川明參輪作對煙地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

張東艷+趙建+楊水平+莫靜靜+何大敏+王軍+茍劍渝+張雪+蔣衛(wèi)+溫明霞

[摘要] 土壤微生物是土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，為探索川明參種植對煙地微生物影響，該文采用Illumina MiSeq高通量測序研究了川明參對植煙土壤中細(xì)菌和真菌在門和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，川明參種植增加了煙地土壤細(xì)菌和真菌的生物多樣性，且對真菌的影響大于細(xì)菌，極大的增加了真菌的序列數(shù)，分別獲得32 978個細(xì)菌16S rDNA序列和32 229個真菌18S rDNA序列。沒有改變細(xì)菌前三大優(yōu)勢菌門類，但含量上分別使變形菌和酸桿菌降低1.73%，1.4%，放線菌增加0.65%，使真菌優(yōu)勢門子囊菌減少27.99%成為次優(yōu)勢菌，次優(yōu)勢菌擔(dān)子菌增加23.69%成為優(yōu)勢菌；改變了原煙地屬水平的群落結(jié)構(gòu)，使優(yōu)勢屬及豐度都發(fā)生了變化，變化較大的細(xì)菌如uncultured Acidobacteriaceae Subgroup-1，Gemmatimonas，Subgroup-2，uncultured Nitrosomonadaceae等，真菌如norank Sordariales，norank Agaricomycetes，Phialophora等，且拮抗微生物及生理類群微生物豐度增加，病原菌減少。因此，川明參種植能改善煙地土壤微生物。

[關(guān)鍵詞] 川明參；煙草；高通量測序；細(xì)菌；真菌

[Abstract] Soil microbes are the important indicator of soil quality. For exploring Chuanminshen violaceum planting to microbial effects in tobacco soil，this paper adopted Illumina MiSeq high-throughput sequencing to research the change of bacteria and fungi at the phylum and genus in the soil. The results showed that the Ch. violaceum planting increased the biodiversity of bacteria and fungi. The influence on fungi was greater than that on bacteria. It greatly increased the sequence of fungi，it obtained 32 978 16S rDNA and 32 229 18S rDNA sequence number. There was no change of the top three phylums in bacteria，but the content changed，Proteobacteria and Acidobacteria reduced by 1.73% and 1.4% respectively，and Actinobacteria increased by 0.65%. The advantage phylum Ascomycete in tobacco reduced by 27.99% to be second advantage phylum after Ch. violaceum planting，and the second advantage phylum Basidiomycete increased by 23.69% to become the first dominant fungi. At the genus，Ch. violaceum planting changed the order of dominant genus and the abundance was also changed. Some changed largely such as uncultured Acidobacteriaceae Subgroup-1，Gemmatimonas，Subgroup-2，uncultured Nitrosomonadaceae for bacteria，norank Sordariales，norank Agaricomycetes，Phialophora for fungi. Especially the rotation increased antagonistic microbes and physiological microbes and decreased pathogenic microbes. So the Ch. violaceum planting can improve the microbe community in tobacco soil.

[Key words] Chuanminshen violaceum；tobacco；high-throughput sequencing；bacteria；fungi

doi：10.4268/cjcmm20162412

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)物的主要分解者和轉(zhuǎn)化者[1]，其群落結(jié)構(gòu)在很大程度上決定著土壤的生物活性，且能對土壤的微小變化作出敏感的反應(yīng)，因此被認(rèn)為是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)。土壤微生物除了受土壤顆粒大小、土壤水分的影響以外，還受到地上植被凋落物、根系、土壤動物殘體以及經(jīng)營措施的影響[2]。根系分泌物中豐富的糖類、氨基酸類、有機(jī)酸及酚酸等物質(zhì)，為土壤微生物的生長和繁殖提供了充足的營養(yǎng)，并且不同植物的根系分泌物對微生物群落結(jié)構(gòu)具有選擇塑造作用[3]。

