耐銻白腐真菌的篩選及其吸附特性的研究

望婷，陳奕凡，王劍橋*

（1.廣東增源檢測技術(shù)有限公司，廣東廣州 511453；2.廣州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

銻（Sb）位于元素周期表中第5 周期VA 族，原子序數(shù)為51，相對原子質(zhì)量為121.75 g/mol，是一種類金屬元素。大氣、水體、土壤和植物體中的銻通過皮膚接觸、呼吸、食物鏈等途徑進(jìn)入生物體內(nèi)累積富集，進(jìn)而對機(jī)體造成毒害作用。銻的毒理性質(zhì)與類金屬砷相似，單質(zhì)比化合物毒性強(qiáng)，無機(jī)銻比有機(jī)銻毒性強(qiáng)，Sb（Ⅲ）化合物毒性是Sb（Ⅴ）化合物的10 倍多[1]。何孟常等在銻對水稻生長影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過高濃度銻處理的水稻植株出現(xiàn)生長矮小，葉片發(fā)黃等明顯發(fā)育不良的癥狀[2]。BRIEGER 等在研究三硫化銻對小鼠的毒性實驗中發(fā)現(xiàn)，三硫化銻會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)心臟退化、體重下降、肺間隙發(fā)炎等癥狀[3]。對于人體，由于銻與蛋白質(zhì)的巰基（-SH）具有很強(qiáng)的親和力，在人體內(nèi)結(jié)合后抑制了某些巰基酶（如琥珀酸氧化酶）的活性，干擾體內(nèi)蛋白質(zhì)及糖類的代謝，損害肝臟、心臟及神經(jīng)系統(tǒng)，還會對黏膜產(chǎn)生刺激作用[4]。銻的急性中毒會導(dǎo)致出現(xiàn)肚子痛、嘔吐、脫水、肌肉痛、抽筋等癥狀，甚至能夠引起肝硬化、肌肉壞死、腎炎和胰腺炎等[5]。由于銻的高毒性和致癌性以及對環(huán)境造成的各種危害，被世界衛(wèi)生組織（WHO）和多個國家列為優(yōu)先控制的污染物，并制定了各類標(biāo)準(zhǔn)，如WHO 對銻的飲用水限制濃度為20 μg/L、美國國家環(huán)境保護(hù)局（USEPA）規(guī)定限量為6 μg/L、德國為5 μg/L、日本為2 μg/L、中國為5 μg/L[6]。

過去數(shù)十年，銻被廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體、聚乙烯苯二酸鹽（PET）、剎車片、彈藥、阻燃劑和醫(yī)藥等行業(yè)，我國是世界上最主要的產(chǎn)銻國，約占世界銻產(chǎn)量的87%[7]。隨著銻礦的大規(guī)模開采以及銻的大量使用，大量銻進(jìn)入到環(huán)境中，湖南錫礦山銻礦北礦區(qū)地下水中的銻最大含量已達(dá)22 980 μg/L[6]，在北極冰心中也檢測到了銻的存在[8]，銻污染修復(fù)成為急需解決的問題。

白腐真菌是一類能使木材呈白色腐朽的絲狀真菌的統(tǒng)稱，在分類學(xué)上主要屬于擔(dān)子菌，少數(shù)為子囊菌，是目前已知的唯一一類能夠?qū)⒛举|(zhì)素完全降解為CO2和H2O 的微生物。已知的白腐真菌有一千多種[9]，包括栓菌屬（Trametes）、平革菌屬（Phanerochaete）、側(cè)耳菌屬（Pleurotus）、香菇屬（Lentinnula）、射脈菌屬（Tremellosus）等，常見品種包括黃孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）、射脈菌（Phlebia radiate）、平菇（Pleurotusostreatus）等。白腐真菌不僅對木質(zhì)素有良好的降解能力，也能降解多種異生型化合物，包括芳香族化合物、多環(huán)芳烴、氯代芳烴、非芳香族的氯化物以及天然的生物高聚物[10]。由于降解底物范圍廣泛，白腐真菌在環(huán)境治理中具有極大的潛力，如污染土壤修復(fù)、造紙工業(yè)廢水處理和生物漂白過程等[11]。

本研究首先從實驗室中存有的菌種中篩選出耐銻的白腐真菌，利用耐銻白腐真菌對銻進(jìn)行吸附，并進(jìn)一步研究其吸附特性，探討白腐真菌對重金屬銻污染修復(fù)的可行性，為防治銻污染的微生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

