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    超高效液相色譜法測(cè)定德谷胰島素含量

    2023-12-18 13:09:08李晴晴孟盼盼李敬
    生物化工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:量瓶磷酸鹽緩沖液

    李晴晴,孟盼盼,李敬

    (江蘇萬(wàn)邦醫(yī)藥科技有限公司,江蘇徐州 221004)

    糖尿?。―iabetic Mellitus,DM)屬慢性終身性疾病,是一種高發(fā)病率、嚴(yán)重影響人們正常生活工作的慢性病[1]。近些年,全球糖尿病患病人數(shù)一直在大幅度增加,其中2 型糖尿?。―iabetic Mellitus Type 2,T2DM)患者約占糖尿病患者總數(shù)的90%,已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。德谷胰島素(Insulin Degludec,IDeg)為超長(zhǎng)效基礎(chǔ)胰島素類(lèi)似物[2],注射后形成多六聚體,從可溶性?xún)?chǔ)存庫(kù)中緩慢釋放,能夠持久、平穩(wěn)、長(zhǎng)期降血糖,減輕病人的生理痛苦,增強(qiáng)病人順應(yīng)性[3-7],廣泛用于2 型糖尿病的治療[8]。

    德谷胰島素含量檢測(cè)方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法(HPLC),其中紫外分光光度法采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行直接測(cè)定,HPLC 通過(guò)色譜柱分離作用將有關(guān)物質(zhì)、雜質(zhì)等進(jìn)行分離,故結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠[9]。江蘇萬(wàn)邦醫(yī)藥科技有限公司現(xiàn)采用HPLC 控制產(chǎn)品中德谷胰島素含量,德谷胰島素主峰出峰時(shí)間約為22 min,高效液相色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)、系統(tǒng)死體積較大,檢測(cè)成本高。與傳統(tǒng)的HPLC 相比,超高效液相色譜(UPLC)填料顆粒小、均勻,具有柱效高、分析速度快、分離度高、靈敏度好等特點(diǎn)[10-11],因此被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物研究分析等領(lǐng)域[12]。因此,本研究采用UPLC 法測(cè)定德谷胰島素的含量,為提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    LC-30A 超高效液相色譜儀,日本Shimadzu 公司;XS105 分析天平,瑞士METTLER TOLEDO 公司;ToledoXSR105 電子天平,瑞士METTLER TOLEDO公司。

    無(wú)水硫酸鈉、磷酸二氫鈉,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈,色譜純,默克股份兩合有限公司;德谷胰島素,江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 色譜條件及參數(shù)

    色譜柱:Waters C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相A 為0.1 mol/L 硫酸鈉溶液(稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉14.2 g,磷酸二氫鈉15.6 g,加水800 mL,溶解后用8 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至5.7,加入乙腈100 mL,加水定容至1 000 mL,混勻)-乙腈(體積比90 ∶10),流動(dòng)相B 為50%乙腈;梯度洗脫程序:0 ~20 min,50%B;20 ~21 min,50%B ~80%B;21 ~24 min,80%B;24 ~25 min,80%B ~50%B;25 ~30 min,50%B);柱溫:40 ℃;流速:0.25 mL/min;波長(zhǎng):214 nm,進(jìn)樣量:2 μL。

    1.2.2 溶液配制

    1.2.2.1 空白溶液

    0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液:稱(chēng)取1.56 g 二水合磷酸二氫鈉,加1 000 mL 水溶解混勻后,1 mol/L NaOH調(diào)pH 至7.5,混勻,經(jīng)微孔濾膜(水系0.45μm)過(guò)濾后作為空白溶液。

    1.2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液

    取德谷胰島素適量,60 ℃烘箱放置2 ~5 d,使與主峰保留時(shí)間約為1.16 min 的雜質(zhì)分離度大于2.0。稱(chēng)取以上樣品,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度,作為系統(tǒng)適用性溶液。

    1.2.2.3 對(duì)照品溶液

    取德谷胰島素對(duì)照品約10 mg,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

    1.2.2.4 供試品溶液

    (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液:取德谷胰島素對(duì)照品約50 mg,置25 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成2 mg/mL 的對(duì)照品濃溶液,分別取對(duì)照品溶液適量,配制成約0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、1.0 mg/mL 與1.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

    (2)重復(fù)性溶液:取德谷胰島素樣品約10 mg,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液,平行6 份。

    (3)中間精密度溶液:取德谷胰島素樣品約10 mg,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。兩名分析人員分別處理6 份,并于不同日期使用不同儀器進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)量。

    (4)準(zhǔn)確度溶液:取德谷胰島素對(duì)照品約8 mg、10 mg、12 mg,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成含德谷胰島素約80%、100%、120%的供試品溶液,每個(gè)濃度分別平行3 份。

