified_k__Fungi、unclassified_p__Ascomycota 等優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬的相對(duì)豐度占比；同時(shí)亦不同程度地降低了籃狀菌屬、毛殼菌屬和unclassified_f__Strophariaceae 等優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬的相對(duì)豐度占比。其中，籃狀菌屬內(nèi)生真菌隨著施氮量的增加相對(duì)豐度占比逐漸降低。此外，Thozetella 、Acidomelania 和unclassified_f__Chaetothyriaceae 是CK 處理下甘蔗根系特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬；unclassified_o__Helotiales 是低氮處理下甘蔗根系特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬；unclassified_c__Agaricomycetes 是中氮處理下甘蔗根系特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬；unclassified_o__Auriculariales 和unclassified_o__Pleosporales 是高氮處理下甘蔗根系特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬。

2.4 不同施氮處理下甘蔗根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌LEfSe分析

物種進(jìn)化分支圖（圖4）從內(nèi)圈到外圈依次展示了樣本群落中從門到屬的所有的等級(jí)關(guān)系，以及各分類單元在不同模式間的差異情況。篩選標(biāo)準(zhǔn)為Plt;0.05，LDA scoregt;3.0的條件下，發(fā)現(xiàn)不同施氮處理下具有顯著優(yōu)勢(shì)的主要真菌類群。由圖4可知，不同施氮處理下，甘蔗根際土壤中共發(fā)現(xiàn)56個(gè)真菌分支，甘蔗根系中共發(fā)現(xiàn)8 個(gè)內(nèi)生真菌分支。

門分類水平，高氮處理和CK 處理下甘蔗根際土壤中均未發(fā)現(xiàn)具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌門類；羅茲菌門真菌是中氮處理甘蔗根際土壤具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌門類；梳霉門（Kickxellomycota）真菌是低氮處理甘蔗根際土壤中具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌門類。屬分類水平， 籃狀菌屬、梨孢霉屬、Acidomelania、Echria、柱霉屬（Scytalidium）、unclassified_o__Tremellales、unclassified_f__Chaetothyriaceae、unclassified_o__Chaetothyriales 、unclassified_f__Aspergillaceae 是CK 處理甘蔗根際土壤具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌屬； 鏈孢霉屬、Dokmaia、戴氏霉屬（Taifanglania）、念珠菌屬（Candida）、Monocillium、裂殼屬（Schizothecium）真菌是低氮處理下甘蔗根際土壤中具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌屬；unclassified_o__GS11 和Collarina 是中氮處理下甘蔗根際土壤具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌屬；鐮刀菌屬、支孢瓶霉屬、曲霉屬（Aspergillus）、Plectosphaerella 、Boothiomyces 、馬利亞霉屬（Mariannaea）真菌是高氮處理下甘蔗根際土壤具有顯著優(yōu)勢(shì)的真菌屬（圖4A）。

另一方面，unclassified_f__Chaetomiaceae 是CK 處理下甘蔗根系中具有顯著優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生真菌屬；Purpureocillium、木霉屬、unclassified_c__Sordariomycetes、Dokmaia 真菌是高氮處理下甘蔗根系中具有顯著優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生真菌屬；此外，中氮和低氮處理中均未發(fā)現(xiàn)具有顯著優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生真菌屬（圖4B）。

2.5 不同施氮處理下甘蔗根際土壤真菌和根系內(nèi)生真菌Venn分析

由圖5 可知，CK、低氮、中氮和高氮處理下甘蔗根際土壤中分別檢測(cè)到857、1116、925、1091個(gè)真菌OTU，其中，共有的真菌OTU 數(shù)量為335個(gè)，特有的真菌OTU 數(shù)量分別為192、305、120和249 個(gè)（圖5A）。CK、低氮、中氮和高氮處理下甘蔗根系中分別檢測(cè)到為313、229、198、431個(gè)內(nèi)生真菌OTU，其中，共有的內(nèi)生真菌OTU數(shù)量為47 個(gè)，特有的內(nèi)生真菌OTU 數(shù)量分別為125、72、42、194 個(gè)（圖5B）。上述結(jié)果表明，與CK 相比，不同施氮處理均不同程度地提高了甘蔗根際土壤中真菌的OTU 數(shù)量，其中低氮處理提升效果最明顯；但除高氮處理外，中氮和低氮處理均不同程度地降低了甘蔗根系中的內(nèi)生真菌OTU 數(shù)量。

3 討論

微生物是生態(tài)系統(tǒng)中功能活躍，開發(fā)潛力最大、最寶貴、最豐富的生物資源庫[20]。根際微生物與作物健康密切相關(guān)，其群落結(jié)構(gòu)的變化將直接影響到作物的生長[7]。至今的研究證實(shí)，無論是根際抑內(nèi)生微生物，群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越豐富時(shí)，對(duì)抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)[21-22]。