煙草[4-7]和中草藥[8-9]在栽培過程中連作障礙嚴(yán)重，輪（間套）作是消減連作障礙的有效措施。研究表明，與水稻[10-11]、玉米[12-13]、蒜[14-15]、綠肥[16-17]等作物輪作及間套作，對于改善土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和消減煙草連作障礙具有很好效果。我國是中草藥的大國，在煙區(qū)進(jìn)行中藥材和煙草合理配置，實行藥煙輪（間套）作，將有利于藥煙協(xié)同發(fā)展和種植業(yè)增收增效。有研究表明，藥用植物套種花生能有效調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系的定向發(fā)展而緩解花生連作障礙[18]；棉花枯萎病嚴(yán)重地塊，改種1年薄荷之后連續(xù)種植棉花9年，枯萎病仍沒有發(fā)生[19]。川明參在西南山區(qū)廣泛種植，在茬口上可以和煙草實現(xiàn)年內(nèi)輪作，并且川明參莖葉枯落物水浸液對煙草幼苗生長有一定化感增益效應(yīng)[20]，但有關(guān)川明參與煙草輪作效應(yīng)及對煙地土壤微生物種群影響尚未見報道。本文采用Illumina MiSeq技術(shù)，對大田煙-川明參輪作土壤微生物細(xì)菌V3-V4可變區(qū)及真菌18S區(qū)進(jìn)行基因測序分析，玉米地為對照，研究煙-川明參種植的土壤微生物效應(yīng)，以期為川明參與煙草輪作種植提供理論和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于貴州省遵義市遵義縣八里村，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫14.7 ℃，年均降水量1 200 mm。土壤類型為黃壤，pH 5.7，土壤肥力：有機(jī)質(zhì)含量13 300 mg·kg^-1，有效氮 64.0 mg·kg^-1，有效磷 36.30 mg·kg^-1，有效鉀 112.5 mg·kg^-1。

1.2 試驗設(shè)計

田間試驗分3個處理：玉米-休閑、煙-休閑、煙-川明參輪作，分別用K0，K1，K2表示，3個重復(fù)。具體方案為，選取前茬為玉米-冬閑且土壤條件均勻一致的地塊，整地后劃分為6 m×20 m的9個小區(qū)，隨機(jī)選取6小區(qū)連作煙，其余3小區(qū)連作玉米，第1年秋冬季都休閑。第2年，觀察到連作煙病害嚴(yán)重，待煙收獲后，任選植煙的3小區(qū)于秋冬種植一年生川明參，其余秋冬季繼續(xù)休閑。本試驗于2015年9月3日將一年生川明參苗植于地中，2015年12月7日各處理同時采集土壤樣品。

1.3 土樣采集

土壤樣品為混合土樣，用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法采0～20 cm土層，每個土樣由5～8個采集點的土壤混合，用四分法取適量于土袋中，迅速帶回實驗室。去除土樣中的動植物殘體等雜質(zhì)，混合均勻后，保存在-80 ℃，用于分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.4 土壤微生物總DNA的提取和測序

土壤微生物總DNA 的提取采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit試劑盒，提取出的總DNA送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq高通量測序。細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增引物采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），真菌18S rDNA擴(kuò)增引物采用SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和SSU1196R（5′-TCTGGACC TGGTGAGTTTCC-3′）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 有效序列和優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用多個樣品平行測序的方法，所以各樣品中的序列均引入了一段標(biāo)示其樣本來源信息的barcode標(biāo)簽序列及前引物（forward primer）序列。本次分析根據(jù)barcode標(biāo)簽序列和前引物序列篩選出有效序列后，將測序接頭與barcode序列去除，并對處理后的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。為了得到更高質(zhì)量及更精準(zhǔn)的生物信息分析結(jié)果，對有效序列進(jìn)行去雜，得到優(yōu)化序列后對其進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.5.2 OTU-based分析 對所有樣品進(jìn)行OTU生成并對OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析。Miseq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，在97%的相似水平下對所有序列進(jìn)行OTU劃分，進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析。軟件平臺Usearch（vsesion 7.1）。

1.5.3 細(xì)菌和真菌群落多樣性分析 群落物種的豐富度（richness）和多樣性（diversity）分別用Ace，Chao和Shannon，Simpson指數(shù)表示，測序深度指數(shù)用Coverage表示。軟件平臺mothur（version v.1.30.1）指數(shù)分析，用于指數(shù)評估的OTU相似水平為97%。

1.5.4 群落結(jié)構(gòu)分析 將優(yōu)化序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的參考序列在門和屬水平進(jìn)行鑒定，比較3個處理中細(xì)菌和真菌的分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA和18S rDNA基因測序質(zhì)量及多樣性統(tǒng)計分析