酒石酸銻鉀（純度≥98%），上海阿達(dá)馬斯試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，美國BD 公司；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），美國BD公司；0.1 mol/L NaOH 溶液（純度≥97%）、0.1 mol/L HCl 溶液（純度≥95%）、2% KBH4（0.5% NaOH 介質(zhì)，純度≥99%）、硫脲（純度≥99%）、抗壞血酸（純度≥99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

GF54DA 高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；TLE104 電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；BSC-1360IIA2 超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BPC-150F 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Coolsafe 110-4L真空冷凍干燥機(jī)，丹麥Scanvac 公司；AFS-9780 原子熒光光譜儀，北京海光儀器有限公司。

白腐真菌為黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）、白囊耙齒菌（Irpexlacteus）、污原毛平革菌（P.sordida）YK-624 菌株，來自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心和中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 白腐真菌篩選試驗

配置濃度為0 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L、3 000 mg/L、4 000 mg/L 和5000 mg/L 的銻溶液，加入PDA 培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌15 min，分裝培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻后分別接種三種白腐真菌，生化培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h 觀察生長情況，測量菌落直徑。

菌落直徑測量方法：首先選取菌落任意位置測量其直徑，然后逆時針旋轉(zhuǎn)60°再次測量其直徑，最后再逆時針旋轉(zhuǎn)60°進(jìn)行第三次測量，取平均值。

1.2.2 白腐真菌P. chrysosporium 的吸附試驗

進(jìn)一步探究白腐真菌在不同條件下對銻的吸附效果，進(jìn)行液體培養(yǎng)基中的吸附實驗。配置PDB 培養(yǎng)基，分裝后121 ℃滅菌15 min，將P.chrysosporium接種到PDA 培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2 d 后，與PDB 培養(yǎng)液一起倒入組織搗碎機(jī)，打碎20 s 后將菌液倒回原來含PDB 的錐形瓶中，將接種后的錐形瓶放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱里，在30 ℃、150 r/min 的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。

（1）銻的初始濃度對吸附效果的影響。配制銻濃度為10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L 的溶液各180 mL，用NaOH 溶液和HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 至5。稱取50 mg 濕重菌體加入配制好的銻溶液中，搖勻后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在30 ℃、150 r/min 的條件下振蕩24 h，取出，每個樣品加入120 mL 超純水稀釋，使用0.22 μm 的微孔濾膜進(jìn)行過濾，保留5 mL 濾液，過濾后的濾膜放入-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍保存，然后放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥，干燥后稱量濾膜上菌體的質(zhì)量并記錄。過濾后每個樣品濾液分別取出0.1 mL 用超純水稀釋到10 mL，將稀釋后的樣品各自取出0.5 mL，分別加入0.5 mL 100 g/L 硫脲、0.5 mL 100 g/L 抗壞血酸和3.5 mL HCl溶液，得到5 mL 待測液，搖勻靜置一段時間，用原子熒光光譜儀測量樣品。

（2）不同吸附時間和pH 對吸附效果的影響。配制銻濃度為50 mg/L 的銻溶液，每組樣品30 mL，分別調(diào)節(jié)pH 至3、5、7。稱取50 mg 濕重菌體于配制好的銻溶液中，搖勻后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中在30 ℃、150 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)，分別于吸附0 h、6 h、12 h、24 h 取樣檢測。

1.2.3 原子熒光光譜測定

配置銻溶液100 μg/L，以鹽酸為載流劑，硼氫化鉀溶液為還原劑，按照儀器使用說明書調(diào)節(jié)儀器至最佳工作條件（負(fù)高壓：300 V；總電流：40 mA；載氣：300 mL/min；屏蔽氣：800 mL/min；原子化器高度：8 mm），預(yù)熱30 min，利用原子熒光光譜儀測定銻的熒光強(qiáng)度。首先設(shè)置儀器標(biāo)準(zhǔn)曲線法，自動獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程IF=163.036C-239.509 4（IF為熒光強(qiáng)度，C為銻濃度；相關(guān)系數(shù)為0.999 97）。再進(jìn)行上述樣品的測定，并減去試料空白溶液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，計算得出銻的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種白腐真菌的耐受性篩選

不同銻濃度條件下P.chrysosporium的生長情況如圖1 所示。與不含銻的對照組比較，銻濃度500 mg/L及以上時，P.chrysosporium的生長速度隨濃度升高而減慢，濃度達(dá)5 000 mg/L 時，其生長速度受到的抑制最明顯。在培養(yǎng)24 h 之后，銻濃度為5 000 mg/L 時的菌落直徑只有3.0 cm，無添加時菌落直徑為3.5 cm。各濃度都在培養(yǎng)36 h 后菌落生長蔓延至整個培養(yǎng)皿。

