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    乙酰膽堿酯酶檢測方法研究進展

    2023-12-18 13:09:22焦雯周文清章文許貫虹
    生物化工 2023年5期
    關鍵詞:熒光法硫代比色法

    焦雯,周文清,章文,許貫虹

    (南京醫(yī)科大學 藥學院,江蘇南京211166)

    乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)具有羧肽酶和氨基肽酶的活性,可以降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,減弱乙酰膽堿對突觸后膜的作用。AChE 在神經(jīng)系統(tǒng)學習記憶相關活動中起關鍵作用,其功能異??蓪е律窠?jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。建立高選擇性與高靈敏度的AChE 檢測方法有助于深入理解相關生命活動,為相關疾病的藥物研發(fā)提供有力支持。迄今為止,研究者已經(jīng)報道了包括比色法、熒光法、電化學法在內(nèi)的一系列檢測方法,其中尤以比色法和熒光法備受關注。本文將重點綜述上述方法,并對其發(fā)展趨勢予以展望。

    1 比色法

    1.1 Ellman 法

    Ellman 法是測定AChE 的傳統(tǒng)方法,其基本原理是:乙酰膽堿酯酶水解底物乙酰膽堿產(chǎn)生硫代膽堿,與二硫代二硝基苯甲酸直接反應,生成黃色產(chǎn)物5-硫代2-硝基苯甲酸,可觀察其特征吸收峰以確定濃度。Ellman 法操作簡單、成本低廉、分析快速,在諸如AChE 檢測、抑制劑篩選等研究中得到了廣泛應用[2]。

    1.2 基于TMB 的比色法

    在類過氧化物納米酶的催化下,3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)可被氧化為藍色oxTMB,是一種常見比色體系。ZHANG 等[3]構建了Ag+/金納米粒(AuNPs)/十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)類過氧化物納米酶,并基于該體系實現(xiàn)了AChE 的高靈敏檢測。LI 等[4]構建了普魯士藍納米粒/共價有機骨架/AuNPs 復合納米材料,該材料具有優(yōu)異的類過氧化物酶活性,在體系存在乙酰硫代膽堿時,AChE 與其反應生成硫代膽堿并干擾納米酶活性,進而實現(xiàn)對AChE 的測量,該方法具有高度的特異性和高靈敏度。上述體系通常需要過氧化氫參與反應,增加了操作步驟。NI 等[5]另辟蹊徑,開發(fā)出了基于銀離子和乙酰硫代膽堿碘化物的AChE 檢測系統(tǒng),利用其降解產(chǎn)物硫代膽堿與銀離子的反應減少oxTMB 生成實現(xiàn)了AChE 的檢測,該體系無需制備納米材料,為AChE 的比色檢測提供了新思路。

    2 熒光法

    熒光分析法具有優(yōu)異的生物相容性、高特異性和高靈敏度,是研究生物分子特性的理想工具。熒光法測定AChE 可分為熒光增強和熒光猝滅兩大類,通過觀測熒光信號turn on/off 實現(xiàn)對AChE 含量的監(jiān)測。

    2.1 基于turn on 的方法

    2.1.1 貴金屬納米探針

    AChE 對乙酰硫代膽堿(ATCh)的水解具有高催化活性,可在數(shù)秒內(nèi)生成大量硫代膽堿(TCh)。張楠等[6]利用聚T 單鏈DNA 為模板合成了熒光銅納米粒子,通過TCh 與銅離子的絡合實現(xiàn)對AChE 活性的檢測和抑制劑的篩選。ZHANG 等[7]利用低熒光谷胱甘肽包封金納米團簇(GSH-AuNCs),建立了一種直接熒光啟動法,AChE 水解S-乙?;虼憠A碘化物(ATCI)得到TCh,水解產(chǎn)物可通過形成Au-S 鍵增強GSH-AuNCs 的熒光。在抑制劑存在的條件下,AChE 活性被抑制,熒光增強減弱。

    2.1.2 雙光子熒光探針

    相比單光子熒光成像,雙光子熒光成像技術組織穿透更深,背景干擾更低,更適用于活體成像。WANG 等[8]設計了一種雙光子熒光探針用于原位檢測小鼠大腦中的AChE 活性,該探針在800 nm 處通過雙光子激發(fā),在560 nm 處發(fā)出明亮的熒光,具有極高的靈敏度和良好的選擇性。