K0，K1，K2所得有效序列分別為：細(xì)菌34 312，34 382，32 978條，真菌20 308，25 369，32 229條，抽平至最低序列細(xì)菌32 978，真菌20 308條后，菌群多樣性統(tǒng)計結(jié)果見表1。各樣品測序覆蓋率均在0.99以上，說明樣品中序列未被測到的概率較低，測序量足以覆蓋樣品菌群組成[21]。97%相似性歸并后，K0，K1，K2所含細(xì)菌OTU個數(shù)分別為977，817，935，所含真菌OTU個數(shù)分別為70，63，65，生物信息統(tǒng)計分析得，K0可劃分為細(xì)菌29門60綱119目205科285屬，真菌6門22綱35目40科40屬；K1可劃分為細(xì)菌25門51綱102目175科249屬，真菌6門20綱34目39科41屬；K2可劃分為細(xì)菌26門55綱112目188科269屬，真菌6門21綱32目38科38屬。Ace，Chao指數(shù)是對菌群豐度進(jìn)行的評估，Shannon和 Simpson是對菌群多樣性進(jìn)行的評估，Shannon值越大，表明群落多樣性越高，Simpson值越大，說明群落多樣性越低。由表1可知，無論是細(xì)菌還是真菌，Ace，Chao，Shannon值均是K0>K2>K1，Simpson是K0

2.2 門水平群落結(jié)構(gòu)

門水平下的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)見圖1。3個處理含量大于2%的細(xì)菌優(yōu)勢門類有11門，其中變形菌Proteobacteria 24.26%～31.73%、酸桿菌Acidobacteria 20.90%～22.30%、放線菌Actinobacteria 6.01%～10.37%、綠灣菌Chloroflexi 5.94%～11.57%、擬桿菌Bacteroidetes 5.83%～9.07%和芽單胞菌Gemmatimonadetes 5.36%～8.24%，這6個菌門豐度均在5%以上，共計達(dá)76.99%～86.47%。疣微菌門Verrucomicrobia，Saccharibacteria，Parcubacteria，厚壁菌Firmicutes，浮霉菌Planctomycetes，這幾門含量相對較少。與K0相比，K1中Proteobacteria，Acidobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes增多7.47%，0.97%，3.71%，2.50%，而Chloroflexi，Gemmatimonadetes，Verrucomicrobia，Parcubacteria，Planctomycetes減少3.29%，1.9%，2.64%，1.76%，1.05%。與K1相比，K2中前三大優(yōu)勢菌門與K1相同，含量上Proteobacteria和Acidobacteria分別降低1.73%，1.4%，Actinobacteria增加0.65%，而Chloroflexi，Bacteroidetes減少2.34%，3.24%，Gemmatimonadetes，Saccharibacteria，Parcubacteria，F(xiàn)irmicutes，增加2.98%，1.09%，2.47%，0.94%。

3個處理的真菌門類為子囊菌Ascomycota、擔(dān)子菌Basidiomycota、接合菌Zygomycota、球囊菌Glomeromycota、壺菌Chytridiomycota，且均有>1%的真菌（Others）在GenBank中沒有被明確的分類。與K0相比，Ascomycota在K1中增加了13.45%成為絕對優(yōu)勢菌，次優(yōu)勢菌Zygomycota在K1中降低了16.61%，而Basidiomycota增加了9.58%成為K1的次優(yōu)勢菌，Glomeromycota在K1中減少了5.59%，Chytridiomycota變化不大。與K1相比，K2中的Ascomycota減少27.99%成為次優(yōu)勢菌，而Basidiomycota增加23.69%成為優(yōu)勢菌。

2.3 屬水平群落結(jié)構(gòu)