鄧德雷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與不施氮肥處理相比，雖然不同施氮量對(duì)馬鈴薯根際土壤真菌多樣性無顯著影響，但不同施氮量均顯著提高馬鈴薯根際土壤真菌的豐富度指數(shù)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與不施氮處理相比，雖然不同施氮處理對(duì)甘蔗根際土壤真菌多樣性指數(shù)無顯著影響，但均顯著提高甘蔗根際土壤真菌的豐富度指數(shù)。另一方面，過量施氮會(huì)降低土壤真菌多樣性[23-24]，究其原因可能是高氮含量的環(huán)境下，處于高氮脅迫，導(dǎo)致真菌類群生長速率較低，不能正常生長繁殖，從而導(dǎo)致其多樣性降低。此外，高小峰等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高氮施肥顯著降低谷子根系內(nèi)生真菌多樣性（Shannon）指數(shù)，顯著提高豐富度（Chao 1）指數(shù)；低氮施肥則顯著降低谷子根系內(nèi)生真菌豐富度指數(shù)。但本研究發(fā)現(xiàn)，高氮和低氮處理均未顯著改變甘蔗伸長期根系內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)。這一現(xiàn)象可能與作物種類差異有關(guān)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

已有研究證實(shí)，子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌是土壤中的重要分解者[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同施氮處理下，甘蔗根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成主要由子囊菌門和擔(dān)子菌門構(gòu)成，這與楊仔奇[26]和魏鑫[28]的研究結(jié)果相一致。子囊菌門真菌是真核生物中最普遍和最多樣化的菌群，有利于枯枝落葉、木屑和糞便等有機(jī)底物分解[26]。弱堿條件有利于子囊菌門真菌的生長繁殖[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，除低氮處理外，高氮和中氮處理均降低了甘蔗根際土壤中子囊菌門真菌豐度占比；此外，雖然高氮和中氮處理對(duì)根際土壤pH 的影響未達(dá)顯著差異水平，但均不同程度地降低了甘蔗根際土壤pH。子囊菌門真菌占比的下降可能是由于單一過量施用氮肥導(dǎo)致土壤pH 下降[31]。

不同施氮處理下，甘蔗根際土壤中籃狀菌屬、青霉屬和毛殼菌屬真菌的豐度占比均出現(xiàn)不同程度的下降，尤其籃狀菌屬真菌的豐度占比顯著下降。研究已證實(shí)，籃狀菌屬真菌是一種適應(yīng)性強(qiáng)的腐生霉菌，能產(chǎn)生高活性的木質(zhì)纖維素酶類，對(duì)植物礦物質(zhì)吸收、抗病、抗逆和生長起重要作用[32]。青霉屬和毛殼菌屬真菌對(duì)纖維素分解具有重要作用[26]，還具有分泌抗菌和抑菌活性物質(zhì)的功能[33-34]。另一方面，鐮刀菌屬和曲霉屬真菌在高氮處理下甘蔗根際土壤中具有顯著優(yōu)勢(shì)。王治維等[35]研究發(fā)現(xiàn)，曲霉屬真菌是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)及表面的病原微生物，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)植物發(fā)生病害，從而引起產(chǎn)量和品質(zhì)下降。鄧德雷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，長期連續(xù)施用氮肥過程中，低氮和高氮均顯著增加了土壤中鐮刀菌屬真菌的相對(duì)豐度，而鐮刀菌屬真菌會(huì)導(dǎo)致植株的纖維管阻塞進(jìn)而引起作物萎焉[26]。從物種組成可以看出，本研究結(jié)果中高氮和低氮處理均顯著增加了甘蔗根際土壤中鐮刀菌屬真菌的相對(duì)豐度。由此推論，高氮處理誘導(dǎo)甘蔗根際微環(huán)境土壤中鐮刀菌屬和曲霉菌屬等真菌屬累積，存在發(fā)生病害的潛在風(fēng)險(xiǎn)，不利于甘蔗植株的健康生長。不同施氮處理不同程度地降低了甘蔗根系中子囊菌門內(nèi)生真菌的豐度占比，同時(shí)不同程度地提高了擔(dān)子菌門內(nèi)生真菌的豐度占比。子囊菌門真菌具有通過自身分泌有機(jī)酸和碳酸等物質(zhì)促進(jìn)土壤中有機(jī)質(zhì)的分解，加速宿主根系吸收所需營養(yǎng)元素，促進(jìn)作物生長的功能[25， 36]；擔(dān)子菌門真菌則主要分解木質(zhì)素和纖維素等大分子化合物。此外，還和銹菌、黑粉菌及植物病害的關(guān)系十分密切[25， 37-38]。同時(shí)不同施氮處理亦不同程度地降低了甘蔗植株根系中籃狀菌屬和毛殼菌屬內(nèi)生真菌的豐度。由此推測(cè)，單一施氮處理雖然未造成甘蔗植株根系中內(nèi)生真菌多樣性與豐富度的顯著變化，但門和屬分類水平上的組成均呈現(xiàn)數(shù)量減少，以及鐮刀菌屬和曲霉菌屬真菌等潛在的病原真菌屬累積的趨勢(shì)，單一施氮處理誘導(dǎo)甘蔗根際土壤或根系內(nèi)生真菌群落組成趨向單一，具有降低甘蔗植株抵御外界脅迫能力的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，單一不同施氮處理下甘蔗植株根際土壤和根系內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，基于維護(hù)甘蔗根際土壤生態(tài)健康及甘蔗植株抗性的角度，適宜甘蔗的施氮量以低氮處理的施用量（96 kg/hm²）為佳；同時(shí)，單一的施氮處理容易誘導(dǎo)甘蔗根際土壤或根系內(nèi)生真菌群落組成趨向單一，具有降低甘蔗植株抵御外界脅迫能力的潛在風(fēng)險(xiǎn)。