圖1 P. chrysosporium 在不同銻濃度下的菌落直徑變化

P.sordidaYK-624 的生長狀況如圖2 所示。不同銻濃度影響下，P.sordidaYK-624 的生長速度隨著銻濃度的升高而減慢，高濃度的銻對其生長存在明顯的抑制作用。在培養(yǎng)36 h 之后，銻濃度為5 000 mg/L下的菌落直徑為3.7 cm，在銻無添加時菌落直徑為4.9 cm。各濃度在培養(yǎng)48 h 后菌落生長蔓延至整個培養(yǎng)皿。

圖2 P. sordida YK-624 在不同銻濃度下的菌落直徑變化

在不同濃度的銻影響下，I.lacteus的生長速度隨著銻濃度的升高而減慢，高濃度銻對其生長存在明顯的抑制作用（圖3）。培養(yǎng)60 h 之后，銻濃度為5 000 mg/L 下的菌落直徑只有2.8 cm，無添加時的菌落直徑是4.8 cm。培養(yǎng)72 h 后，不添加銻的菌落生長蔓延至整個培養(yǎng)皿；銻濃度在500 ～3 000 mg/L 時，培養(yǎng)96 h 后菌落生長蔓延至整個培養(yǎng)皿；銻濃度為4 000 mg/L 和5 000 mg/L 時，培養(yǎng)108 h 后菌落生長蔓延至整個培養(yǎng)皿，高濃度的銻對I.lacteus生長抑制非常明顯。

圖3 I. lacteus 在不同銻濃度下的菌落直徑變化

綜上所述，三種白腐真菌中，P.chrysosporium的生長最為迅速，受環(huán)境中銻的影響最小。I.lacteus的生長速度最慢，受環(huán)境中銻的影響也更為明顯。P.chrysosporium的耐受性最強(qiáng)，采用P.chrysosporium作為供試菌，開展白腐真菌對銻吸附特性的研究。

2.2 銻的不同初始濃度對吸附效果的影響

如圖4所示，當(dāng)銻濃度為50 mg/L時，P.chrysosporium對銻吸附量最高，達(dá)89.9 mg/g；銻初始濃度為200 mg/L時次之，為73.0 mg/g；銻初始濃度為10 mg/L 時吸附量最小，僅為6.6 mg/g。李寧杰研究發(fā)現(xiàn)，P.chrysosporium吸附重金屬鉛時，隨著重金屬鉛的初始濃度的增大，其吸附量也隨之增大[12]。本次實驗中銻初始濃度為10 mg/L、100 mg/L、150 mg/L 和200 mg/L 時也呈現(xiàn)出此趨勢。

圖4 不同銻濃度下P. chrysosporium 的吸附情況

2.3 pH 對銻吸附性能的影響

在銻濃度為50 mg/L 的前提下，各pH 條件下的吸附量均隨吸附時間先增加后減少，最佳吸附效果為吸附時間12 h。推測當(dāng)P.chrysosporium暴露在重金屬溶液中時，其細(xì)胞壁先與重金屬溶液接觸，細(xì)胞壁上的各種活性基團(tuán)與重金屬離子形成配位絡(luò)合，該過程反應(yīng)速度較快。隨著吸附量的增加，細(xì)胞壁對重金屬離子的吸附逐漸達(dá)到飽和，重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，該反應(yīng)較慢，歷時較長，這是第二階段重金屬慢速積累的過程[13]。不同pH 條件下對銻的吸附實驗的結(jié)果顯示，P.chrysosporium在pH=3 時吸附效果最佳，吸附量最高可達(dá)291.76 mg/g；pH=5 時效果次之，吸附量最高為267.34 mg/g；pH=7 時吸附效果最差，其最高吸附量為195.91 mg/g（圖5）。

圖5 pH 對P. chrysosporium 吸附銻的影響

3 結(jié)論與討論

面對日益嚴(yán)重的銻污染，如何修復(fù)銻污染成為急需解決的問題。在去除重金屬污染的方法中，生物吸附方法因成本低、吸附量大等優(yōu)點在最近幾年引起了廣泛關(guān)注。本研究旨在探究白腐真菌對重金屬銻污染修復(fù)的可行性，通過耐銻菌株篩選實驗選出其中最耐銻的是黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）；改變銻的初始濃度、吸附時間和pH 分析P.chrysosporium對銻的吸附性能，發(fā)現(xiàn)銻濃度為50 mg/L、pH=3 時吸附效果最好，吸附12 h 后吸附量高達(dá)291.76 mg/g，24 h 后降低至89.9 mg/g。