    (5)穩(wěn)定性溶液:取德谷胰島素樣品約10 mg,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。在樣品配制完成后約0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 與36 h 進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。

    (6)耐用性溶液:取德谷胰島素樣品約10 mg,置10 mL 量瓶,用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。分別對(duì)柱溫(±2 ℃),流速(±0.01 mL/min)與波長(zhǎng)(±2 nm)進(jìn)行微小的變動(dòng),每次變動(dòng)一個(gè)因素。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜條件優(yōu)化過(guò)程

    2.1.1 流動(dòng)相的選擇

    流動(dòng)相①:A 為0.1 mol/L 磷酸鹽溶液(稱(chēng)取磷酸二氫銨11.5 g,加水800 mL 溶解,加乙腈100 mL,混勻,用85%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.7,加水定容至1 000 mL),流動(dòng)相B 為80%乙腈。流動(dòng)相②:A 為0.1 mol/L 硫酸鈉溶液(稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉14.2 g,磷酸二氫鈉15.6 g,加水800 mL,溶解后用8 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至5.7,加入乙腈100 mL,加水定容至1 000 mL,混勻)-乙腈(體積比90 ∶10),流動(dòng)相B為50%乙腈。樣品色譜檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示,流動(dòng)相②峰型對(duì)稱(chēng)、響應(yīng)高、出峰時(shí)間早,適合作為流動(dòng)相使用。

    圖1 不同流動(dòng)相檢測(cè)結(jié)果

    2.1.2 色譜柱的選擇

    色譜柱①:Waters C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);色譜柱②:Shim-pack GISS C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm)。樣品檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示,色譜柱①主峰拖尾因子為0.98,且主峰與主峰后雜質(zhì)分離效果較好;色譜柱②主峰拖尾因子為1.23,主峰與主峰后雜質(zhì)不能有效分離,故選擇色譜柱①進(jìn)行樣品檢測(cè)。

    圖2 不同色譜柱檢測(cè)結(jié)果

    2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

    將空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣,記錄色譜圖,如圖3 所示。色譜結(jié)果顯示,空白溶液不干擾目標(biāo)色譜峰檢測(cè),專(zhuān)屬性良好。

    圖3 專(zhuān)屬性色譜圖

    2.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

    對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣6 次,記錄色譜圖。峰面積的RSD為0.08%,表明儀器的精密度良好。

    2.4 線性與范圍

    不同濃度下,德谷胰島素檢測(cè)峰面積見(jiàn)表1。以峰面積(y)對(duì)濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,得線性方程為y=147.37x-0.018 7,R2=0.999 9。結(jié)果顯示,在線性范圍內(nèi),德谷胰島素峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

    表1 線性試驗(yàn)結(jié)果

    2.5 重復(fù)性

    重復(fù)性溶液的RSD為0.05%,見(jiàn)表2,表明該分析方法重復(fù)性良好。

    表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

    2.6 中間精密度

    中間精密度溶液的RSD為0.34%,見(jiàn)表3,表明該分析方法中間精密度良好。

    表3 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

    2.7 準(zhǔn)確度

    回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,該方法下德谷胰島素的回收率在99.17%~101.27%,RSD<5%,方法準(zhǔn)確度良好。

    表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

    2.8 穩(wěn)定性

    計(jì)算對(duì)照品溶液中德谷胰島素峰面積的RSD與供試品溶液含量的RSD,見(jiàn)表5。對(duì)照品溶液中德谷胰島素峰面積的RSD為0.28%;供試品溶液含量的RSD為0.21%。結(jié)果表明,對(duì)照品與供試品溶液至少36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

    表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

    2.9 耐用性

    將柱溫(±2 ℃)、流速(±0.01 mL/min)與波長(zhǎng)(±2 nm)進(jìn)行微小的變動(dòng),考察方法耐用性,見(jiàn)表6。結(jié)果表明,色譜條件進(jìn)行微小變動(dòng)時(shí)RSD均小于0.5%,方法耐用性良好。

    表6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

    2.10 實(shí)際樣品測(cè)定

    分別稱(chēng)取三批德谷胰島素產(chǎn)品(批號(hào)F01、F02、F03)約10 mg,精密稱(chēng)定,置10 mL 量瓶,用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL 的供試品溶液,按照1.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表7。

    表7 實(shí)際樣品含量測(cè)定結(jié)果

    3 結(jié)論

    本文建立了檢測(cè)德谷胰島素含量的UPLC 方法。該方法下,德谷胰島素出峰時(shí)間約為11 min,與普通高效液相色譜需要的22 min 相比,檢測(cè)時(shí)間縮短了50%,能快速檢測(cè)出德谷胰島素含量。該方法專(zhuān)屬性強(qiáng),線性范圍廣,回收率高,重復(fù)性、穩(wěn)定性及耐用性良好,可用于提升德谷胰島素含量標(biāo)準(zhǔn)。

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