K0，K1，K2分別所含細(xì)菌285，249，269屬，真菌40，41，38屬。按豐度排序，細(xì)菌前20優(yōu)勢屬豐度之和占53.09%～56.57%，真菌前10優(yōu)勢屬豐度之和占52.86%～80.23%，見表2。其中，不可培養(yǎng)酸桿菌亞群-1 uncultured Acidobacteriaceae Subgroup-1，不可培養(yǎng)的芽單胞菌科uncultured Gemmatimonadaceae，待定土壤菌群OPB35 unclassified soil group OPB35，待定細(xì)菌unclassified bacteria，芽單胞菌屬Gemmatimonas，Subgroup-2，norank Saccharibacteria，暫定土壤細(xì)菌unclassified Candidatus solibacter，不可培養(yǎng)的放線菌uncultured Gaiellales共9屬都出現(xiàn)各處理細(xì)菌前20優(yōu)勢屬中，但豐度上發(fā)生了變化，其中變化較大的例如：uncultured Acidobacteriaceae subgroup-1為玉米地（K0）的第1優(yōu)勢屬（8.44%），在煙地（K1）中降至第5（3.52%），而川明參種植后（K2）又升至第1優(yōu)勢屬（5.44%）；Gemmatimonas在K0中位居第8（3.08%），在K1中降至第16（1.56%），在K2中升至第6（3.22%）；Subgroup-2在K0中居第9（3.04%），在K1中升至第1（12.34%），在K2中降至第3（4.12%）。除上述之外，不可培養(yǎng)的亞硝化單胞菌科uncultured Nitrosomonadaceae作為K0的第2優(yōu)勢屬（4.75%），沒有出現(xiàn)在K1的前20屬，川明參種植后（K2），升至第16屬（1.69%）；不在K0前20屬的不可培養(yǎng)的黃色單胞菌目uncultured Xanthomonadales，作為K1的第2優(yōu)勢屬（3.84%），川明參種植后降至第9屬（2.50%）。

在真菌前10屬中（除去未鑒定出的真菌），3個處理共有4屬：未命名糞殼菌目norank Sordariales、未命名傘菌綱norank Agaricomycetes、枝孢屬Cladosporium、待定傘菌綱unclassified Agaricomycetes，其中豐度變化較大的有：norank Sordariales為K0的第1優(yōu)勢屬（20.77%），K1中也為第1優(yōu)勢屬（34.70%），在K2中降至第4屬（8.13%）；norank Agaricomycetes為K0的第2優(yōu)勢屬（10.12%），在K1中降至第5屬（4.35%），川明參種植后升至第2屬（19.08%）。除此之外，Phialophora為K0的第3優(yōu)勢屬（4.68%），均未出現(xiàn)在K1和K2的前10屬；未出現(xiàn)在K0前10屬的待定糞殼菌綱unclassified Sordariomycetes和uncultured Hydnodontaceae，分別在K1中增至第3（10.44%）和第4（7.71%），而川明參種植后使前者降至前10之后，后者增至第1（21.17%）。

由上可以看出，川明參種植改變了原煙地細(xì)菌和真菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢屬及其豐度均發(fā)生了變化。

2.4 土壤特異微生物的變化

土壤特異微生物包括拮抗微生物、生理類群微生物、病原微生物等[22]，其對植物積極的作用主要有抑制病原菌、參與養(yǎng)分循環(huán)以及分泌植物生長調(diào)節(jié)劑等[23-24]，消極的作用主要是產(chǎn)生病害，見表3。作物對土傳病害的抗性與拮抗微生物密切相關(guān)，Bacillus，Pseudomonas，Burkholderia，Catenulispora，Mycobacterium，Sphingomonas，Bdellovibrio等可以通過產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)或溶菌作用等方式對土傳病原菌產(chǎn)生拮抗作用，除Bdellovibrio外，川明參種植均使原煙地的拮抗微生物豐度增加，且Burkholderia和Sphingomonas增幅最大。生理類群微生物參與土壤碳氮循環(huán)，直接影響土壤肥力，細(xì)菌中如固氮菌Gemmatimonas，Devosia，Dongia，F(xiàn)rankiales，硝化和亞硝化細(xì)菌Nitrospira，Nitrosomonadaceae，Mizugakiibacter，纖維素分解菌Cytophaga，Cellvibrio等。真菌中的球囊菌Glomeromycota即叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）能與地球上90%以上的陸生維管植物根系建立互惠共生體系[25]，為植物提供養(yǎng)分[26]，改善其營養(yǎng)特性[27-28]，其在3個處理中，K0中含8.66%，煙地（K1）中降低至4.07%，川明參種植后增至7.56%。土傳病原菌能夠引起各種土傳病，對于細(xì)菌，致病菌如Ralstonia，Xanthomonadales，Conexibacter，Rudaea，Aquicella等，其中Ralstonia能引發(fā)煙草青枯病[29]，Xanthomonadales能使葉片、莖稈、果實上產(chǎn)生病斑[30]。而大多數(shù)土壤真菌同時為植物病原菌，如壺菌Chytridiomycota能引起玉米褐斑病、馬鈴薯癌腫病；柔膜菌Helotiales引起向日葵、油菜、花生、煙草、十字花科蔬菜、萵苣、番茄、菜豆等多種植物的菌核病，危害很大；肉座菌Hypocreales能引起小麥赤霉病、水稻惡菌??；格孢腔菌Pleosporales大多危害果樹和樹木的葉片，枝條，果實和枝干，引起的病害一般稱為黑星?。恢︽邔貱ladosporium能引起煙草煤污病。總的來看，與玉米地（K0）相比，煙地（K1）中有益菌和有害菌增減不一，與煙地相比，川明參地（K2）中拮抗菌和生理類群微生物增多，而病原菌減少。連作煙地K1中Bacillus，Sphingomonas等有益菌屬數(shù)量減少與陳冬梅、岳冰冰等[31-32]得到相一致的結(jié)果，而川明參種植后均使其含量增加。