    2.1.3 近紅外熒光探針

    傳統(tǒng)熒光探針受生物體背景熒光干擾,不利于組織成像。近紅外探針利用其較大的Stokes 位移可以實現(xiàn)深層組織穿透成像,具有更好的生物成像能力,光毒性也更低。FORTIBUI 等[9]使用BODIPY 染料作為熒光發(fā)射基團,與AChE 結合時僅顯示微弱熒光,但當體系中存在氨基甲酸二甲酯基團時,活性結合位點絲氨酸失活,使BODIPY 轉為游離態(tài),熒光增強。

    2.1.4 金屬有機骨架探針

    金屬有機骨架因比表面積大、生物相容性好等優(yōu)點成為新型納米酶的理想候選材料。H39GFP 是一種綠色熒光蛋白變體,主序列中含有39 個組氨酸殘基。LEI 等[10]基于H39GFP 獨特的多價金屬離子結合特性和Cu2+的電子轉移熒光猝滅效應,研制了一種無標記Cu2+熒光傳感器,可在5 min 內(nèi)快速檢測出Cu2+。以ATCh 為底物,進一步將該H39GFP/Cu2+配合物基傳感器應用于AChE 活性的turn on 熒光檢測。

    2.1.5 硅量子點探針

    SONG 等[11]采用硅量子點(Silicon Quantum Dots,Si-QDs)作為熒光振子,納米氧化鐵作為猝滅劑,測定AChE。在AChE 及其底物ATCh 存在下,F(xiàn)eOOH被酶解物TCh 分解,恢復Si-QDs 的熒光。特別的是,AChE 傳感的靈敏度與FeOOH 的晶體形態(tài)密切相關,采用α 型FeOOH 作為猝滅劑時靈敏度最高。

    2.2 基于turn off的方法

    2.2.1 金納米團簇

    MATHEW 等[12]利用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)包覆金納米團簇開發(fā)了一種高選擇性AChE 熒光檢測探針(AuQC@BSA)。AuQC@BSA 與AChE 結合后形成AuQC@BSA-AChE 復合物,AChE可以將ACh 水解為膽堿,進而與AuQC@BSA-AChE相互作用并猝滅其熒光,最終實現(xiàn)目標物檢測。

    2.2.2 比率熒光探針

    為改善單一熒光信號測定易受探針濃度、檢測儀器和操作誤差以及環(huán)境因素干擾的不足,XU 等[13]研制了一種基于碳點(Carbon Dots,CDs)的比率熒光探針。當體系中的鄰苯二胺(OPD)被Cu2+氧化時,產(chǎn)物可有效猝滅CDs 藍色熒光,并在570 nm 處產(chǎn)生一個新的發(fā)射峰,形成一對比率熒光體系。AChE催化乙酰硫膽堿水解生成硫代膽堿,其巰基可捕獲Cu2+,抑制OPD 氧化,降低了CDs 被猝滅的程度。該探針對AChE 檢測限為0.10 U/L。

    MnO2納米片因比表面積大、生物相容性好、氧化還原性能好、吸收帶寬(300 ~600 nm)、具過氧化物酶樣活性等特點常被應用于熒光檢測體系。YE 等[14]利用石墨烯量子點(Graphene Quantum Dots,GQDs)和OPD,設計了一種高靈敏度、高選擇性檢測AChE的比率熒光探針。GQDs 具有強熒光,由于MnO2納米片的吸收光譜與GQDs 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間有廣泛重疊,GQDs 在450 nm 處的熒光被內(nèi)濾效應有效猝滅。同時,由于MnO2納米片的過氧化物酶樣活性,OPD 被催化氧化為黃色熒光物質(zhì)2,3-二氨基酚嗪(oxOPD),在572 nm 處有一個新的發(fā)射峰,以熒光強度比F450/F572 作為信號輸出,可建立比率熒光法檢測AChE 活性。

    表1 比色法與熒光法的比較

    3 結語

    作為AChE 最常見的兩種含量檢測方法,比色法和熒光法各有優(yōu)勢,一般而言熒光法的檢測限較低,線性范圍較廣,而比色法的操作更簡便,檢測成本更低。盡管如此,現(xiàn)有AChE 檢測方法的靈敏度仍有待提高,選擇性也亟待改善,且大都需要特定檢測設備。如何發(fā)展出高效率低成本的快速檢測方法,仍然是乙酰膽堿酯酶測定方法優(yōu)化的主要方向。

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