3 討論

3個處理土壤（K0，K1，K2）所測得的細(xì)菌有效序列數(shù)雖差別不大，但種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較大的改變，主要細(xì)菌門類雖大致一致，但優(yōu)勢門類豐度與排序發(fā)生改變；在細(xì)菌屬水平上，前20個優(yōu)勢屬僅9屬為共有，且各屬相對含量發(fā)生了不同程度的增減。煙地K1與玉米地K0同源，川明參地K2來源于煙地K1，由此可以看出細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境密切相關(guān)[33]，但又因種植作物不同而改變，與陳丹梅等結(jié)果近似[34]。真菌也是如此，甚至因作物不同而改變更大。K0，K1，K2真菌有效序列數(shù)呈較大幅度遞增，門和屬的優(yōu)勢順序都有較大改變，前10個優(yōu)勢屬中僅4屬為共同所有。土壤中一些特異細(xì)菌和真菌尤其關(guān)聯(lián)作物營養(yǎng)和植物病害的菌類也發(fā)生很大變化。土壤微生物的上述變化，當(dāng)歸因于作物生長尤其根系分泌活動。根系分泌物是植物與根際微生物相互作用的中間媒介，不同作物的根系分泌物數(shù)量和種類各不相同，對微生物的代謝、生長發(fā)育和多樣性都有影響[35]。煙草和川明參種植后，根系分泌物會為微生物提供充足的營養(yǎng)，同時對其也有選擇塑造作用，尤其川明參根系分泌物中的藥性成分（在取土樣時能夠聞到很強(qiáng)的中藥味）。輪作雖僅短短3個月，但影響仍然深刻。無論是細(xì)菌還是真菌，煙草連作（K1）較大幅度降低土壤微生物多樣性，而煙地輪作川明參（K2）則提高了多樣性，使土壤微生物朝種植玉米（K0）方向修復(fù)。

煙草土傳病害嚴(yán)重，然而并未在K1和K2土樣中檢測到疫霉屬Phytophthhora、炭疽菌屬Colletotrichum、鐮刀菌屬Fusarium和絲核菌屬Rhizoctonia等常見的影響煙草正常生長的病原真菌，也僅僅只檢測到很少量的致病細(xì)菌勞爾氏菌屬Ralstonia，而譚淵等[36]對不同種植年限黃連根系土壤細(xì)菌的研究未在發(fā)病土樣中檢測到影響藥用植物正常生長的病原細(xì)菌，秦越等[37]在馬鈴薯連作栽培研究中也未檢測出馬鈴薯致病真菌，由此說明引發(fā)病害的原因很復(fù)雜，出現(xiàn)的病癥可能不僅僅是由致病微生物造成的，可能涉及多方面因素，如氣候、栽培管理措施等，還可能因采樣時期而錯過致病菌的高峰期[38]。對作物土傳病害的抑制在一定程度上是土壤微生物群體的作用，當(dāng)微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富、多樣性越高時對抗病原菌的綜合能力就越強(qiáng)[39]。川明參種植后增加了真菌含量，但也增加了真菌的多樣性，多種真菌同時存在，互相制約，可防止某些病原菌過度繁殖。

4 結(jié)論

川明參種植增加了原煙地土壤微生物的多樣性，改變了其群落結(jié)構(gòu)，使有益菌增加，有害菌減少。但針對川明參與煙草輪作以及兩者之間能否互消連作障礙仍需持續(xù)深入探索。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]